替加环素耐药机制的研究现状

王 健， 沈继录

·综述·

替加环素耐药机制的研究现状

王 健， 沈继录

替加环素； 耐药机制； 外排系统； 双组分系统； 细胞膜

替加环素（TGC）是FDA批准的用于治疗复杂性皮肤和软组织感染、复杂性腹腔感染和社区相关细菌性肺炎的抗生素。随着应用越来越广泛，替加环素产生耐药性不可避免。替加环素是一种新型甘氨酰环素类抗菌药物，全称为9-叔丁基甘氨酰氨基米诺环素，是继多西环素、米诺环素、美他环素后开发的新一代四环素类衍生抗生素。该药通过可逆地结合于16S rRNA，阻断tRNA进入A位点，抑制了翻译过程。替加环素与核糖体的亲和力高于其他四环素类抗生素20倍[1]。同时，替加环素克服了四环素的耐药机制，如核糖体保护蛋白（tetM、tetO等）和外排泵（tetK、tetA等）[2]，使得替加环素对四环素和米诺环素耐药菌均有作用。本文通过介绍替加环素耐药性机制，我们可以更加主动地确定相关基因的转移并通过当前的新型“反突变”药物前瞻性的阻止耐药性的产生。

1 主动外排系统

1.1 耐药结节化细胞分化家族（resistance nodulation cell division, RND）

1.1.1 AdeABC外排泵 AdeABC是第1个在替加环素耐药的鲍曼不动杆菌中发现的RND型外排泵，是由AdeA、AdeB和AdeC 组成的三联体，其中AdeA是膜融合蛋白，AdeB是外排蛋白，AdeC是外膜通道蛋白。AdeB从细胞内膜或细胞质中摄取底物，通过AdeC转运到细胞外[3]，在此过程中，AdeA起协调作用，它可使细菌细胞内膜与细胞外膜接近，并能稳定外膜蛋白的结构。编码泵蛋白的adeABC基因无论在敏感或耐药株中均普遍存在，与耐药株的高表达相比，敏感菌株的表达却很低[4]，提示其可能是细菌产生获得性耐药的原因之一。

1.1.2 AdeIJK外排泵 在鲍曼不动杆菌的细胞膜上还存在AdeIJK外排泵。AdeIJK外排泵由膜融合蛋白 AdeI、内膜转运蛋白AdeJ和外膜蛋白AdeK共同组成。AdeN可抑制AdeIJK外排泵表达，adeN基因位于adeIJK基因的上游，adeN可编码TetR转录调节因子，Rosenfeld等[5]发现BM4587临床菌株adeN的失活可导致AdeIJK的作用底物即抗生素敏感性降低以及adeJ表达上升5倍。AdeIJK外排泵与 AdeABC 外排泵的结构及功能相似，底物也相似，且AdeIJK与AdeABC对替加环素的外排具有协同作用。

1.1.3 AdeFGH外排泵 AdeFGH也可导致鲍曼不动杆菌对替加环素耐药。AdeIJK外排泵受adeL操纵子的调节，adeL操纵子位于adeFGH基因的上游，与adeFGH基因呈反向表达，adeL突变可导致 AdeFGH外排泵的过度表达，从而导致细菌耐药[6]。

1.1.4 AcrAB 外排泵 研究发现AcrAB 外排泵的高表达可导致肺炎克雷伯菌对替加环素耐药[7]。AcrAB 外排泵具有典型RND家族结构特征，包括3个组成部分：内膜转运蛋白、膜融合蛋白和外膜蛋白。AraC家族的正转录调节蛋白RamA、MarA、SoxS和RarA 可激活外排泵而参与对替加环素耐药[8-9]，ramR、marR、soxR编码产物分别是RamA、 MarA、SoxS的阻遏蛋白。Wang等[10]也发现RamA是AcrAB泵的正调节蛋白，它可以导致AcrAB泵产生过度，进而引发耐药，而RamA可受RamB阻遏，RamA的过表达与RamR的低表达可导致沙门菌对替加环素的耐药率上升4倍[11]。acrAB操纵子受到阻遏蛋白AcrR调控，AcrR编码基因的突变也可能与替加环素耐药相关。

1.1.5 AcrEF 外排泵 在大肠埃希菌的细胞膜上还发现了AcrEF外排泵，它与AcrAB-TolC外排泵有高度的同源性并有相似的底物，其中也包括了替加环素[12]。

1.1.6 OqxAB外排泵 OqxAB外排泵是第1个被发现的由质粒介导的RND家族外排泵。OqxAB外排泵中OqxA是膜融合蛋白，OqxB是内膜转运蛋白，OqxAB外排泵可能通过其他非特异性的外膜蛋白排出底物[13]。编码OqxAB的质粒可较容易地水平传递到其他肠道菌，如沙门菌和产气肠杆菌。另外，肺炎克雷伯菌中发现RarA蛋白是OqxAB外排泵的正转录调节蛋白，RarA的高表达可导致低水平的替加环素耐药[9]。

