NOD样受体在免疫耐受中的作用①

章旭之 马 毅

(中山大学附属第一医院器官移植科,广州510080)

NOD样受体在免疫耐受中的作用①

章旭之 马 毅

(中山大学附属第一医院器官移植科,广州510080)

Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)和NOD样受体(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR)为代表的模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRR)在固有免疫等领域发挥着重要作用，其中NLR作为一类胞内模式识别受体在免疫耐受领域也得到越来越多的关注。本文对NLR在免疫耐受领域近年的研究进展作一综述。

1 NLR概况

NLR，即核苷酸结合寡聚结构域受体，是一类广泛存在于固有免疫细胞胞浆内的PRR[1]，由介导配体蛋白的C端亮氨酸富集重复结构域(Leucine-rich repeat domain，LRRs)、具有ATP酶结构域的中心核酸结合结构域(Nucleotide-binding domain，NBD)和结合下游分子的N端结构域组成。目前NLR家族已发现22个成员[2]，其LRRs和NBD基本相同(除NLRP10缺乏LRRs)，但其N端结构域则存在异质性，以此为依据分为5个亚家族：大多数NLR的N端含1～2个胱天蛋白酶激活和募集结构域(Caspase-activation and recruitment domain，CARD)或热蛋白结构域(Pyrin domain，PYD)，前者属NLRC亚家族，包括2种NOD蛋白(Nucleotide binding oligomerization domain protein，NOD)和3种NLRC蛋白；后者属NLRP亚家族，包括14种NLRP蛋白。值得注意的是NLRP蛋白旧称NALP蛋白(Neutrophilic apoptosis LRR pyrin domain protein，NALP)，两种命名法通用。还有少数NLR的N端含杆状病毒凋亡抑制蛋白重复体(Baculovirus inhibitor of apoptosis protein repeat，BIR)，称NAIP蛋白(Neut-rophilic apoptosis inhibitory protein,NAIP)，属NLRB亚家族[3]；N端含线粒体靶向序列的称NLRX蛋白，属NLRX亚家族[4]；而NLRA亚家族的NLRA蛋白，又称Ⅱ型反式激活子(ClassⅡtransactivator,CⅡTAs)，其CARD和NACHT结构域之间还存在一段功能尚不清楚的可被酸性环境激活的结构域称酸性激活结构域(Acidic activation domain,AD)[5]。

NLRC亚家族中，NOD蛋白N端的CARD结构域可结合和激活丝-苏氨酸激酶RIP2，使IκB磷酸化，进而激活转录因子NF-κB，通过NF-κB信号通路和MAPK信号通路介导下游炎性细胞因子的表达[6]；近期有报道称NOD蛋白还可激活胱天蛋白酶和ATG16L蛋白，介导细胞的凋亡(Apoptosis)和自噬(Autophagy)作用[7,8]。根据CARD结构域数目的不同，NOD蛋白可分为NOD1和NOD2，其N端分别含有1个或2个CARD结构域。NOD1蛋白的配体是N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)，与革兰阴性菌细胞壁成分mDAP结构相似[9]；NOD2蛋白的配体则为胞壁酰二肽(NAM-L-Ala-D-Glu，MDP)，在大多数革兰阴性菌和阳性菌的肽聚糖中均存在[10]。而同含有CARD结构域的NLRC蛋白在N端另含一个高度保守的、和凋亡信号传导有关的、被称为死亡结构域(Death domain，DD)的折叠区[11]。值得一提的是，近期发现NLRC5能上调主要组织相容性复合体Ⅰ(Major histocompatibility complex-Ⅰ,MHCⅠ)基因的转录，这在免疫耐受调控领域成为新热点[12]。

NLRP亚家族N端的PYD结构域可激活胱天蛋白酶1(caspase-1)，介导早期反应性细胞因子IL-1β的活化与释放。这个过程通过NLR蛋白炎性体(NLRs protein inflammasome)介导。炎性体由NLR、接头蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)及前体胱天蛋白酶1组成，其中ASC蛋白的PYD结构域和CARD结构域可分别结合与NLRP和pre-caspase-1相同的结构域[13]。当LRRs识别配体后，pre-caspase-1被激活并剪切为成熟的caspase-1，同时促进IL-1β和IL-18的成熟与分泌，激活炎症反应[14]。在NLRP亚家族中，NLRP3有20余种配体，包括ATP、胆固醇结晶、尿酸盐结晶、菌毛蛋白、dsDNA等[15]，受到较多关注。

NLRA、NLRB和NLRX亚家族的报道较少。NLRA亚家族的CⅡTAs主要通过上调MHCⅡ类分子的表达，调节适应性免疫应答[16]。NLRB亚家族的NAIP是一类凋亡抑制蛋白，能够阻止细胞凋亡[17]。而NLRX亚家族的NLRX则可增强线粒体活性，产生更多活性氧和自由基发挥抗感染功能[18]。

