阿司匹林治疗绝经后骨质疏松症的实验研究进展

苏菲 桑宏勋

第四军医大学西京医院骨科，陕西 西安 710032

骨质疏松症是一种全身性、代谢性骨骼系统疾病，其病理特征为骨量降低、骨微细结构破坏、骨脆性增加，骨强度下降，易发生骨折；与年龄、性别、种族等因素密切相关，绝经后妇女多发[1]。绝经后骨质疏松(POP)是由于妇女绝经后，卵巢功能衰退，体内雌激素水平随之下降，雌激素的骨骼效应消除后，破骨细胞的骨吸收大于成骨细胞的骨形成作用导致的骨质疏松[2]。尤其绝经后妇女的骨质疏松症和骨折并发症发病率更高，男女比率约1∶8[3]。目前，骨质疏松性骨折的治疗包括外科干预、积极应用药物治疗及功能锻炼等。治疗骨质疏松药物种类很多，但存在着许多的问题，如副作用较大，费用较高等。

阿司匹林(Aspirin)是一种历史悠久的解热镇痛药，早在公元前5世纪，古希腊医生希波克拉底已从柳树皮提取的苦味粉末用来镇痛、退烧。传统临床应用中， 解热镇痛、消炎抗风湿是其常用的范畴，后来又发现其有抗凝血、消炎等作用，从而应用于心脑血管疾病中，降低心脑血管疾病的发生率及死亡率[4-7]。这一百年老药的新用途仍在不断地被发现和应用。阿司匹林临床上还可用来治疗糖尿病[8]、抗肿瘤[9]、防治老年性白内障、治疗胆道蛔虫病、提高妊娠成功率、降低流产发生。此外阿司匹林在农业上有抗旱能力，提高种子发芽率，预防农作物病害，减少作物落花落果，改善农作物品质，提高农作物产量等作用。

近年来，流行病学研究发现阿司匹林可提高老年人的骨密度[10,11]，从而推断其可治疗绝经后骨质疏松症。阿司匹林有多种生物学途径，如有抑制COX1、COX2和PG2活动等，目前还没能完全阐明阿司匹林治疗绝经后骨质疏松详细的功能机 制，有以下多种可能与治疗骨质疏松相关的生物学途径：①抑制Fas抗体诱导骨髓间质干细胞的死亡，诱导活化的T细胞的死亡；②抑制去势小鼠成纤维细胞集落单位的生成和诱导骨髓间质干细胞的增殖；③增加Runx2基因的表达，从而提高骨髓间质干细胞端粒酶活性和长度；④降低酸性磷酸酶活性；⑤减少RANKL表达，增加OPG的水平；⑥加速退化磷酸β-蛋白的降解，增加Wnt信号的水平[12]。在此方面，实验研究取得了一定进展。阿司匹林是一种老药，不但副作用较少、廉价，而且治疗疾病的范围广。因此探讨阿司匹林对骨质疏松的作用及其机制意义重大，笔者将对阿司匹林治疗绝经后骨质疏松的实验研究进展做一综述。

1 POP动物模型的构建

目前构建POP的动物模型多使用Sprague-Dawley(SD)或者Wistar雌性大鼠，在适当的实验条件下适应一段时间，通过摘除双侧卵巢模拟女性绝经，摘除卵巢后的雌性大鼠，因雌激素下降，形成以松质骨丢失为主的高转换型骨质疏松症，这一特点与临床绝经后骨质疏松的病理机制相似[13-15]。

