多学科甲胎蛋白异质体临床应用专家共识
2017-01-16上海市医学会分子诊断专科分会上海市临床检验中心上海东方肝胆外科医院中华医学会检验医学分会临床免疫学组中国中西医结合检验学会肝病学术委员会全军肝胆外科专业委员会上海免疫学会肿瘤免疫分会上海抗癌协会肿瘤标志物分会
上海市医学会分子诊断专科分会；上海市临床检验中心；上海东方肝胆外科医院；中华医学会检验医学分会临床免疫学组；中国中西医结合检验学会肝病学术委员会；全军肝胆外科专业委员会；上海免疫学会肿瘤免疫分会；上海抗癌协会肿瘤标志物分会
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多学科甲胎蛋白异质体临床应用专家共识
上海市医学会分子诊断专科分会；上海市临床检验中心；上海东方肝胆外科医院；中华医学会检验医学分会临床免疫学组；中国中西医结合检验学会肝病学术委员会；全军肝胆外科专业委员会；上海免疫学会肿瘤免疫分会；上海抗癌协会肿瘤标志物分会
甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)是目前临床应用最广泛的肝癌辅助诊断血清标志物。AFP诊断肝癌的敏感性约为60%～70%。但在肝脏良性疾病，特别是肝癌高危人群，如慢性肝炎、肝硬化中也有部分患者会出现AFP升高。妇女孕期及某些生殖系统疾病AFP也会升高[1]。
AFP是一种单链糖蛋白，根据其与小扁豆凝集素(Lens culinaris agglutinin，LCA)的亲和力从低到高依次分为AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3。AFP-L1主要见于良性肝病，AFP-L2主要由卵黄囊产生并多见于孕妇，而AFP-L3主要来源于肝癌细胞，也被称为甲胎蛋白异质体。
中国、日本及亚太肝癌诊疗指南中均将AFP作为肝癌的监测指标。日本肝病学会(Japan Society of Hepatology，JSH)制定的肝癌诊疗指南中建议将AFP、AFP-L3和异常凝血酶原[即脱γ羧基凝血酶原(Des gamma carboxy prothrombin，DCP)，又称维生素K缺乏或拮抗剂Ⅱ诱导的蛋白质(Protein induced by vitamin K absence or antagonist Ⅱ，PIVKA Ⅱ)]同时作为肝癌筛查的标志物，并建议高危人群每6个月做一次超声检查及AFP/AFP-L3/DCP检测以筛查肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)，超高危人群及预后随访则建议每3～4个月进行一次AFP/AFP-L3/DCP及影像学检查[2]。我国原发性肝癌诊疗规范(2011年版)中指出：血清AFP及其异质体是诊断肝癌的重要指标和特异性最强的肿瘤标志物，国内常用于肝癌的普查、早期诊断、术后疗效监测和随访，且有助于鉴别肿瘤的来源[1]。尽管美国肝病学会(American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD)并未将血液标志物纳入临床肝癌诊疗指南，但美国食品与药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)已于2005年批准AFP-L3检测试剂和方法应用于临床肝癌预警。
目前检测AFP-L3的方法主要有：亲和免疫交叉电泳、亲和免疫印迹、凝集素酶联免疫吸附试验(lectin-enzyme-linked immunosorbent assay，lectin-ELISA)、亲和吸附离心法(凝集素捕获微量离心柱法)、微流控免疫荧光检测法等。亲和免疫交叉电泳、亲和免疫印迹法由于操作繁琐，迄今未在临床广泛使用，lectin-ELISA由于检测敏感性和重复性仍需进一步优化，目前大多用于科学研究。亲和吸附离心法(凝集素捕获微量离心柱法)是最早获得国家食品药品监督管理总局(China Food and Drug Administration，CFDA)批准在临床上使用的AFP-L3检测试剂盒，也是现阶段国内使用最广泛的方法。日本Wako公司的全自动微流控免疫荧光法于2016年9月在国内上市，目前已在逐步推广阶段。国产的全自动检测方法也正在向CFDA申报注册。
