分子遗传标记技术及其在动物育种中的研究进展

宋志芳，于国生，，解佑志，芦春莲，2，曹洪战，2*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北 保定 071000；2.河北农业大学猪业科学研究所，河北 保定 071000）

分子遗传标记技术及其在动物育种中的研究进展

宋志芳1，于国生1，，解佑志1，芦春莲1，2，曹洪战1，2*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北 保定 071000；2.河北农业大学猪业科学研究所，河北 保定 071000）

遗传标记经历了从传统的标记即形态学标记、细胞学标记、生物化学标记到现代分子标记的发展，分子标记具有很多优势，也促进了动植物育种、人类医学、基因定位以及构建遗传图谱的改革。遗传标记能应用于畜禽的遗传多样性分析、种质资源的鉴定、亲缘关系的研究、遗传图谱的构建、分子标记辅助选择和QTL定位等领域，文章主要综述了分子标记在标记辅助选择的应用。

标记辅助选择；分子育种；分子标记

1 分子标记

分子标记作为一种遗传标记，以个体间核苷酸序列的变异为基础，能够直接反映出DNA水平的遗传多态性，有广义分子标记和狭义分子标记之分。广义的分子标记一般指DNA序列或蛋白质，能够遗传且可检测；狭义的分子标记一般指特异性DNA片段，能够反映生物个体或种群间基因组中的差异。理想的分子标记必须达到以下几个要求：具有高多态性；共显性遗传（即利用分子标记可鉴别二倍体中的基因型）；能明确辨别等位基因；遍布整个基因组；要求分子标记在整个基因组中分布均匀；即无基因多效性；检测手段简单、快速；成本低；重复性好。但是在实际实验过程中，分子标记很难达到理想状态。随着生物技术的发展，目前已经出现了种类不同的分子标记，比如限制性片段长度多态性、小卫星序列、微卫星序列或简单重复序列、随机扩增多态性DNA、扩增片段长度多态性、特定序列位点、DNA单链构象多态性、单核苷酸多态性以及脉冲场电泳等。在实际应用中，能根据研究目的而定向选择。分子标记在多领域都有应用，其中在标记辅助选择（MAS）上的应用推动了育种工作的发展。

2 分子标记技术在MAS的应用

2.1 标记辅助选择的概念

利用与数量性状相关的分子标记，以标记信息为辅助信息，可以从分子水平准确快速地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的选择。此外，能够充分利用遗传标记、系谱和表型信息，与常规育种方法相比，信息量更丰富、选择准确性更高。利用MAS法能够寻找分子遗传标记和进行MAS育种。在动物育种中，利用标记基因型能非常准确地估计数量性状的育种值。MAS可以先对遗传标记进行选择，然后对控制某性状的QTL进行间接选择，最终达到对该性状进行选择的目标；或者通过遗传标记来预测个体基因型值或育种值。

2.2 寻找分子遗传标记的主要方法

2.2.1 候选基因法

候选基因法分析的基本原理是先假设所选标记或基因本身就是影响性状的主基因，根据已知的生理、生化背景知识，直接从已知或潜在的基因系统中找到可能作用于该性状的候选基因，也可以参考比较医学、比较基因组学等的研究结果，将其他物种（如人类、小鼠等）中发现的控制某些同类或相似性状的基因作为动物经济性状的候选基因，然后检测该基因是否是控制动物性状的候选基因。采用候选基因法寻找分子遗传标记时必须遵循设计候选基因的引物，扩增基因的特定片段，寻找多态位点等特定的研究步骤。我国经常使用候选基因法进行研究，因为该方法选择多态位点较简单易行、方法步骤操作不繁琐、统计检验效率高、成本少、结果便于应用等优点，成为基因组分析的首选方法。

2.2.2 基因组扫描法

基因组扫描是先在全基因组范围内寻找遗传标记，且该遗传标记与目标性状或基因紧密连锁，然后根据寻找的标记在染色体上定位相关基因。通常先进行全基因组扫描将性状相关位点定位于染色体的某个区域，然后再进行候选基因策略或连锁不平衡分析，确定有关基因位点。得到定位结果需要进行遗传分析，一般来说定位的区域比微卫星定位要小很多。

