科尔沁地区传统发酵奶豆腐中乳酸菌的鉴定

李 华,王 华,夏春丽,冀照君,孙立杰

(内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽 028000)



科尔沁地区传统发酵奶豆腐中乳酸菌的鉴定

李 华,王 华*,夏春丽,冀照君,孙立杰

(内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽 028000)

从科尔沁地区采集到5份传统发酵制作的奶豆腐样中分离出12株供试菌株,将分离的菌株的16S rDNA进行PCR扩增、序列分析并构建系统发育树。结果表明,12株菌株都属于乳酸菌(LacticAcidBacteria),其中6株乳杆菌(Lactobacillus),分别是植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)4株、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)1株、戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)1株;6株乳球菌(Lactococcus)分别是乳糖片球菌(Pediococcusacidilactici)5株和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)1株。鉴定结果与生理生化实验结果一致,且以乳酸片球菌和植物乳杆菌为优势菌群。

乳酸菌,16S rDNA,生理生化实验,序列分析,鉴定

乳酸菌是指一类在发酵过程中能够发酵糖类物质产生乳酸的无芽孢、革兰氏染色呈阳性的细菌。这类细菌在自然界中存在广泛,可分为23个属、220多个种,主要包括乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、肠球菌属、乳球菌属和片球菌属等[1]。乳酸菌是对人类健康有益的公认安全(generally recognizedas safe,GRAS)的微生物。用乳酸菌发酵的食品不仅不会生成毒性物质,还会产生乳酸及一些特殊的芳香物质,在提高食品营养价值的同时又赋予了食品特殊的风味,因此被人们所喜爱[2]。

科尔沁地区位于内蒙古东北部,是蒙古族比较集中的半农半牧区,至今仍然占全区蒙古族总人口的三分之一,这里的牧民长期以来沿用传统的自然发酵方法制作具有民族特色的传统乳制品。奶豆腐(蒙古语为“胡如塔”)作为内蒙古自治区蒙古族家庭经常食用的主要传统发酵乳制品之一,其采用生奶自然发酵,至乳清与乳酪分离后煮沸而制成[3]。奶豆腐发酵工艺独特、品种繁多、风味独特、营养丰富,能够较好地保存当地自然环境中的有益微生物——乳酸菌[4-6]。

16S rDNA序列分析技术是一种比较权威和准确的细菌鉴定方法。乳酸菌的16S rDNA含有1540个核苷酸,大小适中,其结构和功能都具有高度保守性,一直以来都被人们称之为“细菌化石”[7-8]。Fabio Minervini等[9]人2012年采用两对引物对发酵面团中乳酸菌16S rDNA进行扩增分析菌群的生物多样性,以此来研究乳酸菌和酵母菌对面包风味的影响。Naphatrapi Luangsakul等[10]通过16S rDNA序列分析了生面团中乳酸菌的生物多样性。因此,采用16S rDNA序列分析法对乳酸菌进行鉴定,不仅可以避免样品中微生物的丢失,而且可以反映样品中微生物菌群的多样性,是近年来使用较多的一种分离鉴定方法。

本文以科尔沁地区传统发酵工艺制作的奶豆腐为研究对象,采用16S rDNA序列分析技术对从不同地区不同牧民家庭采集的奶豆腐样品中的乳酸菌进行分离鉴定,并通过生理生化实验对其进行验证,为科尔沁地区乳酸菌资源的整理提供借鉴,同时为科尔沁地区传统发酵乳制品的工业化生产和品质改良提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

