分子印迹技术在蜂产品中的研究进展

陈长宝 刘新迎 汪建民 牛华星 王士强 秦浩然 尹旭升

（1山东农业大学化学与材料科学学院，泰安271018；2山东省蜂业良种繁殖推广中心，泰安271000；3山东省兽药质量检验所）

分子印迹技术在蜂产品中的研究进展

陈长宝1刘新迎2汪建民1牛华星3王士强2秦浩然2尹旭升2

（1山东农业大学化学与材料科学学院，泰安271018；2山东省蜂业良种繁殖推广中心，泰安271000；3山东省兽药质量检验所）

具有专一性和选择性的分子印迹技术已经广泛用于蜂产品的安全检测和有效成分的提取中，并且很好地解决了复杂基质蜂产品中农药等污染物残留分析前处理用时长和技术难度大等问题。本文综述了分子印迹技术在蜂蜜、蜂胶和蜂花粉等蜂产品中的应用，并总结了存在的问题、展望了应用前景。

分子印迹技术;分子印迹聚合物;印迹分子;蜂产品;农药

2 MIT在蜂蜜中的应用

2.1 抑菌剂

四环素是一种广谱抑菌剂，对蜂蜜中革兰氏阳性菌和阴性菌等有良好的抑制作用。Bougrini M等[13]改善了MIPs的制备方法，印迹分子四环素存在时用修饰了p-氨基巯基酚的金纳米颗粒作为载体在金电极表面制备了具有微孔-金属-有机架构的MIPs传感器，以亚铁氰化物或铁氰化物作为氧化还原探针采用线性扫描伏安法表征了MIPs电化学传感器，经过实验条件的优化，此MIPs传感器分析兽药四环素的线性范围和检测限分别达到224～22.4 nmol/L、0.22 fmol/L，并成功应用于蜂蜜中四环素的分析。氨基糖苷类抗生素是一类苷类抑菌抗生素，主要用于蜂蜜静止期杀菌。

