响应面法优化腰果蛋白提取工艺

张晶晶，李 萧,姚广龙,曹献英,陈 健

(海南大学食品学院,海南海口 570228)



响应面法优化腰果蛋白提取工艺

张晶晶，李 萧,姚广龙,曹献英,陈 健*

(海南大学食品学院,海南海口 570228)

本实验以海南盛产的腰果为原料,以料液比、提取液pH、提取温度、提取时间为因子,应用单因素及响应面实验优化腰果蛋白碱溶酸沉法提取的工艺条件。结果表明:当料液比为1∶50(g/mL),pH为11,温度为40 ℃,浸提时间为1.5 h时,腰果蛋白质的提取率最高,可达87.1%±1.05%。所得腰果蛋白提取回归模型高度显著(R2=0.9406),拟合性好,可用于预测蛋白提取率。

腰果蛋白,响应面优化,碱溶酸沉法,工艺参数

腰果,一种肾形坚果,有丰富的营养价值,是世界著名四大干果之一。通过对几种重要坚果的营养性分析发现腰果蛋白的氨基酸模式与人体氨基酸模式非常接近,是一种价值很高的优质蛋白质。其蛋白质含量可高达21%,是一般谷类作物的2倍之多,氨基酸的种类也与其他谷类作物的氨基酸种类互补,是一种具有高营养价值的食物[1-3]。研究[4-5]表明除色氨酸外,腰果蛋白中富含17种氨基酸,其中包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸等7种人体必需氨基酸,且含量皆高于FAO/WHO/UNO成人推荐标准。非必需氨基酸中的谷氨酸和精氨酸含量较高。Ribeiro[6]等研究认为可将浓缩腰果蛋白作为营养添加剂添加到食品中,增强食物的营养;还可以作为功能性食品,改善人体由于缺少蛋白质而引起的一些疾病等的情况。因此,腰果蛋白作为一种优质的植物蛋白资源,具有极大的开发潜力。

目前有关腰果的研究主要集中在对腰果油、腰果酚等的报道[7]以及一些加工工艺上。对腰果中蛋白质的综合利用还鲜有研究。Bora[8]等比较研究天然腰果蛋白和变性蛋白功能性质的区别。Yuliana[9]等研究pH和NaCl对腰果壳分离蛋白功能性质的影响。尽管有一些腰果蛋白功能性质的研究报道,但关于提取优化的工艺研究甚少。本实验以海南腰果为原料,采用碱溶酸沉法和响应面法提取优化腰果蛋白质工艺参数,为腰果蛋白的提取及综合开发利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海南腰果 购自海南省乐东市,于阴凉处贮藏;Albumin Bovine V:Solarbio 北京索莱宝科技有限公司;石油醚 沸程30～60 ℃,西陇化工股份有限公司;乙醇、浓硫酸、硼酸 国产分析纯,郑州亿中化工原料有限公司;硫酸铜、硫酸钾 郑州方点圆化工有限公司;氢氧化钠 联庆化工股份有限公司。

DS-1组织捣碎机 上海右一仪器有限公司;SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 金坛市盛蓝仪器制造有限公司;TDZ5-WS多管架自动平衡离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;Synergy HT多功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;SHIMADZU AUW220电子天平 厦门群隆仪器有限公司;电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;LNK860自动凯氏定氮仪 山东绿能仪器科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脱脂腰果粉的制备 将一定量的颗粒饱满、无虫害的腰果放入DS-1组织捣碎机中进行粉碎,用沸程为30～60 ℃的石油醚脱脂15～20 min,而后抽滤,重复3～4次,得到脱脂腰果粉[10-11]。

1.2.2 脱脂腰果蛋白提取液的制备 采用碱溶酸沉法[12-13]。称脱脂腰果粉1 g,加入一定量的蒸馏水,用氢氧化钠调节至一定pH,浸提一定时间,用4000 r/min转速离心后取上清液,测蛋白质含量。

1.2.3 腰果粗蛋白的测定 腰果粉中总蛋白质含量采用凯氏定氮法[14-16]测定,进行三次平行测定实验,取平均值。按下式计算蛋白质含量:

总蛋白含量(%)=c×V×0.0140×F×100/m

式中,c为标准酸浓度;V表示标准酸消耗量;F为蛋白质系数,m为腰果粉质量。

1.2.4 可溶性蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝法[17-19]。用考马斯亮蓝G-250染色,以牛血清蛋白为标准蛋白,建立回归方程:y=4.6468x-0.0188,R2=0.9907,其中y代表在595 nm下测得的吸光度,x表示蛋白质浓度。按下式计算腰果蛋白提取率:

提取率(%)=(上清液中的蛋白质含量/提取材料中蛋白质含量)×稀释倍数×100

1.3 蛋白质提取工艺的确定

1.3.1 单因素实验设计 对提取pH、浸提温度T、浸提时间t和料液比进行单因素实验。

1.3.1.1 pH的确定 在料液比为1∶30 g/mL,T=45 ℃,t=1.0 h时,对pH8、9、10、11、12进行研究。

1.3.1.2 浸提温度T的确定 在料液比为1∶30,pH=9,t=1.0 h时,T采用25、30、35、40、45 ℃进行研究。

1.3.1.3 浸提时间的确定 在料液比为1∶30 g/mL,pH=9,T=45 ℃时,t分别取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。

1.3.1.4 料液比的确定 在pH=9,T=45 ℃,t=1.0 h时,对料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL进行研究。

1.3.2 响应面法优化提取工艺 根据单因素实验结果,按照Box-Benhnken中心组合实验设计原理,采用Design ExpertV7.0软件进行实验设计[20-23]。本实验选择pH(A)、浸提时间(B)、料液比(C)三个因素为考察因素,以蛋白质提取率为指标,其因素水平见表1。

1.4 数据处理

使用SPSS 19.0进行方差分析。

表1 腰果蛋白响应面设计因素及水平编码

2 结果与分析

2.1 腰果蛋白含量测定结果

用凯氏定氮法测得脱脂腰果中的总蛋白含量为19.41%。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 pH对腰果蛋白质提取率的影响 由图1知，当pH由8上升到10时,蛋白质的提取率明显增加。当pH为10时,蛋白质提取率达到最大,而当pH大于10时提取率减小。这是因为碱可以分解蛋白质分子间的氢键,从而使其结构变得松散,促进了淀粉和蛋白质分离,使蛋白提取率增加,但是当pH过高时,会导致在强碱性作用下,蛋白质发生了各种脱氨,脱羧和水解反应[24]。据实验观察还会使蛋白浸提液颜色变深,这是因为蛋白质长期受强碱作用会影响蛋白质活性,甚至产生有毒化合物,不利于工业生产。综合考虑,提取体系的pH宜保持在10左右。

图1 pH对腰果蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of pH on extraction rate of cashew nuts protein

2.2.2 浸提温度对腰果蛋白质提取率的影响 由图2知，当温度在25～40 ℃,蛋白质提取率逐渐增加。当提取温度达到40 ℃时,蛋白质提取率最大。当超过40 ℃时,提取率明显减小。因为温度升高,分子运动更快,更容易溶解来自原料中的蛋白质;但随着温度的持续升高,蛋白质的提取率反而减小,这是由于温度过高,破坏了蛋白质的结构,使得蛋白质分子聚集,溶解度下降。并且高温会使蛋白质变性,直接影响产品质量[11,25]。所以综合考虑,提取体系的温度应保持在40 ℃左右。

图2 温度对腰果蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of cashew nuts protein

2.2.3 浸提时间对腰果蛋白质提取率的影响 由图3知，腰果蛋白的提取率在0.5～1.0 h呈现上升趋势,在1.0 h时达到最高,而后逐渐减小。可能因为当提取时间过短时,来自原料中的蛋白质还没有完全溶解出来。而提取时间过长会导致浸提液中蛋白质分子间产生相互作用导致蛋白质聚集在一起,溶解度随之下降,所以浸提液中蛋白质含量下降[9,26];并且随着时间的推移,提取溶剂慢慢挥发,料液比随之减小,这也间接导致了蛋白质提取率的减小。综合考虑,提取体系最终确定最佳提取时间为1.0 h。

图3 浸提时间对腰果蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of cashew nuts protein

2.2.4 料液比对腰果蛋白质提取率的影响 由图4知，蛋白质提取率随料液比的增加呈现先增加后减小的趋势。当料液比为1∶40(g/mL)时,提取率达到最大值。可能是因为随着浸提液的增加,来自原料中的蛋白质更容易被溶解出来,提取率相应增大。当提取液用量过多时,会造成原料的浪费,增加产品成本。综合考虑,提取体系最终确定最佳料液比为1∶40(g/mL)。

图4 料液比对腰果蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction rate of cashew nuts protein