所有实验材料 都来源于科尔沁地区地理位置不同的5个牧民家庭通过传统工艺发酵制作的乳制品——奶豆腐,共5个样品;Ex-Taq E、DL2 000 DNA Marker 均购自TaKaRa公司;分子量标准DL15000 DNA Marker、16S rDNA扩增引物 均购自北京庄盟公司;革兰氏阳性菌提取试剂盒 购于TIAN GEN公司;乳酸菌微量生化鉴定试剂盒 上海士锋生物科技有限公司;常规化学试剂 均为国产分析纯试剂;MRS培养基 10 g蛋白胨,10 g牛肉膏,5 g酵母膏,2 g柠檬酸氢二铵,20 g葡萄糖,1.0 mL吐温80,5 g乙酸钠,2 g磷酸氢二钾,2 g硫酸镁,2 g硫酸锰,20 g琼脂,定容至1000 mL,调pH至6.2～6.6,分装后121 ℃灭菌15 min;M17 培养基 5 g植物蛋白胨,5 g酵母粉,5 g聚蛋白胨,0.5 g抗坏血酸,2.5 g牛肉膏,0.01 g硫酸镁,19 gβ-甘油磷酸二钠,定容至1000 mL,121 ℃灭菌15 min。

TGL-16M高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;UV5Nano微量紫外可见分光光度计 瑞士梅特勒-托利多;YM100Z全自动高压蒸汽灭菌器 上海三申医疗器械有限公司;HHS-21 电热恒温水浴锅、DZF-6020电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司;JY04S-3C 凝胶成像分析系统 北京君意东方电泳设备有限公司;SPH-1102C恒温培养箱 上海世平实验设备有限公司;HZS-H型水浴振荡器 江苏金坛友联仪器研究所;BSA-224S分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司;PHS-25pH计 上海雷磁仪器厂;Eppendorf-Matercycler基因扩增仪 Eppendorf公司;DYY-6C电泳仪 北京六一生物科技有限公司;厌氧培养瓶 美国bioMerieux,Inc。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集及处理 将牧民自然发酵制作的奶豆腐,用无菌刀片切片后每个样品取3份装入无菌容器中。在采样现场利用便携式pH计和温度计测试采样时奶豆腐的pH(3.8～4.2)和温度(10.8～18.9 ℃)。将收集的样品放入冰盒内冷却,间隔一定时间更换冰袋,保持较低的温度下带回实验室后放于4 ℃冰箱,尽快进行乳酸菌的分离,共5个奶豆腐样品。

1.2.2 乳酸菌的分离及保存 分别称取1.0 g奶豆腐样品置于90 mL磷酸盐缓冲液(pH6.5)中,经振荡混匀后稀释至10-4倍,按1∶10的比例加到灭菌的10 mL液体MRS培养基中于厌氧培养瓶内,37 ℃,静置培养24 h。取上述培养液100 μL涂布于MRS琼脂平板上,37 ℃厌氧培养24 h,挑取单菌落,液体培养后再进行划线分离,对分离得到的单菌落进行菌株革兰氏染色和过氧化氢酶实验[11],初步确定的菌株置于-80 ℃保存,备用。

1.2.3 乳酸菌DNA提取及纯度鉴定 使用革兰氏阳性菌提取试剂盒分别提取分离菌株的基因组DNA。取上述提取液3 μL用于1%琼脂糖凝胶电泳检测。同时取2 μL提取液使用微量紫外可见分光光度计在260、280 nm下分别测定提取液中乳酸菌DNA浓度及OD260/OD280。

1.2.4 PCR扩增乳酸菌16S rDNA 根据NCBI上查询到的乳酸菌16S rDNA的基因序列,使用软件Primer primer 5.0设计一对16S rDNA扩增引物。正向引物16S-A:TAGACGGCTGGCTCCTTGC;反向引物:16S-S:TGGCGGCGTGCCTAATACA。以提取的DNA为模板,体系中加入Ex-Taq 聚合酶,设定扩增程序:94 ℃,120 s;94 ℃,20 s:57 ℃,20 s,72 ℃,50 s,35个循环;72 ℃,10 min;4 ℃保温[12-14]。PCR扩增后,产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增成功的PCR产物送至上海生工测序检测。

1.2.5 同源性分析 将从5份奶豆腐样品中分离出的12株菌株的16S rDNA基因序列全部与GenBank数据库中的参考菌株序列进行比对,确定其属种。并利用软件Mega5.10 邻接法(Neighbour-joining)进行系统发育树的构建,其自展值(bootstrap value)为1000[15-16],以同源性大于95%为种的分界阈值将待测菌株鉴定到种。