Moreno-González D等[14]在样品前处理中选用了具有高选择性的MIPs作为萃取材料来提取蜂蜜中九种氨基糖苷类抗生素，用毛细管区带电泳串联质谱对其进行了鉴定和分析。在优化的条件下，检测方法的准确度和精密度分别为88.2～99.8%、≤8%，线性范围和检出限分别为 3.5～60.5 μg/kg、6.0～103.1 μg/kg。硝基咪唑类是一类合成抑菌类药物，对蜂蜜中各种厌氧菌具有强大的抑制作用。Mitrowska K等[15]首先利用改进的MIPs从蜂蜜中固相萃取出硝基咪唑类药物及部分相应的羟基代谢产物等十四种化合物，其次利用HPLC-MS对其进行了检测。色谱分离条件是采用C18反相柱、0.1%甲酸的乙腈溶液和0.1%甲酸的水溶液组成的梯度洗脱流动相。优化后的色谱条件适用于甲硝唑和羟基化甲硝唑等十四种硝基咪唑类药物。并且根据欧盟委员会决议2002/657/EC的要求，对分析方法的线性、特异性、回收率和再现性等技术指标进行了评估，这种检测方法可以用于各种蜂蜜样品的分析。氯霉素属于抑菌性广谱抗生素，是治疗蜂蜜中厌氧菌感染的特效药物之一。Chen LG等[16]以氯霉素为印迹分子，制备了适用于萃取蜂蜜中氯霉素的磁性MIPs。将蜂蜜样品、萃取剂和磁性MIPs搅拌均匀萃取完全后，采用外部磁力样品基质中分离出吸附了氯霉素的磁性MIPs，用LCMS分析经由甲醇超声洗脱出的待分析物。在优化条件下，氯霉素的检测限高达0.047 ng/g，日内、日间的RSD范围分别是4.1～5.3%、2.9～7.1%。将该检测方法用于六种蜂蜜样品的检测分析，回收率为84.3～90.9%。红霉素是用于防治蜂蜜中链球菌的大环内酯类抗生素。Song B等[17]采用选择性和灵敏度较高的MIPs-ECS联用技术测定了蜂蜜中的红霉素，MIPs作为选择性识别元件提高了电化学传感器的选择性和灵敏度。用制备的MIPs修饰碳糊电极，MIPs对印迹分子红霉素具有很好的吸附能力，最大结合量为93.5 mg/g，印迹因子为2.1。MIPs碳糊电极和微分脉冲伏安法联用可以定量分析红霉素，与非MIPs碳糊电极相比，MIPs碳糊电极对红霉素的识别能够产生更好的电流响应，并且对红霉素结构类似物具有很高的辨别力。在优化条件下，该方法的线性范围和检测限分别为 5×10-8～1.0×10-5mol/ml、1.9×10-8mol/ml。这种选择性好、灵敏度高的传感器已经成功应用于蜂蜜、奶制品中红霉素的检测，在检测大宗食品中红霉素残留方面也具有很大的应用潜力。喹诺酮类是一类适于防治敏感菌的抗菌药。Lv YK等[18]以氧氟沙星为印迹分子、甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂、氯仿和月桂醇作为致孔剂在不锈钢色谱柱中原位制备了MIPs整体柱，该色谱柱作为在线固相萃取柱与HPLC联用，可以用来分析蜂蜜中的喹诺酮类药物的残留。在最佳合成条件和在线固相萃取条件下，采用斯卡查德分析和突破曲线分析该分子印迹整体柱得出其对喹诺酮类残留药物最大的结合能力和动态结合能力分别为 51.50 mg/g、434.92 μg/ml，高于非MIPs整体柱的相应结合能力43.15 mg/g和96.52 μg/ml。夏环等[19]以诺氟沙星为印迹分子沉淀聚合了对氟喹诺酮类抗生素具有特异性识别的MIPs，其印迹因子和亲和位点总数分别为 3.17 μmol/g、3.27 μmol/g。用该MIPs作为固相萃取填料建立了检测蜂蜜中三种氟喹诺酮类抗生素残留的MIT-SPE-HPLC法MIPs萃取柱与Oasis HLB商品柱的相比较发现，该MIPs-SPE具有更好的净化能力和富集效率。磺胺类药物是一种蜂蜜中常用的抑菌剂，Chen LG等[20]首次报道了磁性MIPs用于蜂蜜中残留磺胺类药物的磁性d-SPE研究，文章采用共沉淀聚合法制备了磁性MIPs，借助外磁场的快速分离，仅需15min就可以完成单次萃取过程。

2.2 农药

有机磷农药是用于防治植物病、虫、害的一类有机磷化合物，因为蜜蜂采集时的复杂性，蜂产品中不可避免地会有所残留。为了分析蜂蜜中残留的有机磷农药，He J等[21]将新型材料（Restricted Access Materials,RAM）与MIT相结合，以马拉松硫磷为印迹分子、缩水甘油基甲基丙烯酸酯为亲水性共聚单体，合成了用于检测蜂蜜中的六种有机磷农药（马拉硫磷、灭线磷、甲拌磷、特丁硫磷、乐果和苯线磷）。采用的新型材料RAM可以有效阻止蜂蜜含有的大分子进入萃取材料而降低了基质的干扰。在优化的萃取条件下，同商品化的C18和Florisil固相萃取柱相比，RAM-MIPs对六种目标有机磷农药的萃取效果相当，甚至在萃取容量上稍胜一筹。RAM-MIPs-GC法成功地应用于上述六种有机磷农药的同时检测，并具有良好的线性关系（0.01～1.0 μg/ml）和较低检出限（0.0005～0.0019μg/ml），分析结果的准确度和精密度分别为90.9～97.6%、RSD 2.26～4.81%（n=6）。三氟氯氰菊酯是一种高效农药菊酯类杀虫剂，会通过各种方式残留在蜂产品中。高林[22]将荧光识别技术和MIT联合建立一种集选择性识别、分析一体化的荧光传感技术，即利用窄发射谱、高量子效率的荧光染料为荧光团，选择性识别材料为给体，分别以有机聚合质材料选择性识别菊酯类杀虫剂和酚类内分泌干扰物中的代表性化合物三氟氯氰菊酯、2,4,6-三氯酚残留，构建具有荧光可控、稳定性好、特定活性位点多、快速、选择性识别型MIPs荧光传感器并应用于蜂蜜等试剂样品中污染物残留的选择性荧光识别与检测。毒死蜱是一种属于硫代磷酸酯类的高效、广谱有机磷杀虫剂，是乙酰胆碱酯酶的抑制剂。郑红[23]以毒死蜱为印迹分子,采用原位逐步聚合法制备了具有良好识别性能,考察了毒死蜱、敌敌畏及甲胺磷在毒死蜱分子聚合物上的选择性分离富集特性。用毒死蜱分子聚合物固相萃取了蜂蜜等实际样品中的毒死蜱，结果表明，聚合物对印迹分子产生了印迹识别效应，对毒死蜱有明显的选择识别性，流速为1.0 ml/min，进样量为20 μl，加样回收率为96～102%，RSD小于6.6%。

