伪结核棒状杆菌毒力因子的研究进展

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兼性胞内寄生菌伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)可感染马、牛、羊、猪、骆驼等多种动物和人，是慢性传染病干酪样淋巴结炎(Caseous lymphadenitis，CLA)的重要病原[1]，以被感染动物体表淋巴结、内脏器官脓肿及干酪样病变为特征[2-4]。在临床上，伪结核棒状杆菌以感染小反刍动物最为普遍，尤其是山羊和绵羊[1, 3]。据世界动物卫生组织(OIE)统计，全球至少有64个国家确认有该病的存在[2]，目前，我国关于伪结核棒状杆菌感染引起羊和骆驼发病的报道超过30篇，其流行率甚至高达30%[5-6]。伪结核棒状杆菌一旦传入羊群，极难控制和根除，是造成养羊业重要经济损失的原因之一[1-2]。不仅如此，该病原感染可引起人的淋巴结炎、嗜酸性粒细胞肺炎及心内膜炎等，对人类健康具有潜在的威胁[7]。因伪结核棒状杆菌毒力因子与其感染致病密切相关，成为人们研发伪结核棒状杆菌的新疫苗或治疗检测手段的标靶[8]。本文就伪结核棒状杆菌毒力因子的研究概况进行综述。

1 磷脂酶 D

磷脂酶(phospholipase)是致病菌的一种重要毒力因子，该酶通过水解细胞膜磷脂的磷酸酯键，从而破坏宿主细胞膜，引起细胞功能紊乱和丧失[9]，与病原菌的存活和传播直接相关[10]。磷脂酶 D(Phospholipase D，PLD)是伪结核棒状杆菌最重要、研究最早的毒力基因之一。PLD最早由Carne(1940)在伪结核棒状杆菌中发现[11]，随后在该病原感染哺乳动物的所有分离株中均检测到PLD[12]。在棒状杆菌属细菌中，只有伪结核棒状杆菌(C.pseudotuberculosis)和溃疡棒状杆菌(C.ulcerans)能产生PLD[13]。伪结核棒状杆菌PLD由pld基因编码，所编码的蛋白包括一个假定信号肽(约2.7 kDa)和PLD成熟蛋白(31.4 kDa)[14]。

伪结核棒状杆菌PLD具有多种生物学活性，可引起皮肤坏死，高剂量PLD对试验动物和家畜具有致死性, 与胞外马红球菌具有协同溶血作用，能抑制葡萄球菌溶解素诱导的红细胞溶解(Baird等[3]综述)。伪结核棒状杆菌PLD通过水解动物细胞膜鞘磷脂的酯键而增加血管渗透性，导致血浆从血管渗出进入周围组织，使病原菌能够从嗜中性粒细胞逃逸，并且损害朝向感染部位的嗜中性粒细胞趋化性[15]。研究发现敲除或使pld基因失活，该病原均不能造成感染羊的淋巴结脓肿和CLA[16]。PLD特异性抗体能限制该病原感染引发的临床疾病病程[3]。

PLD是伪结核棒状杆菌的主要保护性抗原，常被用于防制该病原的疫苗研发[17]。目前生产的疫苗通常为福尔马林灭活的富含PLD的伪结核棒状杆菌培养物上清液，或基于PLD研究的DNA疫苗[18]。Hodgson等[19]研究发现pld基因缺失的伪结核棒状杆菌弱毒株Toxminus单次皮下接种，可对野生型伪结核棒状杆菌感染绵羊具有保护性。

最近，Combs等[20]研究发现，伪结核棒状杆菌分泌鞘磷脂酶D(secretes sphingomyelinase D, SMase D)可抑制人T细胞钙池操纵的钙进入(store-operated Ca2+entry，SOCE)，降低SOCE依赖细胞因子IL-2和TNF-α的产生。SMase D通过抑制钙释放激活钙通道蛋白流(Orai1 current)而不是改变电压门控K+通道，以抑制SOCE。研究认为虽然某些基因突变消除Orai1活性(Orai1 activity)造成严重的联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)，但是伪结核棒状杆菌通过SMase D抑制Orai1活性，创建SCID样环境以维持细菌的持续感染。该研究揭示了伪结核棒状杆菌毒力因子通过宿主细胞膜中的靶向磷脂破坏关键膜蛋白功能，以阻止宿主免疫力的新机制。

此外，pld基因还被用于伪结核棒状杆菌临床检测研究。Pacheco等[21]以pld、rpoB和16SrRNA基因开发的多重PCR方法，可将伪结核棒状杆菌与其他密切相关的溃疡棒状杆菌(C.ulcerans)和白喉杆菌(C.diphtheriae)等棒状杆菌属病原区分开，为临床上直接诊断CLA提供了准确诊断方法。

