昆虫病原真菌遗传改良研究进展

张 蕾，宋婷婷

(1.浙江科技学院，浙江 杭州 310023； 2.浙江省农业科学院，浙江 杭州 310021)

昆虫病原真菌遗传改良研究进展

张 蕾1，宋婷婷2

(1.浙江科技学院，浙江 杭州 310023； 2.浙江省农业科学院，浙江 杭州 310021)

随着现代遗传学和分子生物学的快速进步，现代基因工程技术已发展成为改良菌株最常用且最有效的途径，为昆虫病原真菌的遗传改良和选育高毒力杀虫菌株开辟了新途径。通过对昆虫病原真菌的遗传改良的研究进展的综述，重点介绍了昆虫病原真菌的筛选标记和以根癌农杆菌介导为代表的遗传转化体系，以及內源、外源基因的改造工程等的国内外研究现状，进一步分析昆虫病原真菌遗传改良目前存在的问题及应用前景。

昆虫病原真菌；遗传转化；基因改造工程；根癌农杆菌

作为控制自然界昆虫种群数量的主要天然手段之一的昆虫病原真菌，以之为主要成分制造的微生物杀虫剂已被广泛使用；但其在侵染寄主昆虫过程中仍然受到高温、紫外等环境因素的影响，同时还需克服寄主昆虫体壁及免疫反应等一系列障碍，因此，昆虫病原真菌传统侵染时间较长。为提高其侵染效率，并加快其侵染速度，对其进行遗传改良是现在国内外对昆虫病原真菌基础研究的主要领域。目前，常用的手段主要集中在通过诱变、细胞工程或基因工程3种技术方面的遗传改良，但国内外大量研究证明，前两种技术虽能达到遗传改良的目的，但仍存在转化效率低、目标性状难把握等问题。随着分子遗传学的不断发展，采用基因工程技术为菌株定向改良提供了最有效的途径。

1 昆虫病原真菌的筛选标记

昆虫病原真菌常以大肠杆菌等细菌的质粒为基础构建转化载体。为检测转化后的表达情况，通常需要加入选择性标记到载体上，而这个选择性标记同时还具有确定转化子及其遗传特性的功能。通常在昆虫病原真菌上使用的有两类。一类是营养缺陷型互补基因，是通过转入的标记基因与受体细胞缺陷基因互补，使受体细胞表现野生型生长而作为选择标记的。目前，编码色氨酸生物合成酶trp-1基因、粗糙脉孢菌trp-1基因的trp-C基因等都常被用作丝状真菌的选择性标记基因。另一类是抗性基因，将其转入可以使受体细胞在一定的药物浓度下生长，表现出药物抗性[1-4]，包括苯菌灵(Benomyl)、博来霉素(Bleomycin)、寡霉素(Oligomycine)和潮霉素(Hygromycin)等，这其中抗性基因hph的相关报道最多[5-6]。抗性基因是显性选择标记，使用十分方便，但这类抗生素却对昆虫病原真菌大多不敏感，无法用于其遗传转化。取而代之，粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)中抗苯菌灵的抗性基因即β-tubulin基因可用于金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)的遗传转化[7-8]，却难用于球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。而大量的研究证实，草丁膦抗性基因bar已成功应用于金龟子绿僵菌[9]、球孢白僵菌[10-11]和玫烟色拟青霉(Paecilomycesfumosoroseu)[12]。2010年，Zhang等[13]找到了一种新的昆虫病原真菌分子标记，成功地将稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)中抗磺酰脲类除草剂的基因sur运用到白僵菌和绿僵菌的基因操作[14-18]中。

2 昆虫病原真菌的遗传转化体系

昆虫病原真菌的遗传操作取决于高效转化体系的建立。自1973年粗糙脉孢霉的DNA转化方法[19]问世以来，通过生物、物理或化学等手段导入真菌基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的真菌遗传转化体系研究越来越受到科研工作者重视。在经历了原生质体转化法、芽生孢子转化法、限制性内切酶介导转化法(REMI)、基因枪法和电击法等研究之后，通过借鉴植物细胞转化的农杆菌介导的转化法[11,20-22]，因其转基因低拷贝、遗传稳定等优点受到了人们广泛关注。