2.3 除草剂和双酚A

三嗪类除草剂通过光合系统Ⅱ（PSⅡ）以D1蛋白为作用靶标抑制植物的光合作用，会通过各种渠道进入蜂产品中。Zhou TY等[24]以莠灭净为印迹分子、间苯二酚和三聚氰胺为双功能单体、甲醛为交联剂制备了分子印迹树脂。含有大量亲水性官能团的分子印迹树脂具有良好的水分散性和均一的球状形态。MIPs树脂作为固相萃取材料能够快速、简单、高效地从蜂蜜样品中成功萃取-净化得到六种三嗪类除草剂，结合HPLCMS分析法，在优化的最佳实验条件下，六种三嗪类除草剂的检出限范围是0.02～0.125 ng/g，添加浓度为5ng/g标准品时的回收率范围为(83±4)～(97±4)%。该方法操作简单、分析速度快，既能从蜂蜜样品和水样品中高效萃取到残留的三嗪类除草剂，也能对其进行分离、分析。苯氧酸类除草剂是一类消灭或抑制植物生长的化合物；双酚A是重要的有机化工原料，会通过各种塑料材料使用而残留到蜂产品中。Herrero-Hernández E等[25]以双酚A作为印迹分子，采用沉淀聚合法制备了用于提取蜂蜜中酚类化合物（双酚A、双酚F和4-硝基酚）和苯氧酸类除草剂（2,4-D、2,4,5-T和2,4,5-TP）的MIPs萃取剂。与商品化OasisHLB固相萃取柱的净化效果相比较发现，合成的MIPs固相萃取柱具有优异的选择性，结合HPLC-DAD-MS检测到洗脱物中只含有类似目标结构化合物，回收率达到81～96%，检测限为0.1～3.88 ng/g，有效降低了蜂蜜中干扰组分的影响。

3 MIT在蜂胶中的应用

3.1 伞形花内酯

伞形花内酯是一种蜂胶内含有的香豆素类化合物，有抗菌、降压、抗癌作用。Cizmárik A等[26]以伞形花内酯为印迹分子、甲基丙烯酸为单体、乙醇/乙腈作为致孔剂采用多种方法制备了MIPs，并检测了其比容量的效率。实验发现，乙腈为致孔剂、甲醇/水体积比为1∶1时制备MIPs的比容量达到最佳。用MIPs可以萃取蜂胶酊中的伞形花内酯，实验结果表明，制备的伞形花内酯MIPs对印迹分子具有结构选择性和非特异性相互作用。Hroboňová K等[27,28]用伞形花内酯作为印迹分子、甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂、氯仿为致孔剂本体聚合了对伞形花内酯和4-甲基伞形酮等四种香豆素类化合物具有选择性识别的MIPs，采用静态吸附法、HPLC和前沿分析法对MIPs进行了评价，发现其具有良好的选择性和对伞形花内酯2.69 μg/g的结合吸附容量。通过探讨样品溶剂的影响得到了MIPs的最大吸附容量。MIPs用作固相萃取剂从蜂胶中萃取出香豆素类化合物，然后再进行HPLC分析。该方法的回收率均在70%以上，分析化合物的定量限为0.3～10 ng/mL(采用荧光检测确定)，是一个增强样品净化程度和提高蜂胶样品中伞形花内酯回收率的离线固相萃取法。