2 阿司匹林治疗绝经后骨质疏松的实验研究

2.1 在体实验

在体实验研究发现，阿司匹林对骨质疏松大鼠的骨密度、骨组织形态学及骨生物力学、骨代谢指标等均有调节作用。

2.1.1提高骨密度：Yamaza等[12]用低剂量阿司匹林研究其对去势鼠的骨密度影响。对3月龄的去势鼠进行为期3个月低剂量阿司匹林治疗，然后使用显微CT分析发现，阿司匹林治疗组显著改善去势小鼠骨小梁和皮质骨密度。Chen等[16]通过动物实验探讨阿司匹林对绝经后骨质疏松症的治疗作用。将40只3月龄SD雌性大鼠随机分成5组:对照组(Sham)、去势组(OVX)及3个阿司匹林治疗组(Aspirin)。OVX及Aspirin组采用卵巢切除法去势,饲养3个月建立骨质疏松模型。3个阿司匹林治疗组分别为8.93、26.79及80.36 mg/kg(A1、A2及A3),每天灌胃1次，连续灌胃3个月，Sham组和 OVX 组每天用等量的生理盐水灌胃3个月。双能X线吸收骨密度测量仪(DXA)及Micro-CT测量结果显示：3个阿司匹林治疗组腰4椎体骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数量均显著高于OVX组，且与Sham组相近。表明阿司匹林可以有效地促进大鼠绝经后骨质疏松骨小梁的改建,改善骨小梁的三维结构，增加骨质的骨密度。Huang 等[17]通过去势大鼠骨质疏松性骨折愈合模型，探讨阿司匹林对绝经后骨质疏松的影响。将60只3月龄雌性Wistar大鼠，随机分成去势组50只，假手术组5只和空白组5只，构建去势大鼠骨质疏松模型。确认模型成功后，将去势组大鼠全部造成左侧股骨中点骨折，用克氏针髓内固定。再将制成骨折模型的50只大鼠，随机分成A组和B组(每组25只)，A组给予阿司匹林灌胃，33 mg/次，1次/d，B组给予等量生理盐水。两组分别于骨折术后测定骨密度值，然后处死取骨痂，行骨痂组织学检查，8、12 w行放射学观察。两组剩余的5只大鼠于12 w时行左股骨生物力学测定。结果显示阿司匹林组各时间点骨密度均高于对照组，差异有统计学意义。

2.1.2改善骨组织形态学及骨生物力学：Chen等[16]通过动物实验也证实阿司匹林可以有效地促进大鼠绝经后骨质疏松骨小梁的改建，改善骨小梁的三维结构，增加骨质的骨密度和力学强度。Huang等[17]实验结果显示，组织学观察到HE染色,阿司匹林组软骨内成骨过程较对照组加快；生物力学测定显示，术后12 w，阿司匹林组左侧股骨的三点弯曲载荷高于对照组，差异有统计学意义。从而证明阿司匹林能够促进去势大鼠骨质疏松性骨折愈合，增加骨质的骨密度和生物力学强度。Yao等[18]观察阿司匹林对于趋势大鼠骨质疏松的影响，探究不同剂量及不同时期口服阿司匹林对骨质疏松的辅助治疗作用。取42只6个月龄的雌性Wistar大鼠，随机选取6只作为假手术组(A)，余36只作为去势组。去势组分为阿司匹林预防组：去势对照组(B)，去势阿司匹林(8.92 mg/kg)组(C)，去势阿司匹林(26.75 mg/kg)组(D)和阿司匹林治疗组：去势对照(E)，阿司匹林(8.92 mg/kg)组(F)，阿司匹林组(26.75 mg/kg)组(G)。预防组于去势后3 d给予不同剂量阿司匹林灌胃，治疗组于去势后12 w灌胃。对42只大鼠双侧股骨干进行取材，对双侧股骨干行生物力学测定。结果显示预防部分与治疗部分的去势对照组较假手术组、去势8.92 mg/kg组及去势26.75 mg/kg的三点弯曲载荷显著降低(P<0.05)。预防组与治疗组同剂量间比较，预防组的最大破坏应力指标高于治疗组(P<0.05)。表明早期应用阿司匹林能增加去势大鼠的骨密度,增加骨质生物力学强度。Wang等[19]研究阿司匹林对去势大鼠腰椎微观结构的影响。取48只3月龄SD雌性大鼠随机分为6组：去势组(OVX组)、对照组(Sham组)及4个阿司匹林治疗组(Aspirin组)，每组8只。OVX组及Aspirin组采用卵巢切除法建立骨质疏松模型。去势后1w，阿司匹林治疗组剂量分别为2.25、4.46、8.92及26.75 mg/kg(A1、A2、A3及A4组)，每天灌胃1次，OVX组及Sham组予同等量生理盐水灌胃。灌胃3个月后处死取腰椎椎体，以Micro-CT进行测量分析。Micro-CT分析表明：与OVX组比较,阿司匹林各剂量组骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、骨密度(BMD)均显著性提高(P<0.01)，骨表面积骨体积比(BS/BV)、骨小梁分离度(Tb.Sp)显著性降低(P<0.01)，阿司匹林各剂量组BV/TV、BS/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、BMD与Sham组相比有统计学差异(P<0.01)。表明阿司匹林可以改善去势大鼠骨小梁结构，增加骨质密度，对去势大鼠骨质疏松具有防治作用。