3 影响标记辅助选择效果的因素

与常规育种方法相比，标记辅助选择的选择效果较好，但是研究结果不一致，可能与影响标记辅助选择效率的因素有关，总结如下：

3.1 遗传标记与数量性状位点（QTL）的连锁关系

遗传标记与QTL或目的基因连锁的越紧密，MAS的选择效率就越高[1-3]。如果标记与QTL连锁不紧密，也就是两者之间距离变大时，发生重组的可能性增大，造成的结果是降低了选择效率。Smith等[4]指出重组是将标记与QTL连锁关系用于选择的最大障碍，重组会导致连锁不平衡的降低，从而降低标记辅助选择的作用，标记辅助选择所取得的遗传进展会随着发生重组概率的增加而降低。

3.2 QTL的数目和效应

某一数量性状由多个基因共同作用，目前已经检测出了大量与数量性状相关的QTL，比如已经检测出了1万多与猪性状关联的QTL，包括生长性状、繁殖性状、胴体性状、疾病等，关于这些性状的QTL数量不一。如果控制某一数量性状的QTL数量较多时且效应较大时，应用标记辅助选择进行育种能取得很好的效果。但是如果QTL的效应比较小时，标记辅助选择就没有应用价值，达不到预期的目标。也有研究表明QTL的数量太多时，QTL之间的连锁程度增加，同时增加了计算的复杂性，会影响MAS的选择效率。也有研究表明随着QTL遗传方差的增大，取得的遗传进展越高[5]。

3.3 估计QTL效应的准确性

提高QTL估计的准确性是影响MAS选择效果的一个关键因素，估计值过高或过低都会影响选择结果。如果估计QTL效应值的结果不准确或错误，也会影响遗传进展的改良[6]。所以在估计QTL的育种值时，一定要采取合理、科学的方法进行估计，避免错上加错。

3.4 相关性状的遗传特性

与高遗传力性状和早期表达的性状相比，采用MAS法对低遗传力性状、限性性状和抗病性状进行选择得到的效果要好，但是这并不能说明性状的遗传力越低，选择的效率越高。因为如果遗传力很低时，会影响标记被检测出的几率和标记与QTL的连锁效应，最后降低了MAS的选择反应。中等遗传力的性状可以使用MAS法进行选择[7-9]。

3.5 群体规模

群体规模也是影响MAS效率的一个重要原因。一般情况下，随着群体规模的增加，MAS取得的效果越好。但是如果群体规模太大，也会增加实际选择的复杂程度，影响选择的结果。因此，要选择合适的群体规模，既能达到理想的选择效果，又能避免给工作带来困难。

3.6 选择的世代数

MAS选择的效率不会随着选择世代数的增加而保持不变，相反，选择世代数的增加会降低选择效率。原因是长期的连续选择降低了标记与QTL之间的连锁不平衡。

4 分子标记技术的应用

4.1 构建基因图谱并进行基因定位

基因图谱是指鉴定控制生物某性状的基因，并测定它在染色体上的特定位置，然后用图示的方式把它表示出来。构建基因的遗传图谱和物理图谱是为了可以对基因有详细地了解和掌握，尤其是某性状的有利基因，有助于遗传育种工作的进行。构建基因图谱的意义在于了解控制生产性能、繁殖性状、抗应激等性状的基因结构与功能，采用标记辅助选择或基因型选择法改良目标群体，研究不同动物种间基因组型及进化关系等。目前，利用DNA分子标记技术已经构建了一些动物的基因图谱，这些图谱对动物资源的保护和开发利用提供了重要的基础资料。连锁群中遗传标记的数量、均匀度和杂合度决定了遗传图谱的质量。目前人们在不断地寻求新的遗传标记进行基因图谱的研究，以提高遗传图谱的饱和度，为动物育种标记辅助选择提供丰富的基因图谱资料。

4.2 群体遗传结构与遗传距离的分析

通过微卫星多态性的标记可以反映出物种的进化过程，在1个生物群体中，频率最高的等位基因是该物种中最原始、保守的基因，其余的等位基因是由该等位基因在物种的进化过程中突变而形成的。导致遗传差异的直接原因在于不同物种在同一个微卫星位点等位基因数目和频率的差异，可作为区分品种类型的依据。

