附子理中丸质量标准研究进展❋

甘嘉荷，王 淳，宋志前，宁张弛，马新玲，刘振丽(中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

【综述】

附子理中丸质量标准研究进展❋

甘嘉荷，王 淳，宋志前，宁张弛，马新玲，刘振丽△
(中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

目的：归纳总结附子理中丸质量标准研究文献，为完善其质量控制标准提供参考。方法：检索文献并对临床使用的附子理中丸大蜜丸、浓缩丸、水蜜丸和片剂的定性鉴别、指纹图谱、检查和含量测定等相关文献进行归纳和综述。结果：处方中5味中药的显微鉴别和薄层层析鉴别方法都得到研究。通过指纹图谱多成分定性定量分析，发现同一厂家不同批次的质量差异较小，而不同厂家的质量差异较大；君药制附子中的苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱、使药甘草中甘草苷、甘草酸和甘草次酸都作为含量测定成分进行研究。结论：应根据附子理中丸组方特点，建立君药制附子和其他药味中主要成分的指纹图谱定性鉴别和多成分含量测定质量控制方法，从而保证临床用药的安全有效和稳定可控。

附子理中丸；定性鉴别；指纹图谱；含量测定

附子理中丸出自宋5《太平惠民和剂局方》，具有温中健脾的功效，用于治疗脾胃虚寒、脘腹冷痛、呕吐泄泻、手足不温，收载于《中华人民共和国药典》2015年版，由制附子、干姜、炒白术、党参、炙甘草组成[1]，临床上具有较为广泛的应用。目前附子理中丸处方涉及的剂型有大蜜丸、水蜜丸、浓缩丸和片剂，生产厂家较多，其中大蜜丸的生产厂家有23家，水蜜丸的生产厂家有1家，浓缩丸的生产厂家有6家，片剂的生产厂家有1家，有的厂家生产2种剂型，各种剂型的制剂工艺不同。

药品质量是保障其有效性、安全性和稳定性的关键。药典附子理中丸项下质量控制方法，主要采用显微鉴别法和薄层色谱法进行部分药味的定性鉴别，检查项下规定了乌头碱限量，含量测定项下仅规定了佐使药甘草中的甘草苷最低限量标准，而其君药制附子为有毒中药附子的炮制品。因此，为更好地控制附子理中丸质量，有文献报道采用液相色谱、液相色谱-质谱、气相色谱-质谱等方法，对附子理中丸进行定性鉴别、指纹图谱分析、多成分含量和总生物碱含量测定。本文对相关研究进行综述，以便为完善附子理中丸质量标准提供参考。

1 显微鉴别和薄层色谱鉴别方法研究

附子理中丸各种制剂制备工艺有所不同。其中，大蜜丸和水蜜丸中各药味均采用原粉入药，浓缩丸中制附子和部分甘草为原粉入药，片剂中只有制附子为原粉入药，可见制附子在所有剂型中都是原粉入药。对于原粉入药的中药，可以利用显微特征进行定性鉴别。药典收载了附子理中丸大蜜丸和水蜜丸中3味中药干姜、党参和甘草的显微鉴别方法。另有文献报道，以类白色的糊化淀粉团块作为制附子显微特征，以细小的草酸钙针晶长10～32 μm、不规则地塞在薄壁细胞中作为白术的显微特征[2]。

薄层色谱法是最常用的中药、中成药定性鉴别方法。2015版药典附子理中丸鉴别项下，分别以白术、干姜和甘草的对照药材为对照，对处方中这3味中药进行定性鉴别。高文兰[3]等采用薄层扫描法，以硅胶GF254薄层板、石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂，香兰素-浓硫酸-冰醋酸为显色剂，在540 nm、700 nm双波长下建立了干姜、白术、党参和甘草4味中药定性鉴别方法；以碱化氯仿-甲醇为展开剂，碘为显色剂，在420 nm、760 nm双波长下建立了制附子定性鉴别方法。