1.2.6 生理生化鉴定 供试菌株中革兰氏染色呈阳性、过氧化氢酶反应呈阴性的菌株暂定为乳酸菌,根据生理生化反应现象进一步鉴定各乳酸菌[17-19]。

2 结果与分析

2.1 DNA提取及纯度分析

经菌株分离,共从5份奶豆腐样品中分离得到12株革兰氏染色呈阳性、过氧化氢酶反应呈阴性的菌株。经革兰氏阳性菌基因提取试剂盒提取12株菌株的DNA,提取产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,其结果如图1所示。

图1 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测分析Fig.1 Electrophoresis of the genomic DNA注:M:DL15000 bp Marker(250,500,1000,1500,2500,5000,7500,10000,15000);1:NDF-1;2:NDF-2;3:NDF-3;4:NDF-4;5:NDF-5;6:NDF-6;7:NDF-7;8:NDF-8;9:NDF-9;10:NDF-10;11:NDF-11;12:NDF-12。

从图1可知,12株乳酸菌的DNA大小都在20 kbp左右,完整性较好,可满足后续实验的使用。分别取DNA提取液用微量紫外分光光度计检测其含量。

从表1得知,基因组DNA的浓度最低为298.7 ng/μL,最高为593.7 ng/μL。A260/A280均在1.8～2.0。说明基因组DNA纯度较高,能满足后续16S rDNA 扩增和测序的需要。

表1 基因组DNA检测结果

2.2 16S rDNA的PCR结果

以16S-A、16S-S为引物,以提取的DNA为模板进行PCR扩增。经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析,在大约1.5 kb处有特异性条带,无拖尾,无弥散现象,说明PCR产物可以用来测序,见图2。将PCR产物送往上海生工进行核苷酸序列测定,测序引物为PCR引物。测序后每个样品返回2条序列,每条序列约为800 bp,使用SeqMan软件将序列拼接后,最终得到1.5 kb左右的基因序列。

图2 16S rDNA PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测分析Fig.2 Electrophoresis of the PCR amplification of 16S rDNA gene注:M:DL2000 bp Marker(100,250,500,750,1000,2000);1:NDF-1;2:NDF-2;3:NDF-3;4:NDF-4;5:NDF-5;6:NDF-6;7:NDF-7;8:NDF-8;9:NDF-9;10:NDF-10;11:NDF-11;12:NDF-12。

2.3 同源性分析

利用软件Mega 5.10 邻接法(Neighbour-joining)进行系统发育树的构建,如图3所示。从5份奶豆腐样品中分了出的12株菌株,其中6株乳杆菌中包括4株植物乳杆菌,1株干酪乳杆菌和1株戊糖乳杆菌,且其同源性均达到97%以上;6株球菌以乳酸片球菌多;6 株乳球菌中包括5株乳糖片球菌和1株戊糖片球菌,其同源性均在99%以上。

图3 根据16S rDNA 基因序列绘制的系统树Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene alignment

2.4 生理生化鉴定结果

从5份奶豆腐样品中共分离出来12株乳酸菌,根据硝酸盐实验、明胶液化实验、H2S生成实验、6.5% NaCl生长实验、4% NaCl生长实验确定了12株菌株中包括6株球菌、6株杆菌,和16s rDNA的鉴定结果一致。糖发酵实验进一步验证了杆菌都为乳杆菌属(Lactobacillus),球菌都为乳球菌属(Lactococcus),结果如表2所示。