4.3 杂种优势的预测

在生物学上，杂种优势是指杂交子代的生长活力、育性和种子产量等方面都比交配双亲好的现象。利用杂种优势能挖掘种质资源的内在潜力和更深层次地对种质资源进行开发利用，已经培育出了许多具有优良生产性能的多品种畜禽。可以用DNA多态性测定品种或品系间的差异，然后计算遗传距离，显示其他指标的测定结果稳定，所以用分子标记方法预测动物的杂种优势也更加准确。尽管前人在杂种优势预测方面开展了大量研究工作[10-19]，但是目前的文献中有利用杂种优势预测育成杂交种的报道，杂种优势预测离育种实践尚有相当距离。

4.4 性别鉴定

为了更大程度地增加畜牧业生产的经济利益，防止连锁性遗传病的发生，得到需要性别的畜禽（如母牛、母鸡）需要控制性别，而性别控制的前提是性别鉴定。早期性别鉴定的方法有细胞遗传学法、H-Y抗原法、X染色体连接酶活力测定法。这3种方法各有缺点，缺点分别是操作繁琐，易损害胚胎，准确率低等。而现代分子生物学技术中PCR法和荧光原位杂交技术（FISH）克服了以上的种种缺点，能够对胚胎进行快速、准确的性别鉴别，从而选择所需的后代，提高了鉴定的准确性，在某种程度上可以带来经济利益。

4.5 亲缘关系的分析

遗传物质DNA的差异使得生物体各种性状的表现不同，物种亲缘关系的远近程度在一定程度上可由DNA序列的差异来反映。DNA相似度越高，其亲缘关系越近。虽然在基因水平上，第一代个体存在特别微小的差异，但是这些差异会在分化过程中随着变异的累积而增大。DNA标记能够用于动物品系间亲缘关系的分析和遗传多样性的检测，这些DNA水平的遗传标记在估测物种的起源及群体亲缘关系的研究中，具有较高的检出率和灵敏度。

4.6 动物的抗病育种

除此之外，还能利用分子标记诊断猪的疾病。应用分子标记的主要目的是寻找与重要经济性状和致病基因连锁的DNA片段，以期能进行早期选择，甚至在出生前就能对性状进行选择。目前为止，已经发现一些与疾病有关的基因，比如RYRI基因、E.cdiF4受体基因和LA基因，分别位于6号、13号和7号染色体。这些疾病基因的发现能够用于抗病育种，提高动物的抗病能力，避免疾病的发生，减少药物成本和患病动物的淘汰率，进而提高生产效益。

5 MAS在育种中的应用

5.1 MAS在山羊中的应用

赵苗等[20]以共计1 006个内蒙古白绒山羊、陕北白绒山羊两个绒山羊品种为材料，应用PCR-SSCP、PCRRFLP、aPCR-SSCP、DNA测序技术、DNA序列分析技术和生物信息学等，研究了KAP基因家族中的4个HGTKAP基因、MTNR1a基因（外显子2）、SS基因（全CDS区）共6个候选基因8个基因座的遗传变异，同时探讨绒山羊群体的遗传结构和遗传多态性及其与经济性状的关系，并且初步探讨了PCRSSCP和aPCR-SSCP两种方法的优劣。结果表明KAP6.1和KAP8.2基因在陕北绒山羊和内蒙古绒山羊群体中都呈单态，KAP6.2基因中共揭示了2个SNP和1个缺失突变；KAP6.2基因的片段仅在陕北绒山羊群体中存在，并且处于哈代-温伯格（Hardy-Weinberg）平衡状态，而在内蒙古绒山羊群体中并没有检测到。不同多态基因座与内蒙古绒山羊产绒性状和抓绒后体重的方差分析表明，KAP6.2基因对本试验所检测的性状没有影响，KAP8.1基因的不同基因型对毛长性状有极显著影响，因此，该试验将KAP8.1基因作为毛长性状的候选基因；MTNR1a-4-577基因座对内蒙古绒山羊的产羔数有影响显著，MTNR1a-4-589基因座对羔羊初生重有显著影响，因此，把MTNR1a-4-577作为产羔数选择的标记，而MTNR1a-4-589基因座可以作为初生重选择的标记。Gootwine等[21]借助两个微卫星标记OarAE101和BM1329（FecB座位紧密连锁）对FecB进行前景选择，将Booroola羊中的FecB基因利用标记信息辅助导入到了Awassi乳用绵羊中来培育高繁殖力绵羊。已经报道了很多采用MAS来研究标记对山羊生产性状的连锁关系的研究，发现了影响性状的优势基因型以及分析基因多态性与性状的关联分析等，对山羊的遗传改良具有广阔的应用前景。

