宏基因组学技术在皮肤病研究中的应用进展

张芙蓉 徐宇 刘洋 杨国玲

116011大连市友谊医院皮肤科（张芙蓉）；大连医科大学（徐宇、刘洋）；大连医科大学附属第一医院皮肤科（杨国玲）

宏基因组学技术在皮肤病研究中的应用进展

张芙蓉 徐宇 刘洋 杨国玲

116011大连市友谊医院皮肤科（张芙蓉）；大连医科大学（徐宇、刘洋）；大连医科大学附属第一医院皮肤科（杨国玲）

宏基因组学（metagenomic）又称环境基因组学（environmental genomics），指不依赖培养直接从微生物的天然环境中提取微生物基因的遗传物质，对微生物群体进行研究分析，最大限度地挖掘微生物资源。传统的微生物群落检测主要依靠培养，但是菌群的种类多，99.9%培养不成功，且不同的菌种生长的条件和速度不一，导致无法真实还原微生物的原始状态［1］。宏基因组学研究与传统微生物研究方式的最大区别在于把微生物看成一个整体，摆脱了对单个微生物培养和分离的步骤，直接对环境中所有的微生物进行研究，进而可以全面地对所有微生物进行分析。它包括以下4个步骤：提取某一环境样品所有微生物的基因组DNA；直接测序探究环境中微生物的群落结构和功能；构建宏基因组文库；对文库进行筛选寻找和发现新的功能基因及活性代谢产物。目前宏基因组学技术在各个领域应用较为广泛，比如环境保护（气候、水处理、极端环境、海洋资源）、石油污染修复、生物冶金等领域已经取得了引人瞩目的成果。

一、人类宏基因组学

宏基因组学在人体疾病中的研究也有重大发现，如肠道细菌结构和数量失衡与肥胖、代谢综合征、2型糖尿病以及肠道炎症等相关；阴道菌群失调与阴道炎、口腔菌群与龋均密切相关；鼻咽部菌群改变与急性中耳炎、鼻窦炎、口腔炎、上呼吸道感染甚至肺炎等密切相关；皮肤菌群结构和丰度改变与很多皮肤疾病有关［2］。在人体的皮肤、胃肠道、鼻腔、肠道等部位定植着大量的微生物，其数量可达人体自身细胞数的10倍以上［3］。人体微生物在人体内起着较为重要的作用，如维持一定的动态平衡、调节免疫及辅助维生素合成等一系列的生理生化反应。2007年、2009年美国国立卫生研究院（NIH）提出了建立人类微生物组计划（Human Microbiome Project，HMP），共同研究人体5个不同部位（皮肤、鼻孔、口腔、肠道和阴道）的微生物群落特点，并分析其与人类健康和疾病的关系［4］。

二、宏基因组学在皮肤病研究中的应用

目前与皮肤病有关的研究主要包括皮肤微生物群落［5］及肠道微生物群落［6］。皮肤正常微生物群落指皮肤表面大量的细菌、真菌、病毒、衣原体和某些原虫，形成了独特的生态结构，主要分为放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门。根据菌群的定植特点，通常可以分为常驻菌群和暂住菌群［7］。常驻菌群是指长期定居在皮肤表面可以自我恢复的菌群，包括葡萄球菌、棒状杆菌、丙酸杆菌、不动杆菌、马拉色菌等。暂住菌群指通过接触，从外界环境中获得的一类菌群。常驻菌群在某些条件下也可以转化为致病菌群，正常的皮肤菌群平衡失调就可能导致皮肤疾病的发生。肠道菌群约500余种，分为生理性细菌、条件致病菌、病原菌三种。生理性细菌即专性厌氧菌，是肠道的优势菌群，如双歧杆菌、类杆菌、优杆菌和消化球菌等；条件致病菌为肠道非优势菌群，如肠球菌、肠杆菌；病原菌多为过路菌，长期定植的机会少，如葡萄球菌、变形杆菌、假单胞菌和韦氏梭菌等。当各菌种间比例发生超出正常范围的变化，一方面肠黏膜屏障功能可能出现障碍，另一方面肠道免疫系统也可能出现问题，从而诱发疾病。目前特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）、酒渣鼻的发病与肠道菌群失调有关。