目前仍被应用的经典方法是1989年由Fincham[20]提出的基于原生质体的遗传转化，即聚乙二醇(PFG)为高分子多聚物，具有细胞黏合及扰乱细胞膜的磷脂双分子层的作用，使得外源基因沉淀在受体的原生质体表面，并通过细胞内压力推动的胞吐囊泡化而将外源基因吸入细胞体内[11,23]。可由菌丝[24]或芽生孢子制备原生质体[25]，此法具有易得到纯合性转化子等优势，但以原生质体为受体的基因转化方法，同时也存在原生质体培养难度大、培养过程繁杂、培养工作量大、培养技术不易掌握、遗传稳定性差、再生频率低，且再生周期长、转化率低、效果不理想等劣势。随着分子生物学的发展，陆续出现如REMI法和电击法等将外源基因导入正萌发的分生孢子[26]，基因枪轰击可将外源基因直接转入分生孢子[27]等以分生孢子或菌丝为受体的转化方法。这几种转化方法因其步骤简单，目前已广泛应用到包括昆虫病原真菌在内的完整细胞和原生质体的转化，但仍存在转化效率偏低、转化子遗传稳定性较差[20，28]的问题。2006年醋酸锂介导的芽生孢子转化法[11,22]成功用于球孢白僵菌外源基因的导入[18，29-30]，操作容易且转化效率较高，但仅局限于少数种类的昆虫病原真菌。与其他真菌转化体系相比，由根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的遗传转化理论机制最清楚，技术方法最成熟，应用也最广泛，具有操作简便、转化受体不受限、转化频率高、能导入大片段的DNA、外源基因多以单拷贝插入且比例高、较少出现基因沉默现象及遗传稳定性好等优点[31]，是目前用于昆虫病原真菌基因操作的主要方法。

2.1 根癌农杆菌介导真菌的遗传转化

在真核微生物中，由根癌农杆菌介导的遗传转化方法最早于1995年用于酵母[32]，而1998年用于丝状真菌[33]，再于1999年移植用于工业真菌，动植物病原真菌的遗传转化体系构建[34-37]。

与农杆菌介导植物遗传转化的机理相似，根癌农杆菌基于help质粒上一系列毒性基因(Vir基因)的表达产物将T-DNA导入昆虫病原真菌细胞，但根癌农杆菌介导的真菌遗传转化[32-33]必须在乙酰丁香酮(acetosyingone，AS)等诱导表达多个Vir基因，如VirA、VirB、VirC、VirD1/D2、VirE和VirH等中的任何1个未发生突变，或完整的T-DNA左右两侧未发生缺失，转化才会发生。

2.1.1 根癌农杆菌介导的遗传转化方式

由根癌农杆菌介导的昆虫病原真菌遗传转化方式，T-DNA的整合主要有两种模式。一种是在细胞核外可自由复制，并含有起始位点复制质粒(replicate plasmid)的T-DNA，且这类T-DNA一般不整合进染色体。与之相反，另一种T-DNA并不含起始位点复制质粒(integrative plasmid)，其进入宿主细胞后主要也有2种整合模式：当宿主染色体与T-DNA中存在同源序列，就会通过同源重组(homologous recombination)以单交换或双交换方式整合进入基因组，即可实现同源重组[34]；但当宿主基因组与T-DNA中并没有同源的片段，此时T-DNA将通过随机的方式以非常规重组(illegitimate recombition)的形式整合进入基因组[38]。

2.1.2 影响根癌农杆菌介导真菌遗传转化的因素

影响根癌农杆菌介导的遗传转化效率或者说决定转化成败因素较多，主要有以下3个方面。

根癌农杆菌介导真菌转化的关键是AS。研究证实[39-42]，在与受体细胞进行共培养时，若未用AS诱导，就无法获得转化子；且Tsuji等[43-44]研究表明，随着AS浓度的增加，转化效率也相应提高。也有研究认为，AS浓度增加到一定程度反而会降低转化效率。对于根癌农杆菌在预培养时，是否需要AS的诱导作用仍存在争议。Combier等[39]认为，预培养时AS的加入，在单拷贝插入的机率增加的同时反而降低了转化频率。但Leclerque等[44]则意见相左。