2.1.3改善骨代谢生化指标：Wang等[20]研究阿司匹林预防去势大鼠骨质疏松的作用及机制。实验动物分组及干预同文献[10]，去势大鼠灌胃3个月后观察血清骨源性碱性磷酸酶及骨钙素水平。结果显示与OVX组比较，8.92及26.75 mg /kg剂量阿司匹林组骨源性碱性磷酸酶显著降低(P<0.05)。4.46、8.92及26.75 mg /kg剂量阿司匹林组骨钙素与Sham组相比显著升高(P<0.05)。提示阿司匹林治疗绝经后骨质疏松的发生机制可能是通过抑制骨吸收及刺激骨形成发挥作用。

2.1.4调节相关细胞因子表达：Yang等[21]探讨阿司匹林对去卵巢骨质疏松模型鼠体内白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)表达的影响，以及其防治骨质疏松的作用。选取Sprague-Dawley大鼠60只,随机分为对照组(10只)和去卵巢模型组(50只)，术后1 w去卵巢模型组大鼠再随机分为骨质疏松组，其中,A组(0.25 mmol/L阿司匹林)、B组(0.5 mmol/L)、C组(1.0 mmol/L)和D组(1.5 mmol/L),各10只。检测各组血清和骨组织IL-1、IL-6、TNF-α和M-CSF水平，同时采用Micro-CT对骨小梁微观三维形态结构进行分析。结果骨质疏松组血清IL-1、IL-6、TNF-α、M-CSF分别为80.15±7.18、82.16±6.63、30.21±4.73 pg/mL和11.42±4.25 pg/mL，均明显高于对照组(P<0.05)。A、 B、 C、D组中，D组IL-1、IL-6、TNF-α和M-CSF水平最低(P<0.05)。骨质疏松组骨组织IL-1、IL-6、TNF-α和M-CSF分别为71.24±8.10、78.02±5.15、26.92±3.23pg/mL和(10.22±3.15)pg/mL，均明显高于对照组(P<0.05)；A、B、C、D组中，D组IL-1、IL-6、TNF-α和M-CSF水平最低(P<0.05)。提示阿司匹林能抑制去势大鼠骨流失，这可能与阿司匹林抑制大鼠血清和骨组织IL-1、IL-6,、TNF-α和M-CSF的表达有关，从而使破骨活动减弱的作用。

2.2 离体实验

2.2.1促进成骨细胞表达：Feng等[22]通过体外试验研究阿司匹林对骨髓基质细胞成骨性分化的影响。培养SD大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)，传代3次后进行成骨诱导分化，诱导培养基中加入不同浓度阿司匹林(0.5、1、2、5、10 mmol/L)，同时设立对照组。采用cck-8法分析细胞增殖情况。比较阿司匹林组与对照组在细胞碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(OC)分泌量、钙结节染色等方面的成骨性差异。结果显示阿司匹林无促进细胞增殖活性，而高浓度阿司匹林能够强烈抑制细胞增殖。0.5、1、2 mmol/L浓度阿司匹林可促进BMSCs的成骨性分化，中低浓度组碱性磷酸酶含量、骨钙素分泌量在不同阶段显著高于对照组。14d茜素红染色可见中低浓度组钙结节数量高于对照组。提示中低浓度阿司匹林作用于骨髓基质细胞可促进其成骨细胞特性表达,表明阿司匹林有促进骨代谢合成的作用。

2.2.2抑制破骨细胞分化成熟：Zhang等[23]研究不同浓度阿司匹林对体外培养大鼠破骨细胞(Osteoclast, OC)分化成熟及骨吸收活性的影响。建立由核激活因子受体配体(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolony stimulating factor, M-CSF)共同作用的大鼠破骨细胞骨髓诱导体系，将雌激素(10～6 mmol/L)和不同浓度的阿司匹林(0.25、0.5、1.0、1.5 mmol/L)分别作用于破骨细胞。诱导培养后分别对破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色，观察细胞形态并计数破骨样细胞数量；将各组破骨细胞接种于骨磨片上，建立破骨细胞-骨磨片活性分析模型，于不同时间点对骨磨片进行光镜和扫描电镜观察，分析计算骨吸收陷窝面积。结果显示随着阿司匹林浓度的增加，阿司匹林组TRAP阳性多核破骨细胞数量、骨吸收陷窝面积逐渐减少直至消失。与雌激素组相比，低浓度阿司匹林组(0.25 mmol/L)没有明显差异；但中、高浓度阿司匹林实验组(0.5、1.0、1.5 mmol/L)破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积减少，差异有统计学意义(P<0.05)。表明阿司匹林可抑制破骨细胞的分化成熟及骨吸收功能，且呈剂量依赖性。

