开窍类中药增加血脑屏障通透性机制的研究进展*

2017-01-15超李新民张喜莲路岩莉房艳艳聂坤刘

中国中医急症 2017年7期

关键词：冰片通透性中药

吴超李新民张喜莲路岩莉房艳艳聂坤刘菁

（1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193）

·综述·

开窍类中药增加血脑屏障通透性机制的研究进展*

吴超2李新民1△张喜莲1路岩莉1房艳艳2聂坤1刘菁1

（1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193）

研究证实，多种芳香开窍中药均能增加血脑屏障通透性，协助多种药物直达脑组织治疗中枢神经系统疾病，但其机制尚未统一，文献内容分散且复杂。笔者查阅了近年各位学者对于开窍类中药增加血脑屏障通透性的机制的前沿研究，将他们的思路综述如下。

开窍血脑屏障 P-糖蛋白 Ca2+5-HT

开窍类中药包括冰片、苏合香、石菖蒲、麝香等，性味辛香走窜，皆可入心经，具有通关开窍醒神之功效，常被用来治疗温病热入心包、痰浊壅闭心窍之神昏谵语，以及中风、癫痫等卒然昏厥，痉挛抽搐之症。开窍药在中药配伍中常以“引经药”的形式存在，吴瑭《医医病书》云“药之有引经，如人之不识路径者用向导”，因其入心经，开脑窍，可协助其他药物从小肠吸收入血，进入脑组织的特定靶点，达到促吸收、策分布的效果而增强药物的疗效。前期研究已经证实，芳香开窍类中药可增强血脑屏障的通透性，其中尤以冰片举例的实验居多，但其具体机制为何，尚未统一。笔者现整理芳香开窍药增加血脑屏障通透性机制的研究进展，为临床探索与发掘提供思路。现综述如下。

1 开窍药与P-糖蛋白

目前已有诸多文献研究表明，P-糖蛋白（P-gp）与血脑屏障的关系密不可分，它广泛存在于血脑屏障（BBB）、肝、肾、胎盘、小肠等屏障结构中，是一种主动外向型转运体［1］。在血脑屏障中，P-gp主要表达与毛细血管内皮细胞的腔膜面，能与很多中枢性药物可逆性结合，随之依赖ATP水解释放能量，将药物的大部分从脑中泵回血液，使得药物在脑组织的含量下降很多，从而达不到有效的治疗浓度。所以，降低P-gp在血脑屏障中的表达，增加中枢性药物透过率，是治疗中枢神经系统疾病的关键。

陈艳明等制备了含有冰片的家兔血清，通过观察抗肿瘤药物长春新碱（VCR）对Hela和MDCK两种细胞系的细胞毒性作用，来判断冰片对P-gp的活性作用。Hela是一种肿瘤细胞系，MDCK是一种狗肾上皮细胞系，经常被用做BBB的体外模型，两者的细胞膜上均有P-gp的表达；而VCR作为细胞毒性药物，能够被P-gp主动泵出细胞外，使肿瘤细胞往往对VCR耐药。实验结果显示，加入了含有冰片的血清后，VCR对Hela及MDCK的细胞毒性作用增强，抑制了P-gp的活性［2］。相比于上述体外模型，占宏伟等用99mTc-MIBI有效在体评价了P-gp的功能。结果显示，使用冰片后，耐药C6脑胶质瘤摄取99mTc-MIBI明显增高，且冰片单次应用与连续应用的作用相同，说明了冰片对P-gp的抑制作用［3］。LAN K等同样支持了这一观点［4］。杨洋等利用Caco-2细胞对苏合香、安息香以及石菖蒲各自的有效成分安息香醛、香草醛和β-细辛醚与P-gp的外排关系进行了研究。研究发现，苏合香、安息香和石菖蒲的有效成分均可以促进P-gp高表达的Caco-2细胞对P-gp底物罗丹明-123（Rho-123）的摄取，使P-gp的结合位点被竞争性地抑制，抑制了P-gp的外排功能［5］，另有丁洁等利用KP值（Rh123在脑中浓度与血中浓度的比值）观察了麝香、安息香和苏合香与P-gp功能的相关性，结果显示，只有苏合香提高了海马区的KP值。又证明了苏合香的效应与抑制P-gp的功能有关［6］。而对于麝香对P-gp功能的影响，并没有明确的文献报道，有待以后进一步挖掘与探索。