2 指纹图谱分析方法

中药质量标准正在由以单成分、单指标的质量控制方法，向多成分、多指标的质量控制转变。中药指纹图谱技术已经越来越多地用于评价中药产品的真伪、质量优劣、一致性和稳定性。张卫东[4]课题组采用高分离度快速液相色谱串联四级杆飞行时间与气相色谱-质谱联用仪建立指纹图谱，系统分析鉴定了4个厂家12批次附子理中丸中的化学成分。一共定性鉴别了45个化学成分，其中GC-MS定性鉴别了15个成分，均来自方中干姜，因其富含挥发油类成分，在附子理中丸中干姜为原粉入药，因此保留了原饮片中的挥发油成分。RRLC-Q-TOF定性了30个化合物，其中正离子模式定性了12个化合物，9个成分为附子中的生物碱，1个为党参中的成分，2个为白术中的成分，负离子模式下定性了18个化合物，均来自方中甘草。通过采用RRLC-Q-TOF和GC-MS指纹图谱，实现了全面分析鉴定附子理中丸中的化学成分。指纹图谱结合聚类分析显示，12批次样品的化学成分存在一定差异，同一厂家不同批次差异较小，不同厂家差异较大。

孙国祥[5]课题组以市售附子理中丸作为研究对象，采用高效液相色谱法(HPLC)多波长分析方法，建立了附子理中丸融合指纹图谱的质量控制方法。融合10批次附子理中丸4个波长下的指纹图谱，并导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0”软件，对不同批次的附子理中丸HPLC指纹图谱进行数字化评价，以5-羟甲基糠醛峰作为参照物峰，确定了31个共有指纹峰，建立附子理中丸的统一化色谱指纹图谱，可以更加全面地反映复方所含化学信息。研究发现，不同厂家及批次的附子理中丸在化学成分和含量上都存在较大差异，可能与投料及生产工艺有关。部分厂家可能未严格按照处方及制备工艺进行投料和生产[6]。同时该课题组对附子理中丸的HPLC指纹图谱进行撤药分析研究[7]，从整体上考察不同配伍情况下方剂中化学成分的变化。结果显示，随着药味缺失，指纹图谱的定量定性相似度也在下降。制附子对全方指纹图谱定量相似度贡献很小，干姜在加热回流的条件下与其他中药成分有相互作用，生成不溶于水的物质，从而降低了其他中药化学成分的含量；甘草对全方指纹图谱的相似度贡献较大。认定从定性定量相似度两个方面评价指纹图谱，才能反映中药和制剂的质量。同时还对附子理中丸的大鼠血清HPLC指纹图谱进行了初步研究，发现含药血清中既有直接入血的药物成分，又有体内的代谢产物，为明确物质基础提供了参考[6]。

董林毅[8]等采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪结合核转录因子Kappa B(NF-κB)和β2肾上腺素能受体荧光素酶活性检测系统，从而发现附子理中丸中抗炎和解痉的活性成分。研究发现，猪毛菜酚和乌胺2个成分为β2肾上腺素受体激动剂，次乌头碱、乙酰乌头碱、人参皂甙Rb2、人参皂甙Rf、人参皂苷Rg2、人参皂甙F1和人参皂甙Ro被认为是NF-κB的抑制剂。通过IL-8酶联免疫吸附试验，证实了NF-κB抑制剂的抗炎作用。与传统指纹图谱相比，这种生物活性集成指纹图谱方法是一种非常有效的方法，能提高发现中药中潜在活性化合物的筛选和识别功能。

3 检查

由于附子理中丸的君药制附子为有毒中药附子的炮制品，为保证复方的安全性，2015版药典附子理中丸和附子理中片的检查项下，除符合相应剂型的有关规定外，均收载了薄层色谱法检测乌头碱限量的方法[1]，其中有采用重金属检查法，对附子理中缓释片中的重金属和砷盐进行检测[3]。

4 含量测定方法

《中国药典》2015版附子理中丸含量测定项下，规定了附子理中丸甘草苷最低限量标准，即小蜜丸每克不得少于0.33 mg，大蜜丸每丸不得少于3.0 mg，水蜜丸每克不得少于0.60 mg，附子理中片则规定了甘草酸含量每片不得少于0.53 mg[1]。

