细胞代谢组学及其在中药研究中的应用

陈衬心，张建永，蒲家志

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099)

综述

细胞代谢组学及其在中药研究中的应用

陈衬心，张建永，蒲家志

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099)

细胞代谢组学作为代谢组学一个新的研究方向，反映了动态系统中的细胞表型及细胞变化。其通过体内外因素的扰动，寻找内源性细胞代谢物的差异，对细胞内外代谢物类型和数量变化进行分析,探求其与生理及病理变化的相互关系和动态规律。鉴于细胞代谢组学的特点，细胞代谢组学已经被逐步用于中药药效、作用机制及毒理机制等的研究中，为从细胞层面探索中药的作用提供了新的思路。

细胞代谢组学；作用机制；毒理机制

中药是在中医药理论指导下，被用来防病治病的药物，中医药是我国人民几千年临床经验的沉淀和劳动智慧的结晶。用中药防治疾病具有一些明显的优势,然而对中药的作用机制却缺乏科学的阐释。再者，中药物质成分复杂，通过多组分协调、多靶点发挥整体药效作用，然而这种复杂性也给中药现代化研究带来很多困难，因此建立沟通中药与现代科学两大体系的“桥梁”已成为重要命题[1]。细胞代谢组学作为代谢组学的一个重要部分，正被逐渐应用在中药的作用机制等方面的研究，这为深入探索中药作用提供了新的思路。本文就细胞代谢组学在中药的药效和毒理机制进行概述，旨在为从细胞层面探索中药的作用提供新思路。

1 细胞代谢组学的简述

1.1 细胞代谢组学的起源与发展 1985年，Nicholson研究小组[2]运用核磁共振(NMR)法，发现大鼠的尿液代谢物与病理的变化存在关联，并于1999年提出代谢组学这一概念，其主要是应用现代分析技术研究生物体系受到刺激引起内源性代谢物的定性和定量变化，主要研究对象为生物个体，如人、实验动物等的生物样品(血浆、尿液及组织等)。随着研究的深入，代谢组学研究逐渐深入到细胞水平的代谢物研究中，Fiehn等[3]于2000年提出了细胞代谢组学概念，即分析单个细胞或单一细胞类型中内源性低分子量代谢物。与研究整体生物体不同的是，细胞代谢组学更注重在细胞层面，可直接反映药物等刺激对某种细胞代谢的直接影响，继而提供重要的生物代谢通路和代谢的网络信息，揭示引起的细胞变化规律，尤其是中药对细胞直接的作用机制上，更具靶向性。此外，细胞代谢组学具有变量易于控制，重现性好，成本低等优势，可有效补充整体代谢组学的不足[4]。

1.2 细胞代谢组学的样品前处理方法 细胞内的酶系统复杂、代谢活动较快，直接影响某一时刻下细胞内代谢物的分析，因此细胞内代谢物的分离与前处理方法成为了细胞代谢组学分析的关键步骤[5]，如细胞培养液的去除，细胞的获取及酶活性的抑制等。目前针对不同的细胞类型、研究目的和分析方法，对样品前处理的要求也不同，一般包括以下两个环节：细胞淬灭和代谢物提取。

细胞淬灭是让细胞内的酶失去活性，使代谢物轮廓“冻结”。理想的细胞淬灭方法是在保证细胞完整的基础上，快速灭活细胞内酶的活性。常见的淬灭技术有液氮冷冻法、快速冷却法、冷甲醇法、快速过滤法等。例如，对于贴壁细胞，Teng等[6]使用甲醇进行淬灭，相比于传统方法(胰蛋白酶消化、离心、耗时洗涤、淬灭等)更快速有效，而且保留了更多的代谢物。针对不同细胞类型，有学者进一步进行了优化，如Lorenz等[7]以INS-1贴壁细胞为研究对象，建立了简便有效的液氮冷冻法。对于悬浮细胞，Sellick等[8]证明60%冷甲醇-0.85%碳酸氢铵对仓鼠细胞淬灭过程泄露程度最小、重现性好；Volmer等[9]对哺乳动物悬浮细胞的多种淬灭方法进行了评价,发现快速过滤法处理效果较佳。综上可知，对于不同细胞类型的淬灭技术并不完全一致，故在具体的实验中有必要进一步优化。

细胞代谢组学需要从细胞中提取尽可能多的代谢物，同时做到细胞无破坏和代谢物无损失。目前，液-液萃取法在提取方法中应用的最广泛，常见的萃取剂有冷甲醇、乙腈、热乙醇、高氯酸等。对于同一细胞类型，有学者同时考察了多种细胞类型，如Dietmair等[10]考察了12种悬浮哺乳动物细胞的提取方法，发现50%冷乙腈优于50%冷甲醇、甲醇冷冻等方法。对混合萃取溶剂进行了进一步考察，如Madji等[11]以NSC-34细胞为研究对象，比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-二氯甲烷-水、乙腈-二氯甲烷-水四种不同的提取方法，结果发现甲醇-二氯甲烷-水(3∶3∶2)所提取的代谢物浓度高于其他方法。