临床应用现状及近期上海市临床检验中心组织的质量调查等均提示，AFP-L3临床应用适应证、应用价值、结果报告及解读、操作标准化等存在不少问题，同时检测方法学的局限及不正确应用等又在一定程度上限制了AFP-L3的临床认知、使用和客观评价。
《多学科甲胎蛋白异质体临床应用专家共识》针对甲胎异质体检测的适用人群及临床意义、关键检测流程、检测结果报告形式及释义等，在多学科临床和实验室专家充分讨论的基础上形成以下共识。
1 AFP-L3的适用人群
原发性肝癌(Primary liver cancer，PLC)在全球常见恶性肿瘤中居第5位，在肿瘤患者的致死率中高居第3位。全球每年约有500 000例肝癌新发病例，其中约50%发生在我国，且多与乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染相关。慢性肝病，如肝纤维化、肝硬化患者均是PLC发病的高危人群，特别是慢性乙型肝炎患者和慢性丙型肝炎患者，其PLC发病率相对危险度远高于非感染者。慢性乙型肝炎患者5年有8%～20%的概率发生肝硬化。肝硬化患者中每年有约20%的概率发生肝功能失代偿，1%～5%的概率发生PLC[3,4]。而慢性丙型肝炎患者20年发生肝硬化的危险度为15%～30%，这些肝硬化患者每年发生PLC的概率约为2%～4%[5,6]。
AFP-L3检测对肝癌影像学及病理学诊断具有重要补充价值，有助于提早发现肿瘤或肿瘤的复发、转移，提高预测和诊断的准确性，从而有助于提高疗效，改善预后[7-10]。
建议1：AFP-L3检测适用于慢性肝病、肝纤维化、肝硬化等高危人群及肝癌患者病程、疗效等的动态监测。
2 AFP-L3的临床意义
AFP-L3在PLC的辅助预测、诊断、疗效评估、预后判断及复发监测中均有重要应用价值。因此，对PLC的高危人群(慢性乙型肝炎患者、慢性丙型肝炎患者、肝纤维化患者、肝硬化患者等)、肝癌疑似患者(特别是AFP持续弱阳性或AFP不升高时)、肝癌患者及肝癌患者治疗后均推荐进行AFP-L3检测，可及时辅助病情判断，有助于改善患者预后。
2.1AFP-L3对于低水平AFP人群的检测意义 由于AFP-L3升高与肝癌密切相关，且不受总AFP水平的影响，因此检测AFP-L3占总AFP水平的百分比(AFP-L3%)是AFP低浓度持续阳性患者及小肝癌AFP尚未明显升高时早期预报肝癌发生的重要指标。随访研究显示AFP-L3%能比影像学提前3～28个月发现肝癌，在AFP不升高的情况下，有34.3%的原发性HCC患者在确诊1年前出现AFP-L3%升高[11]。以10%为AFP-L3%临界值时，其对直径<5 cm的HCC的检测敏感性为22%～33%，特异性为93%～94%[12]；对AFP阴性(<20 ng/ml)的PLC检测敏感性为12%～21%，特异性为97%～98%[13,14]。AFP-L3与DCP联合检测可提高早期PLC的诊断敏感性至78%～89%，提高特异性至41%～86%[15-17]。
上海东方肝胆外科医院单中心数据分析表明，AFP-L3%在AFP 10～20 ng/ml的PLC 中的阳性检出率为16.67%～39.60%，表明AFP阴性者仍有部分患者可通过AFP-L3%被检出。
建议2：对于低水平AFP人群，AFP-L3可辅助预测、诊断PLC。
2.2AFP-L3的鉴别诊断价值 由于AFP升高可见于PLC及非肿瘤性肝病，因此检测AFP-L3则有助于肝癌与其他良性肝病，如肝硬化、慢性肝炎等的鉴别诊断。以AFP-L3%≥10%为阳性临界值，肝癌组阳性率为70%，明显高于良性肝病(慢性乙型肝炎、肝硬化、肝脏良性肿瘤)组(11.1%)[18]。有研究显示，肝癌组、肝硬化组及慢性肝炎组AFP-L3%的阳性率分别为74.7%、29.8%及18.8%[19]。另外，PLC组AFP-L3和AFP-L3%均明显高于良性肝病组[20]。上海东方肝胆外科医院近万例肝癌患者总体AFP-L3%阳性率为47.1%，AFP阳性肝癌患者AFP-L3%的阳性率为73.8%，而良性肝病中AFP-L3%的阳性率为3.3%～23.5%[21]。
建议3：AFP-L3有助于良、恶性肝病的鉴别诊断。
2.3AFP-L3检测在PLC随访中的应用意义 血清AFP-L3%高水平往往和肿瘤倍增时间短、高侵袭性和预后较差相关[22,23]。伴有低水平AFP但AFP-L3%阳性的恶性肝癌患者，其临床病理学特征上常常表现为分化更低且预后更差[24]。AFP-L3检测还可作为肝癌复发及预测肝癌预后的指标[25-28]。在肝癌根治术后，当AFP转阴时，AFP-L3%随之降低；但若AFP-L3%变化不明显，则提示有残瘤或转移灶存在；研究表明，AFP-L3% >5%的肝癌患者的复发率远远高于AFP-L3% <5%的患者[29]。