1.AD：是运用宏基因组学研究的常见皮肤疾病之一，虽然AD是非感染性疾病，但大量实验表明，其与微生物菌群有关［5］。目前有假说认为AD与皮肤屏障、金黄色葡萄球菌及超敏反应有关［7］。宏基因组学研究显示，AD患者在发病时与发病前及治疗后相比，葡萄球菌所占比例由35%增到90%，非致病的表皮葡萄球菌数目也大大增加，且在治疗后链球菌、丙酸杆菌及棒状杆菌的数目较治疗前增加。与既往常规培养相比，宏基因组学研究结果更好地展示了菌群整体的变化［8］。这也为进一步研究菌群中各细菌间是如何相互作用提供了研究方向。Bourrain等［9］进一步利用宏基因组学技术研究了金黄色葡萄球菌与其他共生菌群的平衡在AD中的相互作用，分别比较了干燥皮损、炎症皮损及健康皮损处在水疗前以及水疗第1、10、18天皮肤菌群的改变，得出水疗前干燥皮损处较炎症皮损处金黄色葡萄球菌丰度低，通过18 d水疗，病变部位的金黄色葡萄球菌减少，在炎症及潮湿部位，细菌微生物的多样性增加。Seite等［10］利用宏基因组学技术研究发现，同一AD患者皮肤感染部位皮肤葡萄球菌的数量增加，细菌的多样性降低，经治疗后感染部位与未感染部位的菌群相似。

近年研究认为，AD的发病还与肠道菌群失调有关。宏基因组学研究肠道菌群显示，AD患儿在出生后1及12个月肠道菌群的多样性降低，出生1个月以拟杆菌门、属的多样性降低，出生后12个月以变形杆菌门的多样性降低，根据婴儿出生后1个月肠道菌群的改变可预测将来是否发生AD［6］。进一步研究表明，群落多样性的减少可能导致由非致病性微生物产生的无害抗原对固有免疫的刺激减少，影响免疫系统的发育和成熟，引起一系列过敏症状的出现［11］。West等［12］利用宏基因组学技术检测了怀孕期间的孕妇以及出生后1周、1个月及12个月婴儿肠道菌群改变，并评估了与Toll受体（TLR）-2、4的免疫反应的关系，与对照组相比，AD患儿出生后1周至1个月瘤胃球菌属丰度降低，12个月肠道菌群表现为放线菌门的α多样性降低，其母亲即孕妇在怀孕期间肠道拟杆菌门的α多样性降低，推测这些肠道菌群的丰度降低是因其潜在的免疫调节功能激发炎症细胞因子所致。Song等［13］利用宏基因组学技术检测发现，AD患者肠道普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzi）丰度增高，推测普拉梭菌的比例失调引起肠道上皮炎症，从而引发免疫反应，导致AD的发生。

2.痤疮：痤疮好发于皮脂腺旺盛的部位，主要与嗜脂性的痤疮丙酸杆菌有关［14］。采用抗生素治疗痤疮有效也支持这一结论。Bek-Thomsen等［15］采用宏基因组学技术比较了健康人与痤疮患者的菌群，发现痤疮患者毛囊内的菌群为表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌及小部分其他菌属，而健康人毛囊内仅有痤疮丙酸杆菌。这项研究结果引发一个问题：痤疮丙酸杆菌作为一共生菌是如何变成致病菌、是否与痤疮丙酸杆菌的菌种不同有关？目前少数研究对这一问题进行了解释。Fitz-Gibbon等［16］比较了49例痤疮患者与52例健康人鼻部皮脂腺单元的皮肤微生物群，结果两组痤疮丙酸杆菌相对丰度差异无统计学意义，但痤疮患者中核糖体型4（RT4）和RT5痤疮丙酸杆菌的菌株占优势，RT6菌株则主要见于正常人群的鼻部，提示RT4和RT5痤疮丙酸杆菌菌株与痤疮的发病密切相关，RT6菌株则与健康皮肤相关。Liu等［17］还对痤疮患者皮肤微生物群中的噬菌体做了研究，结果发现，噬菌体与细菌间的相互作用调节着微生物的平衡。这为将来用噬菌体治疗痤疮奠定了基础。

3.玫瑰痤疮：既往研究表明，其发病与蠕形螨有关。Murillo等［18］利用宏基因组学技术比较了毛细血管扩张组、丘疹脓疱组及健康人蠕形螨属的不同，发现丘疹脓疱组变形菌门及硬壁菌门数量增加，放线菌门的数量减少。后续研究认为，除了蠕形螨，还与幽门螺杆菌、表皮葡萄球菌、肺炎衣原体、肠道菌群等多种微生物的感染有关［19-20］。Picardo等［21］进一步研究表明，玫瑰痤疮患者皮肤微生物群落是通过激活人体的固有免疫而导致玫瑰痤疮的发生，通过促进TLR-2的表达加重炎症的产生，肠道细菌的过度增长也引起玫瑰痤疮的发生，通过去除这些细菌有利于皮损的好转。