综合四个因素对腰果蛋白质提取率的影响结果,发现温度相对于其它三个因素对结果的影响较小,因此选择pH、浸提时间、料液比三个因素进行响应面优化。

2.3 腰果蛋白质响应面优化提取条件

2.3.1 回归模型的建立 实验结果见表2。利用Design Expert软件可得到二次多元回归方程:

提取率Y=58.85+3.08A+1.57B+12.12C+2.27AB-1.68AC-1.07BC+7.94A2+9.31B2-4.23C2

表2 实验设计与结果

回归方程的方差分析结果见表3。回归模型的p值小于0.01,R2=0.9406，表明所得模型极显著。模型误差失拟项中p>0.05,说明该方程对实验拟合度较好,可以利用上述模型预测提取条件对蛋白质提取率的影响。由F值可得各因素对腰果蛋白提取率的影响顺序为:料液比>pH>提取时间。C、A2、B2对蛋白质提取率影响极显著,其他因素影响不显著。

2.3.2 各因素对腰果蛋白提取率的响应面分析 响应面图形能较直观地反映出各因素对蛋白质得率的影响,其响应曲面的陡峭程度反映了各因素对响应量的影响显著程度。二者呈正比关系,即曲面越陡峭,影响越显著。图5～图7反映了各因素对腰果蛋白提取率的影响。由图5可知,料液比为1∶40 g/mL时,提取时间一定时,蛋白质提取率随着pH升高呈先下降后上升趋势。由图6可以看出,当浸提时间为1.00 h,料液比一定时，蛋白质提取率随着pH升高呈先减小后增加趋势。同理,图7与图6表现出类似的变化趋势。对比三张图可得,提取pH(A)和提取时间(B)的交互作用最为显著,料液比(C)与提取 pH(B)的相互影响最小,与上述的模型方差分析结果一致。

表3 方差分析

图5 pH和浸提时间对蛋白质得率影响的响应面Fig.5 Responsive surfaces of the effect of pH and time on protein extraction yield

图6 pH和料液比对蛋白质得率影响的响应面Fig.6 Responsive surfaces of the effect of pH and solid-to-liquid ratio on protein extraction yield

图7 提取时间和料液比对蛋白质得率影响的响应面Fig.7 Responsive surfaces of the effect of time and solid-to-liquid ratio on protein extraction yield

注:**表示在α=0.01水平上极显著。

2.3.3 获取最佳提取条件 由Design-ExpertV7.0分析得最佳提取条件是:pH11.00,液料比1∶49.94(g/mL),提取时间1.50 h,此条件下的理论提取率为88.15%。为检验实验结果的可靠性,可进行验证实验。但显然料液比的比例不便于操作,所以将最佳工艺条件修正为:料液比1∶50(g/mL),pH11,提取时间1.5 h,三次验证实验的腰果蛋白的实际提取率为87.1%±1.05%。

3 结论

本研究以腰果为原料,采用碱溶酸提法提取腰果中的蛋白质。在单因素实验的基础上,通过响应面实验优化工艺参数,得出最佳工艺条件为:料液比1∶50,pH11,提取时间1.5 h,在此工艺条件下,蛋白质的得率可达87.1%±1.05%。说明通过响应分析法得到的回归方程可较好地预测实验结果。

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Optimization of cashew nuts protein extraction using response surface methodology

ZHANG Jing-jing,LI Xiao,YAO Guang-long,CAO Xian-ying,CHEN Jian*

(Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

The cashew nuts produced abundantly by Hainan were used to be the research object,the alkaline extraction and acid precipitation technology of extraction process was optimized with solid-to-liquid(S/L)ratio,solvent pH,extraction temperature and time by single-factor and response surface methodology designs. The results showed that the best experimental conditions were found to be extraction at 40 ℃ for 1.5 h using an extraction solvent at pH11 with S/L ratio of 1∶50(g/mL). Under the optimized conditions,the yield of protein was 87.1%±1.05%. The cashew nuts protein extraction regression model was highly significant(R2=0.9406),with good fitting and could be used to predict protein extraction rate.

cashew nuts protein;response surface optimization;alkaline extraction and acid precipitation;process parameters

2016-05-04

张晶晶(1990-)，女，大学本科，研究方向：天然产物的加工与利用，E-mail：18976363119@163.com。

*通讯作者:陈健(1985-)，男，讲师，研究方向：天然产物的加工与利用，E-mail：chenjian19850702@163.com。

海南省自然科学基金项目(20163053);海南大学科研启动基金项目(kyqd1553)。

TS255.6

B

1002-0306(2016)22-0305-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.051