1.1.7 SdeXY外排泵 对于黏质沙雷菌，内源性的RND型外排泵SdeXY与替加环素耐药相关。Hornsey等[14]研究发现，SdeXY外排泵可导致黏质沙雷菌对替加环素耐药，SdeXY 泵失活后可恢复细菌对替加环素的敏感性。除了替加环素，SdeXY外排泵还介导黏质沙雷菌对四环素、环丙沙星、头孢匹罗的耐药性。

1.1.8 MexXY外排泵 铜绿假单胞菌对替加环素天然耐药，其细胞膜上的主动外排系统是重要因素，其中RND家族的MexXY 外排泵在铜绿假单胞菌对替加环素产生耐药的过程中起关键作用[15]。

1.2 多药及毒性化合物外排家族（multidrug and toxic compound extrusion, MATE）

在革兰阳性菌中出现对替加环素耐药的情况较少，MATE家族的mepA外排泵基因的过度表达，可能导致金黄色葡萄球菌对替加环素敏感性降低[16]。

1.3 主要易化子超家族（major facilitator super, MFS）

TetA属于MFS超家族外排泵，ramR属于TetR家族的转化调节因子，ramR编码蛋白可结合启动子区域形成二聚体结构而抑制ramA基因的活性。Hentschke等[17]研究表明，与转座子Tn1721有关的tetA基因以及ramR缺失或突变均可导致对替加环素耐药。转座子Tn1721与具有接合性、传染性的质粒有关联，使tetA基因得以扩散从而导致替加环素耐药。

1.4 ATP结合盒超家族（ATP binding cassette, ABC）

MacAB-TolC外排泵属于ABC家族，MacAB是内膜蛋白，TolC是外膜蛋白。对于革兰阴性菌来说，TolC及其家族同源蛋白是将小分子和毒素运出外膜过程中必不可少的。野生型和临床型替加环素耐药的鲍曼不动杆菌菌株，替加环素诱导后，AdeIJK和MacAB-TolC的表达增强，提示其对替加环素耐药有重要意义[18]。

2 双组分系统

双组分系统由组氨酸激酶（ histidine kinase ，HK）和反应调节器（response regulator ，RR）两个基本组分构成。HK是一种跨膜蛋白，能发生自身磷酸化。RR是胞质蛋白，能转移磷酸基团并调控DNA的转录。双组分系统调节各种重要的细菌生理和代谢过程，如应激反应、营养利用、信号传导和细胞分裂。

2.1 AdeRS双组分系统

AdeABC外排系统受AdeRS双组分系统调节[19]，其中AdeS是传感器激酶，AdeR是反应调节器，adeRS 操纵子位于 adeABC操纵子的上游，与adeABC基因呈反向表达。adeS和adeR基因的点突变或者在adeS基因前插入序列ISAba1，均可使得AdeABC外排泵过度表达，导致鲍曼不动杆菌对替加环素敏感性下降[20]。Hornsey等[21]和Coyne等[22]研究发现AdeABC外排泵系统中adeS突变点（Ala-94→Val或Gly-30→ Asp或 Gly-103→ Asp） 和 adeR突变 点（Asp-20→Asn或Ala-91→ Val或Pro-116→Leu）引起外排泵过度表达，导致鲍曼不动杆菌对替加环素耐药。

2.2 BaeSR双组分系统

BaeSR双组分系统首次在大肠埃希菌中发现，在ATP存在下，BaeR和BaeS可发生磷酸转移反应，BaeS是传感器激酶，BaeR是反应调节器，BaeSR可接收环境信号而发生细菌包膜改变反应，主要是上调外排泵的表达以应对包膜损害原的刺激。随后发现BaeSR双组分系统可调控AdeIJK和MacAB-TolC外排泵而导致对替加环素耐药[18]。鲍曼不动杆菌中，RND型外排泵基因adeAB也受到BaeSR积极调控[23]。

3 核糖体蛋白

S10蛋白是核糖体30S亚基的一个组成部分，是由rpsJ基因编码的53～60个氨基酸残基组成，参与维持替加环素结合位点结构的正常。在大肠埃希菌中，核糖体蛋白S10通过参与rRNA操纵子的转录抗终止的进程而影响核糖体的生物合成，S10也是参与转录和翻译少数蛋白之一[24]。核糖体蛋白S10的保守环位于30s核糖体亚基与替加环素或四环素的主要结合位点附近，该位点附近突变产生的轻微结构改变可导致抗生素与核糖体之间的亲和力下降[25]。