2 分枝菌酸

伪结核棒状杆菌无荚膜，但有蜡状的分枝菌酸(mycolic acid)包裹在菌体表面。伪结核棒状杆菌分枝菌酸具有细胞毒素特性，与其致病性相关，对小鼠皮下注射该病原的分枝菌酸提取物，可引起局部肿胀、淤血和中心区域出血性坏死[3]。与其他放线菌科病原相似，伪结核棒状杆菌的分支菌酸外套(mycolic acid coat)能保护该病原在外界环境中的存活。在自然感染中，伪结核棒状杆菌的分枝菌酸外套为其提供了机械性的，或者生物化学性的保护，以避免溶酶体内水解酶的作用，从而保护细菌能作为一种兼性寄生菌在吞噬细胞和宿主机体内存活[3, 22]。这对该病原从最初感染部位迁徙到最终部位可能很有必要。此外，分枝菌酸可能促成了脓肿的形成，研究发现伪结核棒状杆菌不同分离株细胞壁脂质含量与其感染小鼠引发慢性脓肿的能力直接相关[23]。

3 σ因子

细菌σ(sigma，σ)因子是RNA聚合酶的必要组分并决定启动子的选择性。σ因子的替换可重新定向细胞内的一些或所有RNA聚合酶以激活或沉默基因的转录[24]。致病性胞内细菌可通过RNA聚合酶的选择性σ因子瞬时激活应激反应基因来响应宿主细胞的抗微生物机制[25]。因此，选择性σ因子在调节细菌毒力相关基因表达，促进致病菌感染宿主、胞内存活和扩散中发挥重要作用[24-25]。选择性σ因子胞质功能(extracytoplasmic function，ECF)家族蛋白，如sigE(σE)，主要调节细胞表面应激，控制不同致病菌毒力相关基因的表达[24]。研究发现σE与吞噬细胞内胁迫条件下的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)转录应答和细菌在胞内存活有关[26]。此外，sigE是结核分枝杆菌的一小类在响应亚硝化胁迫时选择性上调的基因[27]。近年来，Pacheco等[28]研究证实伪结核棒状杆菌在抵抗体外生成的生物相关浓度一氧化氮(NO)时确实需要σE。伪结核棒状杆菌sigE无效突变株(ΔsigE)在体外对酸性pH、细胞表面应激源和生物相关浓度一氧化氮(NO)更敏感。ΔsigE突变株不能在C57BL/6小鼠中持续感染，但能在缺乏诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的小鼠中保持感染性。同时发现σE在伪结核棒状杆菌感染期间抵抗NO/过氧化物应激胁迫中发挥作用。

4 寡肽透过酶

寡肽透过酶(oligopeptide permease，Opp)转运蛋白位于质膜中，通常与胞外环境摄取肽有关。同时Opp还参与调节细胞间信号传导，控制致病细菌毒力基因的表达等[29]。Opp属于ABC转运蛋白家族中的一类多亚基蛋白复合物，该家族以水解三磷酸腺苷(ATP)产生的能量来驱动脂质、肽和糖的跨质膜转运[30-31]。Opp转运蛋白由排列于操纵子中OppA、OppB、OppC、OppD和OppF 5个蛋白质亚基组成。通常OppA亚基负责捕获来自胞质外环境的肽并将其转移到跨膜的通道—形成蛋白(channel-forming proteins)。 OppB和OppC亚基负责形成跨膜通道，通过该通道寡核苷酸被转运至细胞内环境。OppD和OppF亚基位于细菌细胞膜的胞质部分负责ATP水解，所产生能量用于肽的内化过程[31-32]。Moraes等[29]研究发现，与伪结核棒状杆菌野生型菌株相比，当暴露于有毒的谷胱甘肽(GSH)，OppD缺失菌株(ΔoppD)生长受损，表明Opp对肽的内化不是必需的，伪结核棒状杆菌可通过其他途径来完成。此外，与野生型相比，ΔoppD突变体对巨噬细胞的粘附和感染能力下降，但是oppD突变不影响该菌对小鼠的致病力。