菌株NFD-1,NFD-2,NFD-7,NFD-10四个菌株的糖发酵实验结果与植物乳杆菌相近,且其基因比对结果相似度都在98%以上,因此这四个菌就是植物乳杆菌,其样品来源于科尔沁区的科尔沁左翼后旗、霍林河、奈曼和扎鲁特旗;NFD-3,NFD-4,NFD-5,NFD-6,NFD-9根据糖发酵实验可进一步证明其就是乳糖片球菌,样品来源于科尔沁左翼后旗、霍林河、奈曼和库伦,其占到总菌株数的41.7%,为优势菌群。NFD-8的基因序列与干酪乳杆菌相似度达97%,生理生化鉴定时不能发酵阿位伯糖、鼠李糖、蜜二糖、棉籽糖,在15 ℃可以生长,确定其为干酪乳杆菌(Lactobacilluscaseizhang),样品来源于霍林河,霍林河与内蒙古锡林郭勒盟交界,而2001年张和平等人[20]在锡林郭勒盟大草原牧民家制作的传统发酵酸马奶(koumiss)中分离并筛选获得的Lactobacilluscaseizhang;菌株NFD-11和NFD-12的样品来源于扎鲁特旗,NFD-11的生理生化反应与基因序列比对结果一致,鉴定为戊糖片球菌;NFD-12的16sDNA序列与戊糖乳杆菌基因序列相似度在97%,结合糖发酵实验,该菌株能够发酵鼠李糖,因此鉴定其为戊糖乳杆菌。

表2 科尔沁地区传统发酵奶豆腐中乳酸菌鉴定结果

注:“+”表示实验阳性;“-”表示实验阴性;由于球菌碳水化合物发酵项目较少,故没有测定的项目用空格表示。

3 结论与讨论

本研究从5份科尔沁地区传统发酵奶豆腐样品中分离得到了12株侍测菌株,经16S rDNA基因序列分析与生理生化鉴定结果如下:植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumstrain)4株、干酪乳杆菌(Lactobacilluscaseizhang)1株、戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)1株、乳糖片球菌(Pediococcusacidilactici)5株和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)1株。

由此可见,科尔沁地区发酵奶豆腐中乳酸菌具有共性。在分离出的12株菌株中,乳糖片球菌占了41.7%,且在科尔沁区制作发酵奶豆腐的主要地区中4个地区都鉴定分离出该菌,故认定其为科尔沁区传统发酵奶豆腐的优势菌群。而王辑等人[21]在做内蒙古奶豆腐中潜在益生性乳酸菌的筛选时发现乳酸片球菌是内蒙古奶豆腐中的优势菌群,与本研究结果相似。5个地区中,有80%的地区都分离到了植物乳杆菌,可初步推测植物乳杆菌也是科尔沁区发酵奶豆腐的优势菌群之一。

本研究系统地分析了科尔沁地区传统发酵奶豆腐制品中乳酸菌的组成,为筛选发酵乳制品中的益生菌和发酵剂提供了基础,同时为传统发酵乳制品的工业化生产及其发酵剂的工业化生产提供了理论依据,为科尔沁地区传统发酵乳制品发酵过程中微生物定向调控和微生物资源开发、利用奠定基础。

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Identification of lactic acid bacteria isolated from fermented dairy Tofu of Horqin Region

LI Hua,WANG Hua*,XIA Chun-li,JI Zhao-jun,SUN Li-jie

(College of Life Science,Inner Mongolia University for Nationnalities,Tongliao 028000,China)

Twelve strains were isolated from 5 samples of traditional fermented dairy tofu in Horqin Region. Sequence analysis of 16S rDNA after PCR amplification and construct a phylogeny tree was used for the identification of 12 strains. The results demonstrated that the 12 strains were all theLacticacidbacteriastrains,including 6Lactobacillusstrains and 6Lactococcusstrains were respectively:Lactobacillusplantarum(4 strains),Lactobacilluscasei(1strain),Lactobacilluspentosus(1 strain),Pediococcusacidilactici(5 strains),Pediococcuspentosaceus(1strain).The results of sequence analysis of 16S rDNA were in accordance with that of physiological-biochemical tests,PediococcusacidilacticiandLactobacillusplantarumwere dominant microfloras.

lacticacidbacteria;16S rDNA;physiological-biochemical tests;sequence analysis;identification

2016-05-04

李华(1967-)，女，大学本科，教授，主要从事乳与乳制品工艺学方面的研究，E-mail:lihuahli@163.com。

*通讯作者:王华(1981-)，女，博士，副教授，主要从事功能性食品与生物反应器方面的研究，E-mail:huaking1981@126.com。

内蒙古自然科学基金(2013MS1220)。

TS202.3

A

1002-0306(2016)22-0222-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.035