2 开窍药与神经递质

张娜等观察了冰片合用地西泮后对大鼠脑纹状体四种氨基酸类神经递质，包括兴奋性神经递质天门冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu），抑制性神经递质甘氨酸（Gly）和γ-氨基丁酸（GABA）的影响，结果发现，冰片联合地西泮后可增加Gly、GABA的脑含量，说明冰片可促进地西泮入脑，这可能与其增强了血脑屏障通透性有关，而氨基酸类神经递质影响血脑屏障通透性的具体机制为何，此篇文献尚未言明［7］。刘亚敏等发现，麝香同样可以升高脑缺血再灌注大鼠脑内Gly/GABA，保护脑缺血后继发的神经元损伤［8］。又有研究表明，单胺类神经递质如组胺（HA）、5-羟色胺（5-HT）含量的变化能够影响血脑屏障通透性［9-10］。李伟荣等发现，冰片可以升高大鼠下丘脑HA、5-HT的含量；其中高剂量组冰片不比中低剂量组效果好，与HA受体的饱和有关；高剂量组冰片升高5-HT的作用更持久［11］。同样，石菖蒲亦可升高大鼠下丘脑的5-HT含量。另有文献报道，冰片、5-HT以及P-gp三者尚有关联，可能的机制为，当冰片与P-gp结合以后，因其与P-gp的亲和力较大，使得亲和力相对较小的5-HT难以与冰片竞争P-gp的结合位点，因此5-HT可以在细胞中堆积，进入脑内的含量增加，从而介导血脑屏障的开放［12-13］。另外，苏合香增强血脑屏障通透性的机制可能还与儿茶酚胺的分泌有关［14］。可见，开窍药增强血脑屏障通透性的机制与神经递质的含量变化有一定关系。

3 开窍药与Ca2+

有研究显示，Ca2+是神经细胞信号传递的重要的第二信使，对调控神经细胞的正常代谢与具体功能意义重大，而神经细胞的功能的好坏必然影响血脑屏障的功能，因为血脑屏障组成的一部分包括神经胶质细胞的足突。因此，Ca2+的含量高低与血脑屏障的功能关系密切。但如果细胞内的Ca2+的超载，就会引起脑组织细胞的损伤，可能的机制包括：Ca2+依赖蛋白酶被激活，破坏了正常的细胞骨架；激活磷脂酶A2和磷脂酶C，产生细胞毒性物质；线粒体内Ca2+过量，抑制ATP的生成，氧自由基生成增多，同时促进缺氧性酸中毒的发生［15-16］。因此，降低Ca2+的超载，维持细胞内Ca2+浓度的正常，对于脑细胞正常代谢，维持血脑屏障的正常功能同样意义非凡。刘岩等用连二亚硫酸钠（Na2S2O4）造成PC12细胞拟缺血缺氧模型，观察对PC12细胞活力的影响，测定细胞内的Ca2+含量，结果麝香、冰片、苏合香、安息香组细胞内的Ca22+含量均低于模型组，说明开窍药可以降低Ca2+过度内流，减轻钙超载［17］。王丹丹等用相似的实验方式再次证明了这一点［18］。有研究证实，Ca2+作为细胞信使，如果它在细胞内外的平衡被打破，会改变细胞膜的流动性、紧密连接的程度以及膜电位等。文献显示，冰片可以降低HaCaT细胞内的Ca2+浓度，增加细胞膜的流动性，降低膜电位，可以影响细胞间的屏障作用，增加药物的促透吸收［19］。