2.2.3抑制破骨细胞RANK表达：Zhang等[24]体外试验研究不同浓度阿司匹林对体外培养大鼠破骨细胞(osteoclast, OC)RANK(receptor activator of nuclear factor-κB,核因子κB受体活化因子)表达的影响。采用RANKL和M-CSF诱导大鼠骨髓单核巨噬细胞破骨分化模型,给予不同浓度的阿司匹林(0.25、0.5、1.0、1.5 mmol/L)和雌激素(雌二醇10～6 mmol/L)处理，而后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色观察细胞形态特征，扫描电镜观察骨磨片破骨细胞骨吸收陷窝，RT-PCR技术检测破骨细胞表面RANK基因的表达，ELISA法检测RANK蛋白的表达。结果示阿司匹林和雌激素都可以使大鼠破骨细胞成熟分化程度和骨吸收活性降低，抑制破骨细胞RANK基因和蛋白的表达，且阿司匹林的抑制作用具有剂量依赖性。表明阿司匹林对大鼠破骨细胞RANK的表达有抑制作用且呈剂量依赖性，从而抑制破骨细胞的成熟分化及骨吸收功能。

2.2.4抑制破骨细胞相关信号通道：Zeng等[25]通过离体实验探讨阿司匹林对破骨细胞生成的影响及其分子机制。体外培养RAW264.7细胞,以100 ng/mL核激活因子κB(NF-κB)受体配体(RANKL)诱导培养，并同时添加不同溶度的阿司匹林(0、0.25、0.5、1.0、1.5 mmol/L)培养5d。在不同时间点,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色的方法来观察破骨细胞诱导生成能力，用实时荧光PCR方法检测其破骨细胞系标志基因，包括组织蛋白酶K(CTSK)、TRAP、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和降钙素受体(CTR)mRNA的表达。裂解不同培养条件的细胞并提取蛋白上样，行Western印迹检测NF-κB通道蛋白的表达以及有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPKS)通道蛋白的表达，通过免疫荧光的方法分析确定NF-κB的P65的核易位。结果显示阿司匹林抑制RANKL诱导的破骨细胞生成,随着阿司匹林浓度增加，破骨细胞形成数量明显减少；其标志性基因TRAP、CTSK、MMP9及CTR的mRNA表达均有所下调；磷酸化的P65、P50、IKB-a、P38以及氨基端激酶(C-JNK)和胞外信号调节蛋白激酶(ERK)蛋白表达均有所减少，而其非磷酸化的蛋白表达水平无明显变化。阿司匹林同时对NF-KB P65的核易位也表现出抑制效果。表明在RAW264.7细胞系中,阿司匹林通过抑制NF-κB系统(P65、P50、IKB-a)和MAPKS系统(P38、C-JNK和ERK)通道的激活来抑制破骨细胞的生成，从而发挥治疗骨质疏松的作用，且在一定范围内和阿司匹林浓度呈正相关。

3 小结

大量动物体内试验及离体实验研究表明，阿司匹林治疗绝经后骨质疏松症疗效肯定，主要表现为阿司匹林可提高去势大鼠骨密度(BMD)值，显著改善骨组织形态学、骨生物力学、骨代谢生化指标、骨代谢密切相关的细胞因子水平，影响骨质疏松发生机制的信号通路转导。且阿司匹林治疗骨质疏松具有双向良性调节作用，既可达到与外源性雌激素相同的效果，又可避免外源性雌激素过量所出现的副作用[26]。

近年来，阿司匹林治疗绝经后骨质疏松的实验虽然取得了较大进展，但尚存在以下问题：第一，阿司匹林治疗绝经后骨质疏松的作用机理尚未完全阐明，目前已从骨代谢、细胞因子水平及破骨细胞相关标志基因表达水平等方面对其作用机制做了初步探讨，下一步可继续从破骨细胞及成骨细胞相关信号通路、基因水平等方面入手进行更深入的研究，以揭示阿司匹林促进骨形成、抑制骨吸收的效应机制。第二，仍需进一步通过流行病学确定阿司匹林治疗骨质疏松的剂量多少及疗程多长才能达到有佳疗效。从而为阿司匹林这一老药治疗绝经后骨质疏松症提供更多的研究基础。