5.2 MAS在奶牛中的应用

种公牛的培育在养牛生产中具有重要的作用，优良种公牛对后代的改良意义重大，采用常规育种法费时费力，且成本高。如果利用合适的分子标记对后备公牛进行早期选择，不仅可以提高选择准确性，而且减少了后裔测定的公牛数量，因此能够降低成本，提高经济效益。对奶牛进行QTL辅助选择和常规选择的对比，研究表明前者的选择准确性高。有研究表明少量的QTL效应能解释性状的大部分遗传变异，把这些QTL效应应用到奶牛的MAS育种体系中，奶牛的育种效率会提高。德国、法国等发达国家已经把MAS应用到奶牛的早期选择中，取得了一定的成果，但是在我国应用MAS进行奶牛的选育还存在一些问题，比如缺乏完整的品种登记制度和完善的生产性能记录体系、种公牛的培育主要以国外品种为主等。MAS能够改善遗传进展，适合于种公牛的早期选择。随着分子生物学的不断发展和发现更多的分子标记，MAS在奶牛的育种中发挥着重要的作用。

5.3 MAS在猪中的应用

已有一些标记主基因正被用于猪的分子标记辅助育种，比如PIC育种公司已经把雌激素受体基因（ESR基因）、促卵泡素β亚基基因（FSHβ基因）的MAS纳入了分子育种计划，提高猪的繁殖性能。更多的主基因在基因效应和精确定位上还达不到MAS的要求，所以无法在育种工作中使用。李娅兰等[22]研究了标记辅助选择在猪育种中应用效果，结果显示MAS对低遗传力、限性性状的选择效率最高；当性状的QTL方差占遗传方差基本相同时，中等遗传力性状的选择效率比高遗传力性状的选择效率更高；随着有利等位基因起始频率的升高，选择效率下降，而且有利等位基因起始频率越低，选择效率下降速度越快。

6 小结

在动物育种中，分子标记发挥着重要的作用，并形成了分子育种这一新的领域。MAS现在已经成为了动物育种常用的方法之一，不仅能缩短世代间隔，增强选择强度，提高选择的准确性和效率。而且选择不受时间、环境、年龄等的限制，适合于目标品种的早期选择，对于群体的遗传改良具有重要作用。然而，利用MAS实现大规模培育新品种的目标现阶段还没有实现，其真正在育种实践中应用还需要大量的研究和实践经验。

[1] MOREAU L，CHARCOSSET A，GALLAIS A.Marker-assisted selection efficiency in populations of finite size[J]. Genetics，1998，148(3)：1353-1365.

[2] EDWARDSMD，PAGENJ . Evaluation of marker-assisted selection through computer simulation[J]. Theoretical and Applied Genetics，1994，88(3-4)：376-382.

[3] GIMELFARA，LANDER.Marker-assisted selection and marker-QTL associations in hybrid populations[J]. Theoretical and Applied Genetics，1995，91(3)：522-528.

[4] SMITHC，SMITHDB. The need for close linkages in marker-assisted selection for economic merit in livestock[C]//Animal Breeding Abstracts.1993，61(4)：197-204.

[5] VAN DER BECK S，VAN ARENDONK J A M.Marker-assisted selection inanoutbred poultry breeding nucleus[J]. Animal Science，1996，62(1)：171-180.

[6] SPELMANRJ，VANARENDONK J A M.Effect of inaccurate parameter estimates on genetic response to marker-assisted selection in an outbred population[J]. Journal of dairy Science，1997，80(12)：3399-3410.

（以下参考文献若有需要可与作者联系）

宋志芳（1992-），女，山东菏泽人，研究生，研究方向：动物遗传育种，

E-mail：18730285576@163.com