大鼠急性心肌梗死模型制备方法研究进展

曹 珏，李贻奎，陈孟倩，姚魁武*

(1.中国中医科学院广安门医院,北京 100053； 2.中国中医科学院西苑医院，北京 100091； 3.北京中医药大学，北京 100029)

研究进展

大鼠急性心肌梗死模型制备方法研究进展

曹 珏1,3，李贻奎2，陈孟倩1，姚魁武1*

(1.中国中医科学院广安门医院,北京 100053； 2.中国中医科学院西苑医院，北京 100091； 3.北京中医药大学，北京 100029)

急性心肌梗死是危害人类生命的重大疾病之一。心肌梗死动物模型对研究人类心肌梗死的病理生理变化、诊断和治疗有着重要意义。目前心肌梗死动物模型的制备主要存在动物存活率低、繁琐复杂等问题。近年来，针对心肌梗死动物模型制备方法研究取得一些进展，在模型动物存活率、模型动物合格率、制备模型速度等方面具有一定的提高。该文就急性心肌梗死模型的制备方法及相关研究现状进行分析，结合实际因素以期简化模型制备过程，提高科研人员的造模水平，从而为医学研究提供稳定可靠的急性心肌梗死模型来源。

大鼠；急性心肌梗死模型；自主呼吸；冠脉结扎；麻醉；检测指标

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI) 是全世界病死率较高的疾病之一。诱导受损的心肌细胞再生成为治疗急性心肌梗死的重要临床目标，而标准化的动物模型是心肌细胞再生医学研究的基础[1，2]。因为大鼠急性心肌梗死模型与临床AMI病理生理过程有一定的相似性，模型的存活时间较长、变异性低、可重复性高、相对稳定性好以及价格适宜、易于饲养等优点突出，是模型制备及研究的良好动物模型来源[3]。虽然大鼠造模有上述诸多优点，加之众多科研工作者对造模方法做了大量的研究与探讨，但在实际制作过程中依然存在如下问题：大鼠本身的个体差异明显，存在手术过程中不耐受的现象；手术者的水平参差不齐，对大鼠的处理流程存在差异，相应地导致制备时间增加，造成手术者精力及体能的消耗随之增加，难以保证造模操作的连贯完整。以上因素都会导致大鼠的存活率及造模成功率下降。所以将其用于心血管事件及心肌细胞再生医学的机制的研究依旧有很大的挑战和难度。该文通过近年来对大鼠AMI模型建立的总结和制备过程重点环节的研究探讨，为标准化AMI大鼠模型的制备方法提供切实可信的改进方案，提高模型的生存率和造模成功率，降低制备过程的难度提供参考。

1 关于是否建立人工气道的选择

过去认为呼吸支持可以提高实验模型的生存率，经典的Jones[4]法造模是在大鼠自主呼吸条件下为其佩戴呼吸面罩，连通动物呼吸机持续正压通气为大鼠提供呼吸支持。之后国内外众多的科研学者也在对Jones法进行改良，很多造模方法中也经常把动物呼吸机作为实验必备的仪器之一；王学文等[2]、杨文慧等[5]选用经口直视插管接通动物呼吸机为AMI大鼠模型支持呼吸，在确定大鼠呼吸频率与呼吸机一致后，对呼吸机进行设定：容量控制模式，呼吸频率为每分钟50～75次，吸呼比为1∶1，潮气量为10～15 mL/250 g体重；刘宇等[6]，赵传艳等[7]采用在气管第2、3或4、5软骨环处切开，进行深度1.0 cm插管并接通动物呼吸机的方式支持呼吸；Ilayaraja等[8]采用两种插管方案：第一种为在大鼠颈部提供光源，在光源下经口插管；第二种为在颈部正中做出5 mm的切口，并在立体显微镜注视下将管针插入气管内，两种方案均需接通呼吸机，设定潮气量为小鼠体重(g)的3倍+155 μL，设定频率每分钟120次。但在实际制备过程中对呼吸机的参数设定需要消耗时间，如选用无创的呼吸面罩通气，死腔样通气效应[7]明显，可能导致大鼠体内CO2蓄积，而且操作过程中无法监测气道内压力，为调节气道内压力以防止气道压过高造成的肺损伤带来困难；而在改良的方法中如对大鼠进行有创气管插管，不论是经口直视插管还是气管切开插管，即便是熟练的操作者，成功建立有创通气所需时间仍在10 min以上，难度很大。同时在大鼠颈部周围进行有创操作的创伤很大，1次插管失败后反复插管易造成喉头水肿，难度的提升增加了实验过程所需时间，同样延长了麻醉时间，这很大程度上是增加了大鼠模型的死亡率。而且购置呼吸机和相关器械也增加了科研成本。从而有部分学者将目光转向非人工通气条件下[9，10]制备大鼠AMI模型。在摒弃动物呼吸机、大鼠完全自主呼吸的条件下，模型的生存率依然没有下降。李贻奎等[10]，闫奎坡等[11]按照是否在动物呼吸机条件下制备的AMI模型进行分组比较，发现实验动物生存率及造模成功率未见明显差异。而在非人工通气条件下最突出的优势在于简化实验过程，缩短手术过程所需时间，加快模型制作速度，显著提高造模效率；同时相比于气管插管这一有创操作，降低了大鼠呼吸道的损伤程度，保护其机体生理结构以利于其术后呼吸功能恢复和生存；且降低了大鼠的应激反应，也免去在拔管后清除呼吸道分泌物及进行缝合气道的操作。

