脱毒马铃薯试管微型薯繁育技术

马纪

（黑龙江农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江哈尔滨 150086）

脱毒马铃薯试管微型薯繁育技术

马纪

（黑龙江农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江哈尔滨 150086）

马铃薯受到病毒的感染后会出现退化现象，进而降低马铃薯的产量。通过对马铃薯进行脱毒，并使用试管微型薯繁殖技术培养无毒的马铃薯种子，可大大提高马铃薯的产量，保证马铃薯的品质。本文对马铃薯脱毒技术进行分析的基础上，明确脱毒马铃薯试管微型薯繁殖技术要点，并对马铃薯繁殖技术中病毒检测方法进行了讨论，以期促进脱毒马铃薯试管微型薯繁殖技术的发展，提高马铃薯的经济效益。

脱毒马铃薯；试管微型薯繁殖技术；茎尖脱毒；病毒检测

马铃薯是茄科茄属的双子叶种子植物，生产上绝大多数使用块茎进行无性繁殖。马铃薯受到病毒的侵染会出现退化现象，主要表现为花叶、卷叶、束顶等症状。病毒会使植株生长速度减缓，叶片卷曲坏死，块茎变小、变尖、龟裂、内部网状坏死等，甚至会失去发芽能力，不能作为种子使用。病毒会逐年积累，病情会逐年加重，造成马铃薯严重减产。研究发现，侵染马铃薯的病毒有18种，其中9种是专门存在于马铃薯上的。

当前解决因病毒引起的马铃薯退化问题，就培育无毒种薯，其中最行之有效的方法就是茎尖脱毒。马铃薯脱毒种薯是经薯块室内催芽、切取茎尖分生组织、试管苗培养、切段快繁等一系列技术措施后获得的，笔者结合多年研究、实践操作经验，总结出一套高效的脱毒马铃薯试管微型薯繁殖技术要点。

1 脱毒马铃薯试管微型薯繁殖技术要点

脱毒马铃薯试管微型薯繁殖技术要点：先将带毒薯块进行催芽和消毒处理，然后在无菌条件下切取茎尖分生区组织，在试管中进行培养，分生区组织生长4个月，待茎尖分生区组织长成植物苗后，对试管苗进行病毒检测，从中鉴定出不带病毒的脱毒苗，再进行切断快繁，后进行诱导、良种繁殖，最后选出具有原品种特性的脱毒马铃薯，从而实现复壮的目的。

1.1 马铃薯茎尖分生组织诱导成脱毒苗

使用马铃薯茎尖分生区组织进行体细胞培养。利用0.2mm左右、有2个叶原基的茎尖作为外植体，经过分化发育成为植株。对马铃薯茎尖进行培养，通常有两种方式。一种是对茎尖腋芽进行诱导，成为植株；或者通过对不定芽进行诱导，分化生成植株。对茎尖腋芽进行诱导，可以直接生成植株。不定腋芽进行诱导生成植物体需要经历对愈伤组织诱导分化的程序，先分化成丛生芽，然后再对丛生芽进行诱导获得植株。对马铃薯茎尖脱毒一般使用第一种方法进行诱导。在剥离茎尖和接种时，要对块茎芽进行严格消毒，接种马铃薯的培养基上不含任何激素，培养环境保持25℃，每天保持12h光照，经过25d左右，小苗长成4～5个小叶片，将其剪断成单节段，并转移到无激素的MS培养基上。使用相同的方法扩繁1～2个周期，等到小苗达到一定数量时，再使用这些小苗剥离茎尖，这样可以增加苗的成活率。

1.2 影响马铃薯茎尖脱毒成功率的因素

茎尖成苗率和小苗的脱毒率都对茎尖组织培养成功率产生影响，小苗的脱毒率是保障优质脱毒种薯成功率的关键。茎尖大小、温度、培养基成分是影响马铃薯茎尖脱毒成功的主要因素。

1.2.1 茎尖大小

Mellor和StaceSmith研究了茎尖大小对X病毒去除的影响，研究显示茎尖大小会对茎尖培养的脱毒率产生影响，茎尖越小，外植体所含的病毒量越少，脱毒成功率就越高，但不易成苗[3]。