4 开窍药与血脑屏障超微结构

血脑屏障由脑毛细血管内皮细胞、基膜和神经胶质膜构成，毛细血管内皮之间有紧密连接封闭，内皮外由基膜及神经胶质膜（星形胶质细胞突起的脚板）构成。其中，内皮细胞是构成血脑屏障的主要结构，而内皮细胞间的紧密连接则更是目前的研究热点。

葛朝莉等给予大鼠灌服冰片石蜡油溶液，通过电镜观察给药后不同时间点大鼠血脑屏障超微结构的变化，结果显示冰片能够限制影响毛细血管内皮细胞间的紧密连接，与对照组相比，紧密连接的缝隙变宽，断续且结构减少；并且给药后48 h紧密连接结构又恢复正常，说明冰片改变紧密连接是可逆的，不会引起结构的永久性损害。另外，本实验结果同时还发现了神经髓鞘的异常，此改变是否与冰片增强了血脑屏障通透性相关，尚需要进一步研究［20］。俞斌等更是将中药与针灸相结合，通过运用电针“百会”“哑门”配合冰片来观察其对血脑屏障通透性的影响，结果发现单用冰片组以及电针联合冰片组均减少了内皮细胞的紧密连接，但是单用电针组则未见明显改变，说明针刺需与中药联合方能发挥优势，为中医针灸作用于中枢神经系统疾病提供了新的思路，开辟了新的方法［21］。陈艳明等除了观察冰片对细胞间紧密连接的影响以外，还增加了对细胞吞饮囊泡的观察。其利用MDCK作为血脑屏障的体外模型，考察了冰片对于细胞吞饮囊泡结构的改变的影响。结果发现，冰片可以引起吞饮小泡的数量增多，体积变大，加速了经过细胞吞饮方式的物质转运，而这一作用慢于冰片对紧密连接的作用，并且是可逆的［22］。综上笔者认为，开窍药增加血脑屏障通透性的作用机理不光与紧密连接有关，还与增加细胞的吞饮有关。紧密连接属于细胞间，吞饮囊泡属于细胞内，改变任意一个都可以增加血脑屏障的通透性。

另有文献研究显示，石菖蒲对血脑屏障超微结构同样有一定影响，它使细胞间紧密连接变得松弛，细胞壁变薄，局部缺损，星形胶质细胞足突水肿，结构变模糊，但紧密连接的基本结构较为完整，说明石菖蒲对血脑屏障的开放作用是生理性的，而非病理性损害［23］。陈怡君给成年斑马鱼腹腔注射了冰片和麝香酮，观察两者对于斑马鱼血脑屏障超微结构及紧密连接蛋白Claudins表达的影响，结果发现两者均使紧密连接蛋白的表达下调，紧密连接疏松，基膜破坏，由此而开启了血脑屏障，并且此过程是生理性的，不会引起脑损害［24］。

5 开窍药与一氧化氮（NO）

有文献指出，NO在生理状态下可以调节微血管的通透性，机制为1）通过使细胞内Ca2+的浓度升高，激活催化生成NO的酶［NO合酶（NOS）］来生成NO；2）组胺增加血管的通透性由NO介导，步骤为组胺与H1受体相结合，再与G蛋白耦合后激活磷脂酶C，磷脂酶C催化磷脂酰肌醇，使其分解产生甘油二酯和三磷酸肌醇，两者再兴奋磷脂酶C而激活NOS，使NO含量增加，这是组胺诱发微血管通透性升高的关键。

赵保胜等用链菌素亲生物素-过氧化氢酶法（S-P法）染色以及抗eNOS抗体的免疫组化法，观察正常和脑外伤状况下服用冰片后的大鼠脑细胞中eNOS含量的变化，来讨论一氧化氮合成酶（eNOS）与冰片促进血脑屏障开放是否相关。实验结果表明，冰片可以增加生理及病理状态下微血管内皮细胞内NO的含量［25］。张赐安等研究了麝香、冰片对大鼠NO含量以及一氧化氮合酶内皮细胞型（eNOS）、一氧化氮合成酶诱导性（iNOS）的表达量的影响，结果麝香及冰片可升高正常情况下即可表达、对Ca2+有依赖性的eNOS的表达量，降低仅在病理状态下表达的iNOS的表达量，起到一定的脑保护作用。