2 细胞代谢组学在中医药中的应用

2.1 中药作用机制 中药成分复杂，具有多靶点多途径发挥药效的特点。传统代谢组学可从血浆等体液方面阐释中药整体的作用机制，但很难在细胞水平上阐明中药的作用机制。细胞代谢组学从细胞单元出发，研究中药对细胞内直接代谢网络的整体作用，对于阐明其在细胞水平上的作用机制具有重要意义，目前已应用于中药抗肿瘤、抗炎等细胞作用机制的研究。如王彦[12]使用UPLC-MS技术分析葛根素对BV2小胶质细胞(静息态)代谢物的影响，发现葛根素干预后，细胞内烟酰胺、鞘氨醇、硫胺素等21个代谢物能明显转向M2型(抗炎选择活化型)，这就从代谢物角度阐明了葛根素提高静息态小胶质细胞的抗炎作用机制，进一步分析发现，该抗炎作用的提升与葛根素调节肌酸、硫胺素、鞘脂的代谢通路有关。

在中药抗肿瘤研究方面，研究者多集中于中药单体有效成分的抗癌机制研究，比如胡永胜[13]运用GC-MS技术探讨雷公藤红素对Hela细胞的抗癌作用，发现雷公藤红素可调节苹果酸、果糖、丝氨酸、肌苷等14个代谢物，作用涉及到三羧酸循环、糖酵解途径、氨基酸代谢、核酸代谢等代谢途径，为深入研究雷公藤红素的抗癌机制打下了基础。史栋栋等利用GC-MS法研究中药成分木犀草素抑制MCF-7细胞的作用机制，通过非靶向代谢组学分析发现，丙氨酸、磷酸、核糖等 10 种代谢差异物，进一步分析可知木犀草素将细胞抑制在S期，5-磷酸核糖随着核糖的减少而减少，前者是核酸和核苷酸的合成原料，因其减少而抑制了S期DNA的复制，从而推测它的作用机制主要与抑制核酸、核苷酸的合成有关[14]。史栋栋等[15]通过GC-MS技术联合细胞周期实验分析了羽扇豆醇对MCF-7细胞的作用机制，研究发现羽扇豆醇调节了丙氨酸、甘氨酸、琥珀酸、天冬氨酸等 11 种代谢物。琥珀酸是三羧酸循环重要的中间产物，进一步分析发现，羽扇豆醇作用于细胞的G1期，故推测羽扇豆醇的作用机制可能是抑制了三羧酸循环和底物磷酸化反应而抑制MCF-7细胞的增殖。Parvizzadeh等[16]应用NMR法探讨了生姜提取物对淋巴瘤细胞Raji的抑制作用机制，结果发现其可调节异亮氨酸、赖氨酸、葡萄糖等12个代谢差异物，进一步分析可知，这一作用可能与其影响Raji细胞的蛋白质合成、氨基酸和碳水化合物的代谢来发挥抗癌作用。

在神经系统疾病的研究方面，细胞代谢组学也得到广泛的应用，如葛雅南[17]使用GC-MS法，探索了山奈酚和柚皮苷对阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)细胞模型的治疗作用机制，结果发现了甘氨酸、磷酸、尿苷等27种AD细胞损伤的生物标志物。山柰酸和柚皮苷干预后，可使部分差异代谢物向正常对照组回调，如降低了AD细胞中氨基酸代谢通路中的苯丙氨酸、α-酮戊二酸、亮氨酸、脯氨酸等代谢物的含量，升高了通路中3-羧基丁酸、甘氨酸含量。降低了脂质代谢通路中苹果酸含量，升高了通路中的胆固醇、硬脂酸等含量，综上结果，表明山柰酸、柚皮苷的作用机制主要与氨基酸和脂质代谢通路相关。

中药复方主要是通过多组分、多靶点、整体调节而发挥作用，细胞代谢组学可系统研究代谢网络的整体性和动态性变化，从而为中药复方配伍提供支持，指导临床合理用药[18]。如在复方配伍机制上，查旭山等[19]采用NMR细胞代谢组学方法，研究了银屑1号方对HaCaT细胞的影响，结果从正交偏最小方差判别分析模型法，结合代谢组学数据库中得到脱氧次黄苷、胆固醇和7-去氢胆固醇等7个差异代谢物，其中前三者分别是脱氧脱氨作用、维生素D合成、维生素D3合成的重要中间产物。进一步分析发现，银屑1号在抑制细胞增殖过程中与脂代谢、有机酸代谢、氨基酸代谢等多个代谢途径有关，从细胞单元层面阐明了中药复方的全面作用机制。在复方配伍解毒方面，有学者以H9c2细胞建立MI-RI模型[20]，采用GC-MS 非靶向代谢组学分析技术，探讨了四逆汤中附子配伍甘草解毒增效的机制。发现四物汤使细胞内葡萄糖浓度明显回升，同时还回调了缬氨酸、脯氨酸、3-磷酸甘油等代谢物；通过非靶向代谢组学分析，四逆汤中附子配伍甘草是主要通过糖酵解途径和氨基酸代谢来实现解毒增效作用。