有关附子理中丸中成分含量测定的文献报道，多是对附子理中丸中君药制附子的成分、佐使药甘草中的主要成分进行测定，也有对制附子总生物碱含量进行研究。对制附子中的成分，有采用HPLC法、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)建立，同时测定1种、3种或4种生物碱含量的方法，所涉及的生物碱包括苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱[9-14]；对甘草中的成分，有采用HPLC法测定甘草中的甘草苷、甘草酸和甘草次酸含量[1、6、17-19]。

4.1 生物碱成分含量测定

刘永刚[9]建立了通过LC-MS法测定大蜜丸中中乌头碱(即新乌头碱)含量的方法，测得3个批次样品中中乌头次碱含量范围在0.12～0.20 mg/丸。索志荣[10]等采用LC～MS法测定浓缩丸中新乌头碱、乌头碱和次乌头碱含量，测得3个批次样品中新乌头碱、乌头碱和次乌头碱含量范围分别在1.17～1.53 μg/丸、0.37～0.42 μg/丸和1.11～1.57 μg/丸。钟碧华[11]等建立了HPLC法测定大蜜丸中乌头碱含量的方法，测得3个批次样品中乌头碱含量范围在8.255～8.321 μg/g。朱瑞龙[12]等采用HPLC法测定大蜜丸中新乌头碱、乌头碱和次乌头碱含量，测得3个批次样品中新乌头碱、乌头碱和次乌头碱含量范围分别在0.101～0.121 mg/g、0.0243～0.0 277 mg/g和0.0043～0.0 048 mg/g。邵峰[13]同样采用HPLC法测定浓缩丸和大蜜丸中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱含量，测得4个批次浓缩丸样品中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱含量范围分别在1.6～7.9 μg/丸、0.1～0.3 μg/丸和3.9～20.8 μg/丸，测得3个批次大蜜丸样品中苯甲酰新乌头原碱含量范围在5.7～17.1 μg/丸，未检测到大蜜丸中苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱的含量。刘岚[14]同样采用HPLC法测定大蜜丸中宋果灵、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱含量，测得样品中新乌头碱、乌头碱和次乌头碱含量为0.011 mg/g、0.173 mg/g、0.001 mg/g，未检测到样品中的宋果灵含量。

附子理中丸生物碱测定方法有LC-MS法[9-10]和HPLC法[6、11-18]，其供试品制备方法有氨水-乙醚超声提取[9-10]、氨水润湿后乙醚萃取或浸渍提取[11-12]、氨水-乙醚处理后氯仿萃取[13]，但使用氯仿萃取的方法未检测到苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱，是与供试品有关还是供试品溶液制备方法有关，尚需进一步研究确定。

除了对单体生物碱成分进行含量测定，也有对总生物碱进行含量测定。李兰芳[15]采用改良异羟肟酸铁法，利用剧毒性双酯型生物碱脂溶性强，易溶于乙醚、氨醇型水溶性强不溶于醚的特点，建立了双酯型毒性生物碱的含量测定方法，此方法能够特异性地测定附子及其制剂中微量的毒性双酯型总生物碱。乌兰娜日[16]等采用酸性染料比色法测定总生物碱含量，在水相为pH 6.1±0.1、溴甲酚绿为酸性染料、氯仿为有机溶剂条件下，准确地测定总生物碱含量。

4.2 甘草苷、甘草酸和甘草次酸含量测定

《中国药典》2015年版规定了附子理中丸大蜜丸和水蜜丸中甘草苷以及附子理中片中甘草酸的限量标准[1]。有关甘草苷含量测定，陈欣[17]测定了浓缩丸中甘草苷含量，测得4个批次样品中甘草苷含量范围在0.890～1.700 mg/g。谢亚晶等[18]测定了水蜜丸中甘草苷含量，测得3个批次样品中的甘草苷含量范围在0.61～0.63 mg/g。彭飞城[19]等测得25个批次浓缩丸中甘草苷含量范围在0.42～2.77 mg/g。从研究结果看，测定的所有样品中甘草苷含量都符合药典规定。