6 开窍药与信号转导通路

近年“血肿瘤屏障”越来越受关注，其实质为血脑屏障加上肿瘤细胞，但意义可能更加重大，因为屏障作用更近了一步：肿瘤细胞的生命活动包括增殖、分化、侵袭以及血管生成。这些活动必然使得在血脑屏障之外，又增加了肿瘤细胞所生成的屏障作用，所以血肿瘤屏障需要引起足够重视。

有研究显示，天然冰片可以选择性地开放血肿瘤屏障，提高抗肿瘤药物的透过率，提高药物的脑生物利用度。其机制与可逆性下调紧密连接相关蛋白及其附着蛋白（ZO-1），F-肌动蛋白（F-actin）有关［26］，但调控紧密连接相关蛋白表达的具体分子学机制，该文献并未说明。于是，邢燕梅等对其具体分子机制做了研究，他们用大鼠的C6脑胶质细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）共同建立了血肿瘤屏障体外模型，利用Western blot检测细胞外信号激酶（ERK）、磷酸化ERK（P-ERK）、P38MAPK、磷酸化P38MAPK（phosphor-P38，P-P38MAPK、氨基末端激酶（JNK）和磷酸化JNK（PJNK）的表达，结果得出，发现天然冰片增强了MAPK/ ERK通路上的ERK蛋白磷酸化，而对于P38MAPK、P-38MAPK、JNK、P-JNK的表达无明显影响，说明了冰片增加血肿瘤屏障的通透性，从分子水平上看，与MAPK信号通路中的EPK亚型有一定的关系［27］。对于其他开窍药对血肿瘤屏障是否有同样的影响，还需要继续探讨。

7 讨论与展望

综上，芳香开窍类中药对于血脑屏障通透性的影响的机制研究，主要还是集中在以上几部分，即p-糖蛋白、Ca2+、神经递质、血脑屏障超微结构、一氧化氮、信号转导通路。当然。大多数的文献报道还是以冰片为主，对于剩余的几种开窍药虽有报道，但很分散且不全面，这使得整理起来较为困难；并且本综述的题目设定使得笔者只能查阅与开窍药增加血脑屏障通透性的机制有关的文献，而与保护与增强血脑屏障功能有关的机制如抗炎与抗氧化等机制则无法描述，因此查阅领域变得较为局限，又因对于除冰片以外的开窍药的研究近些年才趋于深入，由此使得本文的参考文献较为贫乏。与其他类似研究进展相比，本次进展笔者省略了开窍药对血脑屏障作用的描述，而专注于对其开放血脑屏障机制的探讨，对机制的研究可能更加深入具体。

［1］金雪红，包仕尧.p糖蛋白与血脑屏障［J］.国际脑血管病杂志，2006，14（4）：282-285.

［2］陈艳明，王宁生.冰片对P-糖蛋白的影响［J］.中药新药与临床药理，2004，14（2）：96-99.

［3］占宏伟，刘洪彪，叶小娟，等.冰片对P-糖蛋白影响的99mTc-MIBI显像研究［J］.中国现代药物应用，2012，6（22）：1-3.

［4］ LAN Ke，HE Jian-lin，TIAN Yang，etal.Intra-herb pharmacokinetics interaction between quercetin and isorhamentin［J］. Acta Pharmacologica Sinca，2008，29（11）：1376-1382.

［5］杨洋，王世祥，房敏峰，等.安息香醛、香草醛和β-细辛醚对P-糖蛋白功能的影响［J］.中成药，2012，34（7）：1364-1366.

［6］丁洁，张莹，巫悦，等.麝香、安息香和苏合香对血脑屏障脑区特异性开放作用及其机制［J］.中国医院药学杂志，2015，35（4）：279-282.