1.2.2 温度

Kassanis最早发现了高温会造成病毒失活，他研究发现马铃薯茎在38℃下20d左右，其茎上的马铃薯卷叶病毒就消失了，可以获得无卷叶病的植物。需要进行茎尖培养时，可以通过高温处理来除去一些病毒，可以提高马铃薯脱毒率[4]。

1.2.3 培养基成分

培养基的成分也会对马铃薯茎尖培养的成苗率产生影响，适当含量的钾离子和铵离子可以满足茎尖生长发育的需要，提高脱毒成功率。通过加入病毒抑制剂能够提高茎尖培养的脱毒效果，Lasky R.E在培养基中加入10mg/L病毒痤，发现培养基中马铃薯茎尖再生植株中80%已经没有PVX，说明培养基中加入病毒痤对PVX具有一定的破坏性[5]。

1.3 马铃薯脱毒苗的无土扦插快繁和脱毒试管微型薯的生产

1.3.1 马铃薯脱毒苗的无土扦插快繁技术

使用蛭石和炉渣作为基质，施加适量氮磷钾肥、生物有机肥和营养液，一般配比70%的蛭石炉渣、30%的生物有机肥，每立方米添加100g磷酸二胺，并且需要定时添加营养液，保证基质内营养充足，营养液中氮、磷、钾、钙、镁等元素要搭配适当。

扦插的时间会对脱毒苗生根产生影响，这主要是受到温度的影响，温度越高生根天数越少，温度越低，生根天数越多，但是温度过高会造成扦插苗成活率降低。研究表明，最佳的扦插苗温度为（20±7）℃。在扦插苗实验中，遮荫会降低生根率，但是可以提高成活率，因此，温度和光照都对生根和成活有着重要影响。

1.3.2 马铃薯脱毒微型薯的生产

脱毒微型薯是指使用组织培养方法获得的脱毒试管苗。激素和病虫害都会影响微型薯成活率，在进行微型薯生产时，要对密度、光照、水肥、病虫害、激素等进行分析，从而获得健壮的马铃薯脱毒苗。可以采用4次剪尖和4次培土的方法，在80d单株结薯10.6个，110d单株商品粒数大于1g的达到8.7个，通过剪尖培土，可以增加结薯数量。

利用无土栽培技术和组织培养技术以及快速繁殖技术相结合，可以快速生产出无病毒种薯。使用比重轻的固体材料作为基质，多种营养液可以保证脱毒苗所需的充足的水分和养分，利用人工控制可以在较短时间内结薯。马铃薯脱毒微型薯生产技术使用设备简单、成本低、可以工厂化生产，在近年来发展比较快。通过无土栽培可以在植物生长到合适程度，对植物体内化学物质的转化进行调整，可以促进匍匐茎发育膨胀，外界环境可以对植物体内的化学物质转化产生影响。

马铃薯生长环境对马铃薯生长具有较大影响，环境温度、湿度、温差、光照、营养成分、N、P、K营养元素的比例都会对匍匐茎的生长产生影响。谢庆华[7]通过4次剪尖和4次培土，研究发现，通过增加剪尖和培土次数能够提高马铃薯的产量。梁东超对扦插时期的环境因素进行研究，结果表明扦插时期、光照和马铃薯密度都会对马铃薯生产造成影响。不同的扦插时期，会对马铃薯产量产生影响。光照对温度产生影响，进而对试管苗生根产生影响[8]。

1980年前后，我国使用日本通用配方和K5营养液进行马铃薯培养，在1990年之后对配方进行了改进。李文刚[6]发现B9会对茎膨大结薯产生直接影响，能够促进结薯。

2 脱毒马铃薯的病毒检测

马铃薯病毒对马铃薯产量具有重要影响。20世纪80年代马铃薯病毒检测有了新的进步，马铃薯病毒的分离和鉴定技术得到发展。马铃薯病毒鉴定技术经过生物学鉴定法、化学鉴定法发展到血清鉴定法、ELISA、PCR检测等，普遍使用的鉴定方法有ELISA检测方法和PCR检测方法。