2.2 中药毒理机制 中药毒性问题现已逐渐引起社会普遍的关注。采用整体动物代谢组学的方法推动了中药毒性机制的发现。如芫花的肝毒性、关木通的肾毒性机制的阐释[21-22]。基于细胞水平的代谢组学可从细胞单元探索中药的毒性机制，对于深入阐明毒性机制更有针对性[23]，目前已经被应用在肝肾细胞毒性方面的研究。如Gu等[24]运用UPLC-MS/MS法研究了马钱子对293T人胚肾细胞的损伤及甘草的保护作用。结果发现马钱子致肾细胞损伤后，牛磺酸、谷胱甘肽、尿素等10个代谢物发生了显著变化。进一步分析发现牛磺酸代谢、氮代谢、谷胱甘肽代谢、能量代谢等可能是马钱子致肾毒性的作用环节，给予甘草后可回调细胞代谢物的代谢轮廓，这就从细胞水平上阐明了甘草的保护机制。

Li等[25]采用NMR法探讨了苦参碱对HepG2细胞毒性的影响，结果表明细胞内丙氨酸、胆碱、谷胱甘肽、乳酸、磷酸胆碱和胆固醇共6个代谢物水平随苦参碱给药量增加呈剂量依赖性降低；而牛磺酸、脂肪酸和不饱和脂肪酸水平却呈剂量依赖性增加，提示这些代谢物可作为苦参碱诱导肝细胞毒性的潜在生物标志物，反映其毒性强弱。同时通过代谢通路分析可知，苦参碱的肝毒性与脂肪酸代谢等有关。施洁瑕等[26]运用 UPLC-Q-TOF /MS法研究了芫花酯甲对肝L02细胞的毒性机制，结果发现脑磷脂、二氢神经酰胺和棕榈酰肉碱等5个代谢物是芫花酯甲肝毒性的潜在生物标记物，其中脑磷脂和卵磷脂可通过影响甘油磷脂代谢诱导细胞凋亡。进一步代谢通路的研究，发现芫花酯甲肝毒性的新机制与甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、花生四烯酸代谢等有关。

Shi等[27]亦采用UPLC-Q-TOF /MS方法识别京大戟对肝L02细胞的毒性生物标志物，结果显示京大戟诱导了细胞内超过1299种代谢物的改变，进一步通过相关系数法确定了磷脂酰胆碱、脂肪酸、神经酰胺等12个生物标志物，这些代谢物参与了甘油磷脂、氨基酸代谢及脂肪酸氧化等过程，这些发现对从细胞单元角度揭示京大戟的肝毒性提供了实验基础。

3 展望

细胞代谢组学作为是代谢组学研究的一个新的方向，它可以通过细胞单元内外代谢物的变化，表征中药扰动后的作用及机制，对于探索中药药效及毒理机制提供了新思路。目前，细胞代谢组学在中药及复方作用机制、中药安全性评价等方面都取得了一定的成果，为推动中药现代化提供更好的技术手段。但中药细胞代谢组学的研究正处于起步和探索阶段，仍存在不足，主要表现在以下几个方面：①细胞代谢组学如何与整体动物水平结果关联，以便弥补作用机制的不全面；②对于某一靶器官的药效/毒效及机制研究中，器官中的多种细胞类型如何选择，才能确保研究结果的可靠性和真实性，是细胞代谢组学的一个难题；③传统中药复方的细胞实验多采用血清药理学、肠吸收法、肝代谢液法等，但均存在一定的局限性，因此这给开展细胞代谢组学研究带来了困难；④中药毒性实验中，细胞部分死亡，细胞数目的改变势必将影响代谢物含量的变化，基于这种情况得到的实验结果如何进行有效的校正，目前尚无成熟的方法。但是，相信随着生命科学技术的不断发展，细胞代谢组学必将推动中医药取得更多的成果。

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[收稿2017-05-03;修回2017-06-25]

(编辑：王福军)

ApplicationofcellmetabolomicsontraditionalChinesemedicine

ChenChenxin,ZhangJianyong,PuJiazhi

(School of Pharmacy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

As a new direction,cell metabolomics was an essential part of metabolomics of systems biology,which reflected the cell phenotype and cell activity in the dynamic system.The rules and relationship in physiological and pathological conditions were studied by quantitative analysis of metabolites changes in cell,which was disturbed by external factor.In recent years,cell metabolomics has been applied on exploring the effects,mechanisms and toxicology of traditional Chinese medicine (TCM),which provides a new method for the study on the action of TCM.

cell metabolomics; traditional Chinese medicine; mechanism; toxicology

国家自然科学基金资助项目(NO：81560736)；贵州省科学基金资助项目(NO：黔科合J字[2014]2182)；教育部春晖计划(NO：Z2014096)。

张建永，男，博士，副教授，研究方向：中药质量与作用机理，E-mail:zhangjianyong2006@126.com；蒲家志，男，教授，研究方向：分子印迹技术，E-mail:jiazhipu2002@163.com。

R917

A

1000-2715(2017)05-0583-04