［7］张娜，刘萍，何新荣.冰片单用及合用西药地西泮后对大鼠脑纹状体4种氨基酸类神经递质含量的影响［J］.中国中药杂志，2011，36（22）：3180-3183.

［8］刘亚敏，张赐安，徐秋英.麝香、冰片对全脑缺血再灌注大鼠脑组织氨基酸类神经递质的影响［J］.中药新药与临床药理，2002，13（4）：231-233.

［9］ Sarker MH.The role of guanyly cyclases in the permeability response to inflammatorymediatorsin pial venular capillaries in the rat［J］.JPhysiol，2002，540（Pt1）B209.

［10］Sharma HS.p-Chlorophenylalanine，an inhibitor of serotonin synthesis reduces blood-brain barrier permeability，cerebral blood flow，edema formation and cell injury following trauma to the ratbrain［J］.Acta Neurochir Supply，2000，76B91.

［11］李伟荣，姚丽梅，宓穗卿，等.冰片对下丘脑组胺、5-羟色胺含量的影响［J］.中药材，2004，27（12）：937-939.

［12］袁卓，张军平，刘养凤，等.P-糖蛋白与冰片促血脑屏障生理性开放的关系探讨［J］.天津中医药，2006，23（3）：261-262.

［13］吕旭潇，孙明江，孙凤志.冰片促进药物透过血脑屏障的研究进展［J］.中国中药杂志，2012，37（7）：878-881.

［14］毛浩萍，高秀梅，赵粉荣，等.开窍中药对牛肾上腺髓质细胞儿茶酚胺分泌的影响［J］.中国药学杂志，2008，17（20）：1555-1558.

［15］周宗元，王建，田徽，等.艾片与合成冰片对脑缺血再灌注损伤大鼠脑保护的比较研究［J］.时珍国医国药，2014，25（10）：2349-2351.

［16］Bicker PE，Gallego SM，Hansen BM.Development changes inintracelluar calcium regulation in rat cerebral cortex during hy poxia［J］.JCereb Blood Flow Metab，1993，13（5）：811.

［17］刘岩，王建，姚洪武，等.开窍药对缺血缺氧损伤PC12细胞的影响及其作用机制［J］.中药药理与临床，2010，26（4）：35-38.

［18］王丹丹，王建，彭颖，等.四味芳香开窍药的挥发性成分对缺血缺氧PC12细胞及细胞内Ca2+的影响［J］.西安交通大学学报：医学版，2012，33（3）：379-373.

［19］傅大莉，雍小兰，刘德芳，等.冰片对HaCaT细胞膜流动性及膜电位的影响［J］.中国中医药信息杂志，2015，22（4）：62-66.

［20］葛朝莉，韩漫夫，白润涛，等.冰片促进血脑屏障开放的超微结构研究［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2008，6（10）：1183-1185.

［21］俞斌，吕高红，孙永，等.电针配合冰片对小鼠血脑屏障通透性的影响［J］.针刺研究，2011，36（5）：335-340.

［22］陈艳明，王宁生.冰片对血脑屏障体外模型细胞间紧密连接和细胞吞饮囊泡的影响［J］.中国中西医结合杂志，2004，24（7）：632-634.

［23］胡园，袁默，刘屏，等.石菖蒲对血脑屏障超微结构及通透性的影响［J］.中国中药杂志，2009，34（3）：349-351.

［24］陈怡君.基于血脑屏障Claudins基因调控的冰片、麝香酮“开窍”机制研究及安全性评价［D］.北京：中国人民解放军医学院，2014.

［25］赵保胜.冰片促血脑屏障开放与一氧化氮含量改变的关系初探［J］.脑与神经疾病杂志，2001，9（4）：207-209.

［26］段美美，曾武，陈浩，等.天然冰片对顺铂在C6脑胶质瘤模型大鼠体内的药动学及脑组织分布的影响［J］.中药药理与临床，2013，29（5）：24-27.

［27］邢燕梅，闫晓宁，郭军洽，等.冰片对血肿瘤屏障通透性的影响及机制［J］.中国中西医结合杂志，2016，36（6）：696-702.

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