5 与铁摄取和调节相关毒力因子

研究表明分别由伪结核棒状杆菌PLD基因下游的FagA、FagB、FagC、FagD编码的完整膜蛋白、铁肠菌素转运子、ATP结合胞质膜蛋白和含铁细胞-铁结合蛋白与细菌的铁摄取系统蛋白具有32%～47%同源性[33-34]。FagA、FagB、FagC、FagD均由一个操纵子控制，参与铁的摄取，这些基因在富含铁的培养基中极少表达，而在缺乏铁环境下高水平表达，对伪结核棒状杆菌在山羊体内持续感染中发挥重要作用，研究表明该病原FagB(C)突变可降低其对山羊体内感染的致病性[33]。Aquino等对分离自绵羊和山羊的168株伪结核棒状杆菌研究发现，FagA和FagB检出率为100%，FagC和FagD基因相对检出率稍低，但其比例也超过了95%。与内脏中分离的伪结核棒状杆菌相比，所有未检出FagD基因的分离株均来自于表面脓肿，提示各临床分离株间潜在毒力以及FagD基因在参与伪结核棒状杆菌入侵宿主中有差异[34]。

6 其他毒力因子

虽然伪结核棒状杆菌编码II型3-脱氢奎特酶aroQ基因缺失后，对小鼠的致病力下降，同时可以引发机体的免疫反应，具有研发疫苗的潜力[35]，但是因aroQ基因缺失可能与其影响伪结核棒状杆菌芳香族化合物叶酸的合成有关，不宜认定为毒力因子。近年来，人们通过对分离自一个12岁女孩淋巴腺炎的伪结核棒状杆菌全基因组测序和分析，鉴定出小菌毛蛋白(SpaC)、神经氨酸酶或唾液酸酶(NanH)、真核样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G(PknG)以及分泌铜、锌依赖的超氧化物歧化酶(SodC)等假定的毒力基因[13, 36]。SpaC可与宿主细胞受体结合，促进其他的配体—受体相互作用，增强毒力因子传递效率和胞内入侵[37]。NanH属于一类糖基水解酶，催化糖复合物去除唾液酸残基末端，有助于病原识别暴露在宿主细胞表面的唾液酸，与病原的致病作用相关[38-39]。PknG影响巨噬细胞中结核分枝杆菌的胞内运输，大多数微生物和非致病性分枝杆菌在溶酶体中可被快速地发现和杀死。而结核分枝杆菌可停留在吞噬体中，通过释放PknG以阻断吞噬体-溶酶体融合。 缺乏pknG基因的细菌被迅速转移到溶酶体消除[40-41]。SodC是一种脂质体基序，可能锚定在细胞膜中[36]，该酶的胞外位置表明其可能对伪结核棒状杆菌细胞表面有保护作用，以抵抗哺乳动物宿主细胞外部产生的超氧化物[13]。结核分枝杆菌中，SodC有助于该病原抵抗巨噬细胞激活产生的氧化暴发产物[42-43]。在其他细菌如脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)和杜克雷嗜血杆菌(Hemophylusducreyi)中，Cu、Zn-SOD保护活性与其毒力有关[36]。最近，Silva等通过比较蛋白组学研究显示体外培养和经小鼠体内传代的伪结核棒状杆菌有118个差异表达蛋白，其中除PLD外，还有CP40蛋白酶、耐铜蛋白(CopC)、与细胞粘附相关的蛋白(LPTXG domain)、与解毒相关的抗活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的蛋白及谷氧还原蛋白样蛋白(NrdH)、以及对抗菌药物抵抗作用有关的青霉素结合蛋白和金属β-内酰胺酶等[44]。虽然伪结核棒状杆菌具有以上一些假定毒力因子，其中的一些毒力因子具有用于防制CLA疫苗开发的良好潜力[13]，然而它们的功能还有待进一步深入研究和鉴定。

7 展 望

自1888年发现伪结核棒状杆菌以来，人们对该病原开展了大量的研究，然而关于伪结核棒状杆菌毒力和基因表达控制的分子机制研究仍然很有限。到目前为止，只有很少一些毒力相关基因得以描述，对于控制不同毒力表型以及伪结核棒状杆菌羊种生物型(biovarovis)和马种生物型(biovarequi)不同趋向性的机制仍然缺乏[45]。Carvalho等以不同应激条件下伪结核棒状杆菌转录组信息筛选出了两个表达最稳定的内参基因——编码DNA促旋酶亚单位A(gyrA)和编码延伸因子P(fusA)的基因[45]，为研究该病原毒力基因的表达提供了基础。利用高通量测序数据，结合生物信息学知识和分子生物学研究手段，筛选和鉴定伪结核棒状杆菌的毒力因子，并解析不同毒力因子的功能及在致病过程中的协同作用，对深入了解该病原的致病机理和候选疫苗抗原具有重要的理论和应用价值。

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