2 冠状动脉结扎手术方式的选择

结扎冠状动脉是制备AMI动物模型最主要的方法，Jones法中对大鼠心脏左冠状动脉(left coronray artary，LCA)有详细的描述。结扎LCA使其闭塞，造成心肌缺血，与临床上心肌缺血及心梗时实际发病过程有相似之处。此方法能保证结扎位置和深度固定，控制心肌缺血的程度以增加造模成功率，以便日后进行心电图检测和组织染色检查等指标的测定。目前制备大鼠AMI模型存在死亡率高，操作难度大，模型质量难以保证，制备方法掌握起来比较困难等实际问题。手术操作失败的原因主要是手术过程长，结扎位置过高导致恶性心律失常[12]发生。参照国内学者的方法[2,10]，在非人工通气条件下于胸骨左缘第4、5肋间隙皮肤处剪开切口，用止血钳沿胸骨左缘第4肋间穿入胸腔，钝性分离胸大肌和前锯肌，剥离心包，充分暴露术野，并轻压胸廓挤出心脏；于左心耳下缘2 mm处用0号手术线结扎冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery, LAD)，结扎成功标志为左心室前壁及心尖周围心肌组织颜色苍白、晦暗或青紫和运动减弱[13]，结扎后立即将心脏放回，迅速排出胸腔内气体，对合、捏紧并缝合皮肤。该方法使得心脏挤出时心尖上翘，肺自然被推到一边，减少因手术操作对肺造成的损伤[14]。手术过程的创口较小，对大鼠胸部的解剖结构影响较小，可使其结构功能迅速恢复，便于开胸取材。Gao等[15]对大鼠在非人工通气条件下的冠脉结扎及传统呼吸机模式下开胸结扎进行对比，结果发现操作时间上前者平均(1.22±0.05)min，后者则平均(23.2±0.6)min，操作过程的时间因为未建立人工气道而缩短，使大鼠的组织器官暴露于外界的时间缩短；术中大鼠死亡率前者为3%，后者为15.9%；心律失常的发生率在前者中明显低于后者；前者在炎症指标的检测中依然占有优势，在术后24 h及7 d的两次检测下，肿瘤坏死因子(TNF-α)及髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)在前者血液中含量显著低于后者；在造模后28 d前者的生存率也较后者高近20%；同时LAD结扎的位置可以满足AMI模型标准。手术过程的简化及较小的切口可以减轻手术对大鼠机体的损伤，提高其生存率及造模成功率。手术者掌握此方法的关键的是熟悉大鼠心脏的解剖和冠脉的走行，快速准确定位并结扎LAD，相信经过不断对解剖基础的夯实和实际操作的重复，熟练掌握操作技术并不困难。