共培养的时间和温度也是影响其转化效率的关键因素之一。随着共培养时间的延长，抗性转化子也会产生越多。Combier等[39]在对粘花菇(Hebelomacylindrosporum)进行根癌农杆菌介导的真菌遗传转化时，共培养48 h获得18个转化子，当时间延长至96 h，其转化子增至80个左右。球孢白僵菌进行根癌农杆菌介导的真菌遗传转化时，当共培养时间为3 h，其转化效率是121个转化子/106CFU；而当时间延长到4 h，其转化效率提高至163个转化子/106CFU[44]。Meyer等[41]研究表明，少于24 h或大于72 h的共培养时间都无法得到转化子。Takahara等[42]则证实共培养时间过久反而会导致假阳性克隆的产生。同时，当共培养的温度与受体最适宜的生长温度一致时其转化效率最高，降低或升高都降低了转化子的数目[45]。

昆虫病原真菌遗传转化的成败和效率也会受到抗性标记、农杆菌、双元载体及启动子的选择等影响。Hanif等[40]研究发现，在对乳牛肝菌(Suillusbovines)进行农杆菌转化时，用腐草霉素抗性基因标记，转化子中只有73%呈PCR阳性，而用潮霉素磷酸转移酶(hygromycin B phosphotransferase)基因作为选择标记，全部抗性转化子均呈PCR阳性。在红曲霉(Monascuspurpureus)的农杆菌转化试验中发现，利用双元载体pUR5750比用pBGgHg的效率高出2倍，但当双元载体换成pBG7-1时并未获得转化子[45]。在进行根癌农杆菌LBA4404转化黑曲霉试验中，当以双元表达载体pBI121为骨架，并未得到转化子[46]；但把根癌农杆菌菌株换成LBA1126，并以pbin19为基本骨架时转化获得成功[33]。另外Godio[47]研究证实，结构完全相同、2个启动子部分不同的质粒会导致转化时T-DNA单链结构的稳定性不同而影响转化结果。

2.2 昆虫病原真菌的基因改造工程

为提高昆虫病原真菌的毒力或抗逆等性状，可高表达某些基因或抑制某些基因的表达，或者还可导入某些有用的外源基因，主要有以下两个方面。

2.2.1 超表达或改造并超表达内源基因

昆虫病原真菌一般由昆虫体壁侵入其体内。研究证实，加快穿透昆虫体壁的速度可提高真菌的毒力，而真菌在穿透昆虫体壁时所分泌的降解酶，为基因工程改造真菌提供了目标基因来源，高表达这些基因就可提高体壁穿透速度。Leger等[48]通过高表达金龟子绿僵菌中Pr1类蛋白酶基因Prla来增强其毒力，使烟草天蛾(Manducasexta)的死亡时间缩短20%。组成性表达Prla基因不仅加快金龟子绿僵菌穿透寄主体壁的速度，且在血腔中表达的Pr1蛋白酶也会攻破寄主免疫防御系统，如酚氧化酶的过量表达就会加速寄主死亡等。方卫国等[49]超表达几丁质酶Bbchit1基因在球孢白僵菌内，对蚜虫的致死浓度和致死时间都降低50%。同时，有些抗逆相关酶系也被证明与毒力密切关联。超表达细胞质中的锰芯超氧化物歧化酶基因BbSod2，不仅可大幅提高球孢白僵菌的抗氧化和耐紫外的能力，同时也提高了对斜纹夜蛾(Spodopteralitura)二龄幼虫的毒力[50]。目前，很多已知与毒力、抗逆相关的基因都有可能成为构建工程菌株的候选基因，如与胞内甘露醇调控相关的酶系[17，51]、抗氧化酶系[16，18]、调控抗逆性状的若干信号传导因子[14,16，52-53]以及甲酸可提取、被看成是孢壁结构成份的一些蛋白[30]。随着金龟子绿僵菌、球孢白僵菌等重要昆虫病原真菌全基因组测序的完成[54-55]，越来越多用于遗传改良和工程菌株构建的基因资源正在被发掘。

研究证实，昆虫病原真菌中的几丁质酶和蛋白酶基因都具有提高毒力的作用，改造并超表达这些内源基因，均可以提升真菌的毒力。范艳华等[56-57]通过DNA shuffling和结构域融合技术对球孢白僵菌几丁质酶Bbchit1和类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1进行基因改良，转基因结果表明其毒力显著提高。