ELISA检测方法：ELISA检测过程中参照试剂使用说明，样品研磨后，加入1mL缓冲液，4000rp离心3min，在所设置的阴阳两个对照孔中分别加入100μL阴性和阳性对照液，37℃孵育3h，洗板后加入100μL IgG-AP，37℃孵育2h，洗板后加入100μL底物溶液，37℃孵育20min。在酶标仪450nm波长处测定待检样品和对照样品的OD值进行检测。利用病毒颗粒可以同抗体在离体的情况下发生反应，通过酶能够对这个反应进行检测，从而可以判断是否含有病毒。值得注意的是ELISA技术检测的目标是PVS的CP蛋白，但PVS经常变异，一旦变异，检测中如试剂盒抗体为单克隆抗体，多会出现漏诊，因此ELISA试剂盒抗体中，单克隆抗体需涵盖所有基因类型，多克隆抗体应拥有更宽检测范围，这样才能避免检测中出现漏诊。

PCR检测技术：PCR检测技术是随着分子生物学的发展而发展起来的技术，检测过程中需按照总RNA提取→cDNA合成→PCR扩增→扩增产物检测→限制性片段长度多态性（RFLP）分析这样的检测流程进行，这种检测方法可以在体外迅速将目标DNA大量扩增。PCR检测技术不用制作抗血清，并且检测准确度高，能够有效地对植物病毒进行检测，是一种新型的分子检测方法。但是RT-PCR检测过程中，检测人员需经常性对检测引物进行改进，这样才能确保RT-PCR检测的广谱适应性，确保RT-PCR可对病毒所有株系进行有效检测。PCR技术凭借独特的优势，在植物病毒检测方面发展迅速，该项检测技术被应用于梨果病毒检测、小麦花叶病毒检测、马铃薯病毒检测等。

总而言之，使用脱毒技术进行马铃薯试管微型薯繁殖，对繁殖周期和植物生长环境的要求比较低，同时能够有效保障和提高马铃薯种薯的质量，有利于培养和快速推广马铃薯新品种。同时也减少了马铃薯的使用量，能够很大程度上降低马铃薯的生产成本，改变了传统的马铃薯生产体系，对全球马铃薯生产具有重要影响。

[1]Morral J E,Ashby MF.Dislocated cellular structures[J].Scripta Metallurgica,1974,22(5):567-575.

[2]刘卫平.马铃薯试管苗新的快速繁殖方法研究[J].中国马铃薯,2000,(3):141-142.

[3]Mellor F C,Stacesmith R,Krczal H.Influence of heat therapy on rooting of,and elimination of raspberry bushy dwarf virus from,shoot cuttings of red raspberry.[J].Polymer Bulletin,1976,6(7):351-358.

[4]KASSANIS.Heat Inactvation of Leaf-Roll virus in potato tubers [J].Annals ofApplied Biology,1950,37(37):339-341.

[5]Lasky R E,Lechtig A,Delgado H,et al.Birth weight and psychomotor performance in rural Guatemala[J].American Journal of Diseases ofChildren,1975,129(5):566.

[6]李文刚,梁东超,杜保社,等.马铃薯脱毒微型种薯生产及其繁育推广体系——铃田模式[J].中国马铃薯,2002,16(2):92-94.

[7]谢庆华,吴毅歆,张勇飞,等.脱毒马铃薯试管苗剪尖扦插无土繁殖研究[J].中国马铃薯,2000,(3):135-137.

[8]梁东超.扦插时期、光照与密度等条件在马铃薯微型薯生产中的影响[J].中国马铃薯,1998,(2):77-79.

The Test Tube Micro Potato Propagation Technology of Virus-free Potato

MA Ji
(Academy of Agricultural Sciences Plant Virus-free Seedling Research Institute of Heilongjiang Province,Harbin 150086,China)

The potato will be degraded by the invasion of the virus,which will affect the yield of potato.The test tube micro potato propagation technology,with breeding technology,and the cultivation of potato varieties,can accelerate the promotion of new varieties of potato,potato to reduce production costs,and improve the quality of potato.Based on virusfree technology analyzed,the author researched the test tube micro potato propagation technology,and analyzed breeding technology of virus detection methods,in order to promote the development of reproduction technology of virus-free potato microtuber,promote potato production efficiency.

Virus-free potato;test tube micro potato propagation technology;Shoot tip detoxification;virus detection

S532

A

1008-1038(2017)05-0073-03

10.19590/j.cnki.1008-1038.2017.05.022

2016-12-26

马纪（1967—）女，副研究员，研究方向为脱毒马铃薯试管苗及微型薯栽培