2 免疫耐受

免疫耐受(Immune tolerance)是免疫系统在抗原刺激下不能激活，从而不能执行免疫应答的现象。按形成机制，可分为中枢耐受(Central tolerance)和外周耐受(Peripheral tolerance)，前者指未成熟淋巴细胞在中枢免疫器官遭遇自身抗原形成的耐受，后者指成熟淋巴细胞在外周免疫器官接触内外源性抗原形成的耐受[19]。目前认为中枢耐受是由于在中枢免疫器官中，未成熟淋巴细胞经过阴性选择(Negative selection)，表面MHC分子与接触的自身抗原发生高亲和力结合者均被克隆清除(Deletion)所致[20]。而外周耐受的机制则存在多种理论，包括克隆清除、免疫忽视(Immunological ignorance)、克隆失能、免疫调节、信号转导障碍、免疫隔离(Immunological privileged)、免疫抑制等，目前认为其形成是多种因素调节免疫网络的共同作用结果[21]。同时，外周耐受的形成与抗原和机体因素密切相关，其中抗原因素包括剂量、性状、接触途径、存在时间、表位特点及表位变异等，而机体因素则包括遗传背景和发育年龄(越接近胚胎期越易形成耐受)[22]。免疫耐受的失调会造成多种疾病，如耐受状态的破坏会导致移植物排斥、自身免疫性疾病及超敏反应，而慢性感染持续状态及免疫逃避的肿瘤细胞均和耐受状态的形成有关[23]。因此，对免疫耐受的研究具有积极的临床意义。

3 NLR与免疫耐受

目前针对NLR与免疫耐受领域的研究主要集中于NLRC亚家族的NOD蛋白和NLRP亚家族的NLRP3蛋白，而NLRA亚家族的CⅡTAs和NLRC亚家族的NLRC蛋白近期亦有研究所涉及。

3.1NOD和免疫耐受 现关于NOD蛋白和免疫耐受的报道多集中于自身免疫性疾病和超敏反应，包括2型糖尿病、哮喘及克罗恩病(Crohn′s disease,CD)等。2型糖尿病的胰岛素抵抗被认为与自身免疫因素有关。Shiny等[24]发现2型糖尿病患者体内i-EDAP和MDP表达显著升高；体外实验显示NOD1和NOD2蛋白能通过RIPK2和NF-κB等促炎信号增加TNF-α和IL-6的释放，促进单核细胞表达活化标记物CD11b和CD36，而活化单核细胞水平则与胰岛素抵抗的程度呈正相关。可见单核细胞中的NOD蛋白介导的炎症反应可破坏机体耐受状态，与2型糖尿病的胰岛素抵抗相关。气道对过敏原耐受程度低是造成哮喘等呼吸道超敏反应性疾病的原因。Duan等[25]发现，胸腺基质淋巴细胞中的NOD2蛋白识别PAMP后， IL-25分泌增加，并表达T细胞共刺激配体OX40，促进Th1细胞的分化，激活适应性免疫，破坏气道耐受环境。

而NOD蛋白在CD中的作用则比较复杂。CD是一种自身免疫性肠病，与黏膜免疫失调有关，而NOD2蛋白的慢性刺激则介导肠道黏膜对肠道菌群耐受性诱导和维持[26]。Strober等[27]发现，CD患者NOD2基因多表现为多态性，其功能缺失导致小肠黏膜潘氏细胞分泌α防御素减少，造成肠道菌群失调，激活适应性应答，破坏黏膜耐受状态；而功能正常的NOD2蛋白则可防止肠道过度炎症反应的发生。但是肠道菌群的作用及调节机制迄今尚未明晰，故NOD2在CD中的作用并非绝对，如Kim等[28]发现，志贺杆菌PGN(Shigella flexneri PGN,flexPGN)正是通过NOD2途径激活NF-κB诱导CD的发生，而使用能够抑制免疫应答的植物乳杆菌脂磷壁酸(Lactobacillus plantarum lipoteichoic acid,pLTA)处理单核细胞系THP-1细胞，结果NOD2在转录和翻译水平表达均显著下降。可见，关于NOD蛋白在肠道黏膜免疫耐受状态中的作用，需根据机制具体分析，如Cantó等[29]认为CD的发生与NOD2通路和TLR4通路平衡的破坏有关，任意一方的过度活化均会破坏耐受状态，此为CD发生的危险因素。