3 麻醉方式的选择

动物实验中对实验动物麻醉是很重要的环节，科研人员对麻醉是否了解对于制备动物模型具有非常大的影响。模型制作过程当中经常可以遇到麻醉过浅而使手术过程中断，或者整个手术过程较长，麻醉过深造成模型的死亡的情况。理想的麻醉既要保证动物在可耐受的条件下完成手术操作，又要使其在手术后尽快苏醒以降低死亡率。目前国内的麻醉剂研究中，汪新亮等[16]把水合氯醛、氯胺酮、丙泊酚进行对比研究，发现麻醉起效时间由快到慢依次为氯胺酮、丙泊酚、水合氯醛，麻醉维持时间由短到长依次为水合氯醛、丙泊酚、氯胺酮；麻醉致死量由高到低依次为氯胺酮、丙泊酚、水合氯醛；麻醉剂量安全线比较中水合氯醛较丙泊酚和氯胺酮高将近10倍。李少春等[17]对不同浓度水合氯醛对老年及青年大鼠的麻醉效果进行比较，结果发现不同年龄的大鼠对水合氯醛敏感程度不同：老年大鼠较正常剂量低的剂量才能既能保证理想的麻醉效果，又可降低死亡率；在不同浓度的水合氯醛对大鼠麻醉效果比较中，达到深度麻醉所需时间低浓度组短于高浓度组，大鼠苏醒或出现反应低浓度组快于高浓度组。在大鼠AMI造模过程中，对麻醉剂选用要求尽量安全、有效、廉价，通常把水合氯醛作为造模的麻醉剂，但依然要注意的是大鼠的年龄、体重在麻醉剂用量上的区分，并且要与科研人员的自身情况结合考虑。国外研究证实[18，19]，水合氯醛即便是以极低的浓度(36 mg/mL)用于大鼠麻醉也会导致大鼠出现多发性肝坏死、腹膜炎及全身毒性，从而引起模型质量下降。在手术操作时间过长的情况下，达到良好的麻醉效果增加麻醉剂用量，势必会增加动物死亡的风险。所以对科研人员和手术者来说，优化手术设计、简化手术操作也很重要。前文提到的手术方法的优化可以保证手术过程时间缩短，从而减少麻醉剂用量，降低对动物的影响和死亡率。而关于哪种麻醉药物和哪种剂量最适合的问题还存有争议，需结合具体的实验因素来决定，关于这方面的问题还有待进一步研究考证。