建议4：AFP-L3可作为独立标志物监测PLC的预后及复发。
2.4AFP-L3与PLC病因学的相关性 我国80%以上的PLC与HBV感染有关[30]。上海东方肝胆外科医院单中心近5年万余例的临床数据统计分析显示，病理明确诊断为PLC的患者其乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)阳性率达85%以上。丙型肝炎感染标志物阳性则不足5%。进一步分析显示，HBV感染相关PLC患者AFP及AFP-L3%阳性率分别为62%、45%，明显高于非HBV感染相关PLC患者(40%、28%)，表明有HBV感染背景的PLC患者具有更高的AFP水平及AFP-L3%阳性率，同时提示AFP及AFP-L3%也更适合于HBV感染人群的筛查和辅诊、随访。
建议5：具有HBV感染背景的PLC具有更高的AFP水平及AFP-L3%阳性率。
2.5AFP-L3%阳性率与PLC组织类型的相关性 PLC包括HCC、原发性肝内胆管细胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)以及两者的混合型。有研究显示，PLC中约有90%为HCC[1,31]。东方肝胆外科医院近万例PLC回顾分析表明，HCC、ICC和混合型比例分别为88.8%、9.4%和1.8%。HCC患者AFP和AFP-L3%阳性率分别为60%、41%，明显高于ICC(11%、14%)。ICC患者血清AFP-L3%阳性往往提示伴HCC，可与单纯血清CA19-9阳性的ICC进行鉴别[32]。
建议6：HCC较ICC具有更高的AFP-L3%阳性率。
2.6AFP-L3 与AFP水平的相关性 AFP-L3%阳性率与AFP水平密切相关。上海东方肝胆外科医院单中心研究显示AFP-L3阳性率与AFP水平呈正相关。10 ng/ml≤AFP≤20 ng/ml、20 ng/ml
建议7：AFP-L3%阳性率与AFP水平呈正相关。
3 AFP-L3 检测的实验室基本质量要求
3.1AFP-L3检测的一般实验室要求 与开展的其他临床免疫学检测项目的实验室要求相同。
建议8：开展AFP-L3检测的实验室应具有开展临床免疫学定量检测资质并符合国家或上海市(或其他地区)质量督查的相关要求，包括但不限于参加室内、室间质量评价并成绩合格。
3.2检测方法及主要原理
3.2.1亲和吸附离心法 亲和吸附离心法(凝集素捕获微量离心柱法)是最早获得CFDA批准在临床上使用的AFP-L3检测方法，也是目前国内使用最广泛的方法，主要原理：亲和吸附离心管中预装有亲和介质，标本中的AFP-L3与离心管内的亲和介质相结合，经过清洗和离心洗脱获得处理后标本，以(电)化学发光法检测处理前标本和处理后标本，通过计算可以获得检测标本中AFP-L3占总AFP的比例。优点是对于具有定量检测AFP的实验室，不需要特殊设备，缺点是需要手工操作，步骤多、耗时、重复性欠佳。
3.2.2微流控免疫荧光法 日本Wako公司的微流控免疫荧光法于2016年9月在国内上市，检测体系基于微流控检测技术并采用了抗AFP不同抗原表位的荧光标记抗人AFP抗体[荧光-Fab′(AFP)]、阴离子结合抗人AFP抗体[DNA-Fab′(AFP)]及LCA。优点是实现了自动化检测，国外虽已有大量临床研究论文发表[33，34]，但现阶段国内尚缺乏大量临床应用经验和数据。
建议9：依据实验室条件，推荐使用亲和吸附离心法(凝集素捕获微量离心柱法)或微流控免疫荧光法。
3.3AFP-L3的检测要求
3.3.1标本的类型、保存及干扰因素 标本应及时检测，若不能当日检测，应及时分离血清或血浆，在2～8℃保存一般不超过7 d。超过7 d，应置于-20℃以下冷冻保存。需要保存6个月及以上时，应置于-80℃以下保存，并避免反复冻融。亲和吸附离心法检测的干扰因素可参考所采用的AFP定量检测方法，以电化学发光为例，通常严重黄疸[胆红素>1 112 μmol/L(65 mg/dl)]、溶血[血红蛋白>1.4 mmol/L(22.5 g/L)]、脂血(脂肪乳剂>1 500 mg/dl)以及生物素>60 ng/ml(246 nmol/l)、类风湿因子>1 500 U/ml对检测结果可能存在干扰；采用微流控免疫荧光法时，黄疸[胆红素>650 μmol/L(38 mg/dl)]、溶血[血红蛋白>0.6 mmol/L(9.88 g/L)]、维生素C>0.5 g/L对检测结果可能存在干扰。