3.2NLRP3和免疫耐受 NLRP蛋白主要通过形成炎性体发挥作用，目前关注最多的是NLPR3与胰岛素耐受及中枢神经系统自身免疫性疾病的关系。肥胖患者易发生糖耐量异常和胰岛素抵抗，这被认为与过量脂肪导致的轻微炎症反应破坏免疫耐受的内环境有关。Healy等[30]发现NLRP3炎性体能促进释放IL-1β诱导胰岛素耐受，而在高脂喂养小鼠中使用酪蛋白水解物(Casein hydrolysate,CH)降低caspase-1蛋白活性后，IL-1β表达降低，AkT磷酸化水平升高，小鼠对胰岛素的敏感性提高。类似的，Mocanu等[31]发现肥胖大鼠空肠-Roux-en-Y胃旁路手术后90 d脂肪组织中NLPR3、caspase-1、ASC等炎性体成分及IL-1β、IL-6、IL-18、MCP-1等炎性因子表达均显著降低，同时血糖控制情况良好，胰岛素抵抗减轻。Chi等[32]在胰岛素抵抗的烧伤大鼠模型中及Vandanmagsar等[33]在对人类患者的临床研究中也发现了相同的结论。

多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一类自身免疫性中枢神经系统脱髓鞘疾病，与免疫耐受的破坏关系密切。Inoue等[34]发现NLRP3能通过促进IL-1β的分泌诱导中枢神经系统内适应性免疫细胞的聚集，而在NLRP3敲除小鼠上建立的实验性变应性脑炎(Experimental allergic encephalitis,EAE)模型中脱髓鞘现象减轻，Th1和Th17细胞的比例均减少，可见NLRP3对免疫耐受的破坏与MS的发生发展相关。

3.3CⅡTAs和免疫耐受 CⅡTAs可以特异性上调MHCⅡ类分子的表达，在移植免疫耐受领域得到更多关注。Liu等[35]在大鼠肝移植模型中沉默受体CⅡTAs，发现IL-2等炎症细胞因子和MHC-Ⅱ类分子表达显著下降，移植肝的存活时间更长，提示移植耐受的形成。而Yang等[36]在体外实验中发现，突变的Ⅱ型反式激活子(mutants of classⅡtransactivator,mCⅡTAs)能促进IL-33等细胞因子的释放，诱导Th2细胞的分化，使Th2/Th1比例升高，增加IL-4、IL-10等炎症抑制因子的表达，抑制Th1细胞功能，有利于移植耐受的诱导和维持。可见抑制CⅡTAs表达有利于移植耐受的形成，但此类研究甚少，仍需更多的实验数据支持。

3.4NLRC和免疫耐受 目前认为NLRC蛋白在抗感染免疫和移植免疫中有一定意义。绿脓杆菌可分泌几丁质3样1(Chitinase 3-Like 1,Chi3L1)诱导免疫耐受，限制宿主的炎症反应，故导致的医院获得性肺炎死亡率很高。Marion等[37]发现，Chil1可与宿主的IL-13受体结合，抑制NLRC4活性，阻止炎症反应的产生，形成免疫耐受；而敲除Chil1后，IL-1β和TNF-α表达显著升高，细菌在宿主中的免疫耐受状态被破坏。可见破坏病原体在宿主中的耐受状态是防止病原体感染加重或慢性化的方法之一。而Ludigs等[38]发现，处于免疫耐受状态的NLRC5缺陷小鼠和MHCⅠ缺陷小鼠的自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK cells)表面的可清除活化T淋巴细胞的抑制性受体均增多，提示NLRC5可能通过增加T细胞表面MHCⅠ类分子表达，保护其免遭NK细胞清除。故抑制NLRC5表达或阻断其信号通路，可激活机体免疫调节系统，阻止免疫应答的增强，进而维持免疫耐受状态。

4 小结与展望

NLR蛋白家族在固有免疫领域发挥重要作用，其可识别PAMP，激活免疫系统，破坏免疫耐受状态；而设法抑制NLR的功能则有利于免疫耐受状态的形成。利用NLR这一特点，我们可以诱导或破坏免疫耐受状态，以纠正移植排斥、超敏反应、自身免疫性疾病、感染或肿瘤免疫逃逸等临床问题。但是，关于NLR对免疫耐受的影响，其研究尚处于细胞、动物实验阶段，尚未有临床应用探索；且其机制仍未完全明晰，故仍须更深入的研究。

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[收稿2016-10-09]

(编辑 倪 鹏)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.026

①本文为国家自然科学基金面上项目(81370574、81670591)和广东省自然科学基金重点项目(2016A030311028)。

章旭之(1992年-)，男，在读硕士，主要从事移植免疫方面的研究，E-mail：zhxuzh@foxmail.com。

及指导教师：马 毅(1968年-)，男，医学博士，教授，主任医师，主要从事移植免疫的研究，E-mail：anhuimayi2002@163.com。

R392

A

1000-484X(2017)06-0930-04