4 检测指标的探讨

关于大鼠AMI模型制作完成后选取何种检测方法及选用何种检测指标来判定模型制备成功与否是一个值得探讨的问题。在实验中经常被用于检测的方法包括心电图、血清生物标志物及超声心动图，每一种方法都有其重要的诊断意义，但又有其不足的方面。心电图作为一种判定AMI形成的方法，因其操作简便易行，记录方便而被被广泛应用于实验中。将大鼠LAD结扎后主要造成左心室前壁缺血，何涛等[20]通过观察记录结扎后大鼠肢、胸导联心电图发现J点偏移在I、aVL、V2、V5导联抬高，T波振幅的幅值在I、aVL导联增大，基本可以明确AMI大鼠的梗死部位是左心室，且梗死程度并未因观察时间的不同而有所变化。心电图是判断AMI的重要方法，但是问题局限在普通心电图很难对AMI的位置及范围进行精确的定位与评价，如心肌梗死区域较小导联的连接部位出现偏移时易出现假阴性结果，Bonilha等[21]在研究中指出，坏死性Q波形成大于1 mm在大面积AMI大鼠和小面积AMI大鼠中存在率相当(92%，96%)，Q波的深度与小面积AMI相关性无从体现，同时心电图波形的记录易受外界因素干扰导致信息不准确。血清生物标志物在诊断AMI时有愈发重要的参考价值，灵敏度高、特异性强的标志物是研究者最希望发现并使用的。目前常用来检测的AMI相关性的标志物包括心型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid binding protein, H-FABP)、血清同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)与心肌肌钙蛋白T(cardiac tropoin T, cTn-T)，标志物的检测同样存在时间窗的问题，国内学者[22-24]的研究表明，对大鼠结扎LAD后，H-FABP在血清中的含量1 h已经升高，3 h达到高峰，9 h依然可以维持；而血清HCY的含量1 h有升高趋势，3 h达到高峰，且一直维持到术后12 h；cTn-T在血清中的含量3 h开始升高，6 h达到高峰，且一直到术后7 d持续存在。以上三种标志物均能对AMI进行早期判断，其中对H-FABP的研究中还发现，其在血清中的含量与AMI程度呈正相关性；cTn-T为心肌细胞所特有，心肌特异性强，为临床最新诊断AMI阳性的最重要指标之一；还有研究[25]认为HCY可以用于评估AMI的预后。但问题在于这些高敏感性和高特异性的研究指标对AMI的梗死程度进行准确的定量分析十分有限，对时间窗的把握也有一定的要求，通常将多种标志物进行结合分析更有价值。随着影像学技术的发展，超声心动图(ultrasound cardiogram, UCG)在动态观察心脏结构、心脏顺应性及心功能等方面发挥了许多不可替代的作用，同时在监测模型的时效性方面有着不可比拟的优势，也利于纵向观察心梗后心室重塑的动态变化，为当前临床分析和动物实验研究提供了可靠的参考价值。Benavides-Vallve等[26]在研究中得到左室收缩和舒张状态下的面积变化分数(fractional area change，FAC)可用于AMI的评价，变化分数下降即可证明AMI，并且在7 d后FAC基本保持稳定。黄颖等[27]，胡珍等[28]，林蔚等[29]研究表明AMI主要影响的心功能指标为收缩末期左室内径(left ventricular end systolic diameter,LVESD)、收缩末期左室容积(left ventricular end systolic volume, LVESV)、射血分数(ejection fraction, EF)、短轴缩短率(fractional shortening, FS)及每搏输出量(stroke volume, SV)明显下降，因而判定AMI急性期对心脏的收缩功能影响较大，对舒张功能无显著影响；同时通过能良好反映心肌做功的Tei指数的变化幅度也可进行对左室功能的判断与评价。目前在基础研究中UCG评价心功能的最佳指标存疑，关于其标准的制定所进行的相关研究不多；此外技术本身也存在着一定的限制性，仍存在进一步探讨和研究的空间。因此对大鼠AMI模型从诸如电生理、酶学、形态及功能等多角度、多方面的考察仍然十分必要，通过技术的更新及科学工作者相关认知水平的提升，更多有价值的信息会被发现和研究。

5 总结与展望

标准化的AMI动物模型是研究心血管事件和心肌细胞再生医学机制的基础，当前的研究进展中可以看到，模型的制备过程有简单化的趋势。非人工通气条件下手术者摆脱了呼吸机的限制，节省了制备模型的时间，节约物力和财力成本，同样降低了手术者制作水平的门槛。缩短手术操作时间对于保证手术者状态和动物状态的稳定较为有利。麻醉剂用量也因整体手术过程时间缩短而减少，对动物的影响和死亡率降低有显著的作用。在检测方面，B超检测方法的使用，极大的推进了对心梗模型的评价方式，尤其在无创、定量、动态等方面有显著的优势。该模型的制备在近年来取得明显进展，有诸多方面的提高，但是现有的制备方法、麻醉药物的选择、检测指标等方面仍有待进一步探索，这也是一代代科研工作者所不断追求的动力源泉。

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Researchprogressonpreparationofratmodelsofacutemyocardialinfarction

CAO Jue1,3， LI Yi-kui2， CHEN Meng-qian1， YAO Kui-wu1*

(1.Guang’anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China； 2.Xiyuan Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100091； 3.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029))

Acute myocardial infarction is one of the major causes of death in the world. Research on animal models of myocardial infarction has a great significance in improving the pathophysiology, diagnosis and treatment of human myocardial infarction. At present, problems such as low survival rate and complicated preparation still exist. In recent years, some progress has been made in the preparation of animal myocardial infarction models, which can improve the survival rate, qualified rate and speed. This paper analyzes the preparation of rat models of acute myocardial infarction and related research, combined with actual factors to simplify the process of preparation and improve the skills of scientific researchers, so as to provide a source of stable and reliable acute myocardial infarction models for medical research.

Rat; Acute myocardial infarction model; Spontaneous breathing; Coronary artery ligation; Anaesthesia; Detection indicator

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0096-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.019

2017-02-27

国家自然科学基金资助项目(81173449)。

曹珏(1992-)，男，研究生，专业：中医心血管病。

姚魁武，E-mail: yaokuiwu@126.com