（未完待续）

The research progress of molecular imprinting technique in bee products

Chen Changbao1,Liu Xinying2,Wang Jianmin1,Niu Huaxing3,Wang Shiqiang2,Qin Haoran2,Yin Xusheng2
(1 College of Chemistry and Material Science,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China;2 Seed-breeding Bee Industry Promotiong Center in ShanDong Province,Tai’an 271000,China;3 Shandong Provincial Verterinary Medicine,Jinan 250022,China)

Molecular imprinting technique owned the specific selectivity has been widely used in safety testing and extraction of effective components in bee products,and excellently solved time-consuming and needed difficult technique in the pretreatment and analysis of pesticides etc residue for the complex matrix-bee products.This paper reviews that the molecular imprinting technique was used to apply in honey,propolis,and pollen etc bee products.Finally the existing problems in the field were summed up and the application prospect was forecasted.

Molecular Imprinting Technique;Molecularly Imprinted Polymers;Imprinted Molecule;Bee Products;Pesticides

1 引言

国家自然科学基金（21175083,31370686），山东省自然科学基金(ZR2013CQ014)，现代农业产业技术体系（SDAIT-24-05)，农产品质量安全监管专项(18162130109236）

陈长宝(1978-)，男，实验师，研究方向:生物化学分析，E-mail:chchbao@sdau.edu.cn。

尹旭升(1972-),男，研究员，研究方向:蜂产品加工与推广，E-mail:xushengyin@163.com。留物，能较好地解决从蜂产品等复杂基质中检测痕量药物残留的前处理问题。涂熹娟曾详实地综述了分子印迹固相萃取技术在蜂蜜中污染物残留分析的研究进展，但是未涉及到蜂胶、蜂毒和蜂花粉等蜂产品中的MIT应用[9]。赵静课题组自2011年来连续五年就国内外蜂产品质量安全研究进展展开论述，因篇幅有限，仅涉及了部分MIT在蜂产品中的研究[10-12]。本文将主要论述MIT在蜂蜜、蜂胶、蜂毒和蜂花粉等蜂产品中的应用和研究前景，以供业内同行参考，使MIT在蜂产品中具有更广、更深的应用。

分子印迹技术 (Molecular Imprinting Technology,MIT)[1,2]是指在空间立体结构和结合位点上制备对某一特定的目标分子[印迹分子(Imprinted Molecule,IM)]具有特异选择性聚合物的制备技术。这种制备技术是仿照抗原-抗体的作用机理，围绕着印迹分子形成一个高度交联的刚性高分子聚合物 (Molecularly Imprinted Polymers,MIPs)，去除印迹分子后就在MIPs的网络结构中留下与IM在空间结构、尺寸大小、结合位点互补的立体孔穴，从而对IM表现出高度的专一性、识别性和选择性能。因为MIPs具有预定性（依据不同目的制备相应的MIPs）、对印迹分子专一的识别性、高度的稳定性、较长的使用寿命和简单易行的制备过程等优点。

近二十年来，分子印迹领域的研究非常活跃，在MIPs的制备、表征、分析和测试方面积累了非常丰富的经验[3-6]。近年来，食品安全已经成为全球重要的公共安全问题之一，蜂产品的质量安全更是蜂产业能够持续健康发展的关键所在[7]。蜂产品的品质与其生产过程中所在的环境息息相关，自然环境中的化学物质和蜂群养殖过程中使用的药物在蜂产品中的残留也一直是蜂产业质量安全的关注焦点[8]。农药等污染物的残留不仅会通过致癌、致畸和致突变而危害人体健康，甚至会因为各国对药物残留检测灵敏度的不同而影响蜂产品在国际间的正常贸易。采用MIT提取、净化和富集药物残