4.疥疮：疥疮是疥螨感染所致的传染性疾病。Pearl等［22］的宏基因组学研究发现，疥螨感染的猪皮肤上葡萄球菌数量较正常猪皮肤增多。Mofiz等［23］利用宏基因组学技术比较从猪和人身上分离的疥螨线粒体基因组序列，得出两者仅有很少的遗传学不同，这可能是人和动物交叉感染的原因。

5.与病毒感染相关的肿瘤（鳞状细胞癌、日光性角化病）：宏基因组学的研究主要是对细菌微生物的研究，对真菌和病毒的研究相对少。Hannigan等［24］利用宏基因组学技术建立了皮肤的病毒微生物群。Bzhalava等［25］检测了82例皮肤鳞癌及60例日光性角化病皮损刮拭标本、82例皮肤鳞癌及72例角化棘皮瘤石蜡包埋标本以及85例皮肤鳞癌、92例日光性角化病及92例角化性棘皮瘤新鲜冰冻标本中病毒感染DNA，在4 284个病毒克隆子中，4 168个为人乳头瘤病毒（HPV）相关，其中15个为已知亚型（HPV8、HPV12、HPV20、HPV36、HPV38、HPV45、HPV57、HPV59、HPV104、HPV105、HPV107、HPV109、HPV124、HPV138、HPV147），4个为以前报道过的亚型（HPV 915 F 06 007 FD1、FA73、FA101、SE42），2个为新的亚型（SE46、SE47）。其他学者的研究也表明，宏基因组学技术能很好地鉴定HPV感染亚型［26-27］。

6.银屑病：银屑病是一种由多基因遗传、多环境因素刺激的免疫异常性慢性炎症性增生性皮肤病。文献报道，银屑病的发病与金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌有关［28-29］，化脓性链球菌抗原或超抗原通过免疫反应诱发银屑病［29］。Gao等［30］采用宏基因组学方法比较了6例银屑病患者皮损处与外观正常皮肤处菌群的变化，发现在皮损处最主要的优势群落是硬壁菌门，比外观正常皮肤和健康人皮肤增高；放线菌及丙酸杆菌属显著减少。Fahlén等［31］也采用宏基因组学方法比较了10例银屑病患者皮损处与12例正常人皮肤的菌群结构变化，结果显示，银屑病患者皮损处变形菌的比例较健康人皮肤明显增加，葡萄球菌和丙酸杆菌含量则显著低于健康人皮肤，且链球菌属的比例不同，其中银屑病皮损处占32%，而健康对照为26%。这些研究提示，银屑病皮损菌群结构有别于健康人皮肤。而在一项针对银屑病皮损部位真菌群落的分析研究中，应用马拉色菌种特异性引物建立rRNA基因的克隆文库，结果显示，正常人与银屑病患者皮损中的真菌群落分布差异无统计学意义，提示皮肤马拉色菌群落特征可能更多和宿主个体有关，在银屑病发病中的影响甚微［32］。以上研究结果表明，细菌与真菌微生物群落的变化与银屑病的关系尚不肯定，有待于更深入的研究。

7.头皮屑：既往认为头皮屑和脂溢性皮炎是同一病谱疾病。马拉色菌感染被认为是导致头皮屑的重要因素。新近研究认为，头皮屑不仅与真菌有关，可能还与头皮表面微生态的失衡有关。头皮的微生物群主要由细菌和真菌等组成，主要包括葡萄球菌、丙酸杆菌和马拉色菌［33］。法国学者Clavaud等［34］利用宏基因组学技术发现，头皮屑患者与健康人微生物群落不同，主要表现在痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌和限制性马拉色菌的不同，头皮屑患者的限制性马拉色菌和表皮葡萄球菌数目增加，痤疮丙酸杆菌却显著减少，且同一个体的头皮屑部位与正常部位相比也存在这一差异，表明头皮屑与头皮表面的微生物菌群平衡有关。我国学者也利用宏基因组学技术对中国的头皮屑患者做了类似的研究，得出与Clavaud等同样的结论［35］。Park等［36］的研究表明，头皮屑患者头皮的主要真菌为担子菌门，而正常人头皮常见的真菌为子囊菌门。