药典中对片剂规定了甘草酸含量，文献对不同剂型的甘草酸含量都有报道。任培培[6]测定大蜜丸和浓缩丸中甘草酸含量的方法，测得7个批次大蜜丸中甘草酸含量范围在10.22～15.87 mg/丸，3个批次浓缩丸中甘草酸含量范围在0.87～1.13 mg/丸。孙裕[20]测定浓缩丸中甘草酸含量，测得10个批次样品中甘草酸含量范围在2.9657～6.5 237 mg/g。许斐[21]测定水蜜丸中甘草酸含量，测得6个批次样品中甘草酸含量范围在1.057～1.165 mg/g。从文献看，供试品制备所用的提取溶剂、流动相、检测波长都不尽相同。

此外还对甘草次酸进行了含量测定。任培培[6]建立了通过HPLC法测定附子理中丸大蜜丸和浓缩丸中甘草次酸含量的方法，测得7个不同批次大蜜丸中甘草次酸含量范围在1.33～1.96 mg/丸，3个不同批次浓缩丸中甘草次酸含量范围在0.04～0.06 mg/丸。

5 结语

附子理中丸是临床广泛使用的经典传统中药方，具有多种药理活性，能应用于多种疾病的治疗。文献归纳总结显示，在现行版药典质量标准的基础上，文献在显微鉴别、薄层层析鉴别的方法上都有一定提升，从药典对干姜、党参、甘草的显微鉴别和白术、干姜、甘草的薄层层析鉴别方法，到文献对处方全部5味中药的相应鉴别方法研究，尤其指纹图谱用于处方中多成分定性定量分析，从而发现同一厂家不同批次差异较小，不同厂家差异较大；除了甘草中甘草苷、甘草酸作为药典含量测定限量成分，君药制附子中的苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱，以及总生物碱、佐使药甘草中甘草次酸，也作为含量测定的成分进行研究。

2015版药典附子项下，对附子饮片黑顺片、白附片等检查项中，制定了液相色谱法测定双酯型生物碱乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的含量测定方法，并规定了3个成分的总量不得过0.010%[1]。在含量测定项下，规定了6种生物碱苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱和次乌头碱的限量标准。而对于附子理中丸，只是在检查项下规定了乌头碱的标准，体现出复方标准低于单味药标准。临床有服用附子理中丸毒副反应的报道[22-24]，因此提高含有毒性中药的中成药质量评价标准十分必要。

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Pesearch Progress on the Quality Standard of Fuzi Lizhong Pill

GAN Jia-he, WANG Chun, SONG Zhi-qian, NING Zhang-chi, MA Xin-ling, LIU Zhen-li△
(TheInstituteofBasicTheoryofChineseMedicine,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

Objective：This paper summarizes the literatures on the quality standard of Fuzi Lizhong Pills, and provides reference for improving its quality control standard. Methods：Related literatures on the qualitative identification, fingerprint, inspection and content determination of the Fuzi Lizhong big honeyed pills, water-honeyed pills, water pills and tablets were summarized and reviewed. Results：Prescription of five kinds of traditional Chinese medicine microscopic identification and thin layer chromatography identification methods have been studied. Fingerprints were utilized to quantitatively and quantitatively analyze the multivariate constituents in the prescription, and found that the same manufacturers different batches of small differences, different manufacturers vary greatly. Benzoylmesaconine, benzoylaconitine, benzoylhypaconitine, mesaconitine, aconitine and hypaconitine from processed Fuzi, and liquiritin, glycyrrhizic acid and glycyrrhetinic acid from radix glycyrrhizae were used as the content determination of the components of the study. Conclusion：Based on the characteristics of formula of Fuzi Lizhong, we should establish a qualitative identification of fingerprints, multi-component content determination of quality control methods including the main herb of formula processed Fuzi and the main components of other medicine, thus ensuring the safety and efficacy of clinical medication and stable and controllable.

Fuzi lizhong Pill; Qualitative identification; Fingerprint; Content determination

中国中医科学院中医基础理论研究所基本科研业务费自主选题项目(YZ-1542)-附子理中丸传统与现代剂型整体成分群与入血成分对比研究

甘嘉荷(1992-)，女，广西人，医学硕士，从事中药药效物质基础及质量评价研究。

△通讯作者：刘振丽，研究员，医学博士，从事中药药效物质基础及质量评价研究，Tel：010-64089059，E-mail：zhenli_liu@sina.com。

R286

A

1006-3250(2017)08-1183-04

2017-01-17