2.2.2 外源毒力或抗逆基因的导入

近几年，通过高表达一些外源的昆虫毒素基因来达到大幅提高该真菌毒力的目的，已逐渐发展成为昆虫病原真菌遗传改良的一个方向。将外源神经毒素北非蝎毒素基因aaIT转入金龟子绿僵菌表达并诱导其在寄主血腔中表达，证实该转基因菌株对烟草天蛾(Manducasexta)幼虫和埃及伊蚊(Aedesaegypti)雌成虫的LC50分别降低22倍和9倍，LT50分别缩短30%和40%[23]，同样此转基因菌株对咖啡果小蠹(Hypothenemushampei)的毒力也大幅提高[58]。而在球孢白僵菌中转入此毒素，也增强了对马尾松毛虫(Dendrolimuspunctatus)、大蜡螟(Galleriamellonella)的杀虫功效，对2种虫的LT50分别下降40%和24%[59]。进一步的研究证实，蝎毒素基因的导入正是利用昆虫病原真菌通过体壁侵入寄主体内，从而在寄主血腔内表达毒素起到麻痹神经而加速致死的作用。

研究证实，通过导入外源基因可大幅提高昆虫病原真菌口服毒力，而转基因工程菌可通过昆虫取食而快速杀死鳞翅目暴食性害虫。苏云金芽孢杆菌是经昆虫口器摄入到达中肠后，通过破坏肠壁细胞从而引发坏血症而起到杀虫作用的，其能产生对鳞翅目、直翅目、鞘翅目等咀嚼式口器害虫有胃毒杀活性[60-63]的杀虫蛋白。秦毅等[29]在球孢白僵菌中组成性表达1种苏云金芽孢杆菌肠毒蛋白基因Vip3Aa1，结果显示，工程菌株BbV28对斜纹夜蛾二龄幼虫的毒力大幅增强，第3天提高了17.2倍；王正亮等[64]通过优化球孢白僵菌疏水蛋白基因的启动子，并利用其超高表达Vip3Aa1基因，所得到的工程菌BbHV8的肠毒蛋白表达量比之前的秦毅等的工程菌BbV28提高近10倍，对斜纹夜蛾二、三龄的口服杀虫效果大幅提高，而对BbV28不能有效毒杀的四、五龄虫也能100%致死。这些研究证实，通过体壁侵染寄主的昆虫病原真菌一般对蔬菜暴食性咀嚼式口器害虫无能为力，但通过高表达某些毒蛋白，如肠毒蛋白的工程菌株，不仅可作用于这几类害虫的防治，且其原本具备的体壁侵染能力仍可协同对付刺吸式口器害虫如蚜虫(Aphidoidea)[65]、粉虱(Aleyrodidae)[66]、叶蝉(Cicadellidae)[67]、飞虱(Delphacidae)[68]、叶螨(Tetranychidae)[69]等。

导入外源基因除了提高真菌毒力之外，还可增强昆虫病原真菌对环境胁迫的抵抗力，因此增强其对不利环境的适应能力与其在田间应用中的稳定性有紧密的关联。应盛华等[70]在球孢白僵菌中高表达大肠杆菌硫氧还原蛋白(trxA)基因，该转基因菌在耐紫外辐射和48 ℃高温的能力分别提高12%～16%和15%～17%的同时其抗氧化能力也显著提高18%～20%。

3 昆虫病原真菌遗传改良存在的问题及展望

随着基因操作技术的不断发展，对昆虫病原真菌进行基因操作和遗传改良的研究近年来捷报频传，并显示出良好应用前景。尤其是近几年将肠毒蛋白VipAa1转入球孢白僵菌、金龟子绿僵菌高表达的工程菌株，其对靶标害虫的胃毒杀虫活性和口服毒力为研制新一代双途径侵染的安全高效广谱真菌杀虫剂带来了希望。但目前相关报道仍较为基础，基因的筛选、改良及功能基因验证仍有待于深入研究，以期为改造高毒力、高抗性的昆虫病原真菌工程菌株提供理论依据。

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(责任编辑：张瑞麟)

2017-01-03

浙江省自然科学基金(LQ14C140005)

张 蕾(1981—)，女，浙江杭州人，副研究员，博士，研究方向为昆虫病原真菌基因改造工程，E-mail：papaver_rhoeas@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170440

S433

A

0528-9017(2017)04-0679-06

文献著录格式：张蕾，宋婷婷. 昆虫病原真菌遗传改良研究进展[J].浙江农业科学，2017，58(4)：679-684.