8.慢性伤口：正常伤口的修复在3～14 d完成，但对于糖尿病、老年人、卧床者、免疫性疾病患者等的皮肤伤口，由于皮肤组织出血、坏死，含氧量低，易于细菌大量繁殖，引发持续的慢性炎症，使伤口难以愈合。应用常规培养和宏基因组学技术分析发现，慢性伤口处皮肤微生物的多样性较正常皮肤明显［37］。Gardner等［38］利用宏基因组学技术分析了糖尿病足皮肤溃疡微生物与临床症状的关系，得出溃疡的深度与厌氧菌的数量有关，与葡萄球菌的数量无关；溃疡持续的时间与细菌的丰度、变形菌门的数量有关，与葡萄球菌的数量无关。Sprockett等［39］分析了静脉曲张患者腿部溃疡在治疗过程中每周微生物定植的数量、菌群结构及多样性的改变，结果显示，在治疗前、治疗中及治愈后这3个阶段菌群表现有极大不同。

9.腋臭：腋臭的发病除了与顶泌汗腺的分泌、遗传等有关，腋部微生物群成为发病机制研究的另一方向。传统的培养技术认为，腋部微生物主要包括葡萄球菌类、微球菌类和棒状杆菌属、丙酸杆菌属。其中棒状杆菌被认为是腋臭主要的致病原［40］。Callewaert等［41］采用宏基因组学技术观察了53例健康人腋部微生物群落的特点，得出腋部菌群主要为葡萄球菌及棒状杆菌，女性以葡萄球菌为主，男性以棒状杆菌为主，每个个体的腋部微生物菌群不同，左右腋窝菌群相同的约占一半。腋部菌群相对稳定，除臭剂影响腋部菌群的多样性。Troccaz等［42］采用宏基因组学技术比较了13例使用除汗剂（女7例、男6例）及11例未使用除汗剂（女6例、男5例）的腋部菌群，得出与上述研究类似的结论：未使用除汗剂的腋部微生物菌群以硬壁菌门及放线菌门为主，其中96%的为葡萄球菌属、棒状杆菌属及丙酸杆菌属；男、女腋部菌群不同，棒状杆菌与体味有关，丙酸杆菌与体味无关。

10.癌症恶病质：这虽不是皮肤科一种常见疾病，但对于皮肤肿瘤晚期患者也存在癌症恶病质现象。Li等［43］比较了癌症恶病质患者与健康人皮肤微生物群落的不同，得出癌症恶病质患者菌群的丰度降低，且棒状杆菌的数量明显减少。这一结论对于微生物群落与症状间的联系有预见作用。

三、结语

宏基因组学在皮肤病研究中的应用揭示了令人惊讶的微生物群落与疾病的关系，随之而来许多问题也摆在我们的面前：除了皮肤及肠道的菌群与某些皮肤病有关，其他部位的菌群失调是否也与皮肤病有关？这些菌群变化与疾病的发生有何联系？纵观上述几类疾病，宏基因组学研究适用于微生物群落的研究，除了感染性疾病，非感染性疾病中哪些疾病适用于该方法来研究？这也是一个值得思考的问题。目前因菌群之间相互作用的机制尚不明确，限制了将该技术应用于皮肤病的诊断、治疗和预后。已有的研究仅仅是宏基因组学在皮肤病应用的开端，有很多研究有待更深入的探索。

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2017中国中西医结合皮肤性病学术年会将于4月在珠海召开

经中国中西医结合学会批准，中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会定于2017年4月20-24日在珠海维景国际大酒店召开中国中西医结合皮肤性病学术年会。此次会议将发扬历次年会的优良传统，注重中西医结合治疗皮肤病的新方法及新的研究进展等方面的学术交流，内容密切联系临床，切合皮肤科医师的实际需求，会议将邀请知名专家做特邀演讲，阐述皮肤科相关领域的最新研究进展，创造形式多样、内容充实、紧张热烈、活跃互动的学术交流形式，达到全国皮肤科中医、西医、中西医结合医师共同展现才华、获取知识和信息、增进友谊的目的。

联系方式：上海市黄浦区成都北路500号峻岭广场19楼1908室，上海长征医院《中国真菌学杂志》编辑部，邮编：200003，Email：pfkxh@126.com，联系人：施慧，021-81885497，手机：13764560811。

杨国玲，Email：yanggl@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.03.021

2016-06-20）

（本文编辑：颜艳）