研究表明，在革兰阴性和阳性菌rpsJ基因57位置的突变[26]，以及57～60位置的氨基酸替换是替加环素敏感性降低的重要机制[27]。发生rpsJ基因突变的革兰阴性菌株（大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌和链球菌）和革兰阳性菌株（金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌）进行替加环素适应性试验[26，28]，发现多种细菌通过核糖体蛋白S10来降低替加环素敏感性。核糖体蛋白S3、S10和S13相互之间非常接近四环素与核糖体亚基的结合域，核糖体蛋白S3已被证明对四环素结合域的完整性是非常重要的，因此S3蛋白的结构修饰可能会引起替加环素耐药[29]。

4 灭活酶

一种新的替加环素耐药机制与依赖黄素的单加氧酶TetX有关，TetX可羟化替加环素，降低其活性。替加环素是TetX的底物，TetX蛋白可修饰第一代及第二代四环素，它需要NADPH、Mg2+以及O2保持活性。在鲍曼不动杆菌中亦检出tetX1基因与tetX基因，并可导致鲍曼不动杆菌对替加环素耐药，其中tetX1基因仅见于对替加环素不敏感的鲍曼不动杆菌，而在敏感菌中未检出，提示tetX1 基因的存在对细菌产生替加环素耐药性有预测价值[30]，且tetX1和tetX有66%的同源序列。

5 细菌自我保护酶

5.1 甲基转移酶

在细菌中，甲基转移酶可以保护宿主基因组免受外来DNA的侵袭和干扰，且在表观遗传学和细菌耐药性中起着关键作用。trm基因编码S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）依赖性的甲基转移酶，Chen等[31]发现trm基因与细菌对替加环素敏感性降低有关，通过电转化将野生型质粒pWH-trm的trm基因分别转入鲍曼不动杆菌的trm缺陷株19606-T2和替加环素耐药株19606-T8，缺陷株19606-T2的替加环素最低抑菌浓度降低为原来的1/8，而耐药株19606-T8由耐药变为敏感。

5.2 RecA蛋白酶

RecA是细菌DNA损伤后同源基因重组和重组修复过程的重要酶。在同源基因重组过程中，该蛋白覆盖于单链DNA并引导其进入双链DNA，随后催化DNA链之间交换修复。研究人员通过构建鲍曼不动杆菌recA突变菌株，证实RecA蛋白在鲍曼不动杆菌的DNA损伤修复、抗生素耐药、一般压力反应和毒力中均发挥作用。刘男男[32]在应用亚抑制浓度的替加环素处理鲍曼不动杆菌后，标准株ATCC19606recA基因的表达增强，提示RecA蛋白酶介导鲍曼不动杆菌免于抗生素损伤中发挥重要作用，从而产生耐药。

6 细菌细胞膜的改变

6.1 磷脂的改变

基因plsC编码的磷脂转移酶，其可催化磷脂的生物合成进而参与细胞膜的合成。Li等[33]通过流式细胞仪检测到plsC基因突变导致了细胞膜的改变，细胞膜的渗透屏障动态平衡发生变化，影响了细胞膜对替加环素的渗透性，从而导致鲍曼不动杆菌的耐药，同时利用了含有plsC野生型基因的回复试验对结果进行了确认。

6.2 脂多糖的改变

脂多糖由类脂A、核心多糖、O-抗原3部分组成，而核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic acid，KDO）等组成，革兰阴性细菌都有此结构。大肠埃希菌核心多糖生物合成途径的相关基因（lpcA、 rfaE、 rfaD、 rfaC和 rfaF）的突变菌株也出现了替加环素耐药[34]，其中lpcA、 rfaE、 rfaD参与庚糖的生物合成，rfaC和rfaF可编码庚糖残基的转移蛋白。

综上所述，细菌对替加环素的耐药机制十分复杂，研究主要集中于主动外排机制中RND家族外排泵，不同菌株可出现同一种耐药机制，同一菌株又可存在不同耐药机制，有必要加强细菌及其耐药的检测，合理有效使用抗生素，并针对此类耐药菌株开发新型抗菌药物。替加环素的耐药菌主要为革兰阴性杆菌，耐药机制除了与外排泵有关，其他相关研究或可进一步深入。最新研究发现多药物耐受性在细菌病原体中的传播主要是由于所谓的“persisters”[35-36]的存在，它们是表型变体，处于休眠状态，因此不易受抗生素的影响，而抗生素只对积极生长的细胞有效。

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Current insight into the mechanisms of tigecycline resistance

WANG Jian, SHEN Jilu. （Department of Laboratory Medicine, the First Affliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, China）

R978.1

A

1009-7708 ( 2017 ) 02-0219-05

10.16718/j.1009-7708.2017.02.021

2016-04-18

2016-06-03

国家自然科学基金项目（81171618）。

安徽医科大学第一附属医院检验科，合肥 230022。

王健（1993—），男，硕士研究生，主要从事临床微生物耐药机制研究。

沈继录，E-mail：shenjilu@126.com。