建议10：标本类型依据不同检测方法要求，可采用血清或者血浆(亲和吸附离心法可采用血清或血浆，微流控免疫荧光法推荐采用血清)。并注意结合采用的方法学，排除严重黄疸、溶血、脂血等对检测结果可能存在干扰的影响因素。
3.3.2标本的预处理 (1)亲和吸附离心法：以采用电化学发光定量检测AFP为例。总AFP水平为10～3 000 ng/ml的标本，需对标本进行1∶2.5 倍稀释(推荐400 μl血清加入600 μl清洗液)，按照操作要求进行LCA亲和柱层析。总AFP水平为3 000～121 000 ng/ml时，标本需1∶100倍稀释，推荐10 μl血清加入990 μl清洗液。当总AFP>121 000 ng/ml时，推荐标本分两次进行1∶1 000倍稀释，即先1∶100倍稀释(10 μl血清加入990 μl清洗液)，再1∶10倍稀释(100 μl稀释后标本加入900 μl清洗液)。总AFP<10 ng/ml的标本受检测灵敏度限制，不适用亲和吸附离心法定量检测AFP-L3。结果报告形式参见“4.2定量(AFP-L3%)”。(2)微流控免疫荧光法：总AFP水平在仪器检测范围(0.3～2 000.0 ng/ml)内时，不需要进行标本预处理，可一次性全自动完成AFP定量及AFP-L3%检测；当总AFP>2 000 ng/ml时，仪器通常会报警，此时应按照仪器提示对标本进行手工稀释，“H”为2～10倍稀释(推荐100 μl血清加入100 μl稀释液)，“H!”为10倍稀释(推荐20 μl血清加入180 μl稀释液)，“HH!”为100倍稀释(推荐采用5 μl血清加入495 μl 稀释液)。
建议11：依据不同方法学进行标本前处理。采用亲和吸附离心法检测时依据AFP检测系统的上限及总AFP水平进行不同倍数的稀释。采用微流控免疫荧光法检测时是否稀释及如何稀释依据仪器提示实施。
4 AFP-L3 结果的计算和报告形式
采用亲和吸附离心法时，柱层析后标本AFP浓度乘稀释倍数即为AFP-L3浓度。AFP-L3%需要手工计算，推荐事先在实验室信息系统(Laboratory information system，LIS)中设定好以方便自动输出。采用自动预设模式时，应特别注意稀释倍数是否有变化。AFP-L3%的计算见以下公式1。
采用微流控免疫荧光法时由仪器直接输出结果，计算见以下公式2。若AFP水平过高，需要手工稀释时，需在仪器上输入稀释倍数，随后仪器自动给出计算结果。
4.1定性
4.1.1阴性 提示AFP-L3%<10%。
4.1.2阳性 提示AFP-L3%≥10%。
4.1.3未检出 不同方法对于未检出的释义存在一定差异。
4.1.3.1亲和吸附离心法 总AFP<10 ng/ml或虽然总AFP≥10 ng/ml，但AFP-L3检测值低于检测下限。
4.1.3.2微流控免疫荧光法：总AFP≥0.3ng/ml时，AFP-L3检测值低于检测下限或待测标本存在L2峰；总AFP<0.3 ng/ml，未到仪器测定下限，报告“未检出”。
4.2定量(AFP-L3%) 采用亲和吸附离心法时参考公式1进行计算得到定量结果，计算时注意乘稀释倍数。
微流控免疫荧光法仪器直接输出结果，如果仪器出现报警时，应按仪器提示判断结果，必要时需要手工对标本进行稀释后再上机检测，具体稀释方法参见“3.3.2标本的预处理”。
建议12：无论是采用亲和吸附离心法还是微流控免疫荧光法，AFP-L3检测结果的报告均应包括定性与定量两种形式。计算AFP-L3%时勿忘乘以标本预处理时的稀释倍数。定性推荐临界值(Cut-off值)为10%，实验室及临床也可依据项目使用目的自行制定Cut-off值。注意检测结果为“未检出”和“阴性”之间的差别。
《多学科甲胎蛋白异质体临床应用专家共识》
专家组成员
临床专家：
吴孟超 叶胜龙 沈 锋 陆伦根 邱双健 万旭英
实验室专家(按姓氏笔画排序)：
王兰兰 王华梁 仲人前 关 明 刘善荣 孙奋勇 朱宇清 吴文娟 张 健 李 敏 杨曦明 肖艳群 陈 瑜 陈福祥 周 琳 欧启水 娄加陶 郭 林 郭 玮 高春芳 傅启华
执笔人：
高春芳 房 萌 季 君
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转载自《检验医学》2017年第32卷第5期
