甜叶菊化学诱变育种的发展

文武 ，张文彬 ，吴则东 ，3*

（1.甘肃省武威市凉州区古城镇农技站，武威733000；2.黑龙江大学农作物研究院/中国农业科学院甜菜研究所；3.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨 150080）

甜叶菊化学诱变育种的发展

文武1，张文彬2，吴则东2，3*

（1.甘肃省武威市凉州区古城镇农技站，武威733000；2.黑龙江大学农作物研究院/中国农业科学院甜菜研究所；3.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨 150080）

介绍了化学诱变剂及其与物理诱变剂的优缺点，综述了甜叶菊化学诱变（秋水仙素、甲基磺酸乙酯、叠氮化钠等）育种研究的发展。为快速培养高品质甜叶菊新种质提供参考。

甜叶菊；化学诱变育种；秋水仙素；诱变剂；甜菊糖；甜菊糖苷；莱鲍迪苷

据联合国粮农组织和国际原子能机构（FAO/IAEA），在突变品种数据库（MVD）至少收集3233个突变品种，这些品种，创造了巨大的经济和社会效益[1]。为改善甜叶菊产质量，以γ照射、重辐射、离子束、紫外线等的物理诱变技术在甜叶菊应用研究有了一定的发展[2]。化学诱变剂同样在改良甜叶菊有益性状和糖苷含量与品质方面也进行了大量的研究探讨[3-22]，尤其是秋水仙素创造多倍体（四倍体）种质的研究更为活跃[9-22]。本文对化学诱变剂处理甜叶菊的诱变育种研究应用予以综述，从此侧面探讨创造优良甜叶菊新品系的可能性与可用性，对未来甜叶菊的发展提供借鉴与参考。

1 化学诱变育种简述

化学诱变剂是植物突变育种很有效的一类物质，可导致高突变率尤其是点突变[23]。化学诱变剂主要包括，⑴碱基类似物：5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴脱氧尿苷（BudR）、2-氨基嘌呤（2AP）。 ⑵烷化剂：①磺酸盐类，如：甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基磺酸甲酯（MMS）、硫酸二乙酯（DES）；②硫芥类，如：乙基-2-氯乙基硫（ethyl-2-chloroethyl sulphide）；③氮芥类，如：2-氯乙基二甲基胺（2-chloroethyl-dimethyl amine）；④环氧化合物，如：氧化乙烯亚胺羟胺（NH2OH）、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）、叠氮化钠（NaN3）和重氮甲烷；⑤亚硝基脲类，如：甲基亚硝基脲（MNU）、乙基亚硝基脲（ENU）、卡莫司汀（BCNU）。⑶插层剂，如：吖啶橙、原黄素、溴化乙锭。⑷亚硝酸，如：N乙酸基-N-2乙酰胺基氟（N-acetoxy-N-2-acetyl-aminofluorine，NAAAF）[1]。它们对DNA各有不同的作用方式，如脱氨基作用、转换和插入诱导，转录和复制中断或链断裂[24]。在国际原子能机构突变品种数据库的突变品种80%以上是烷化剂处理实现的。常用的化学诱变剂：秋水仙素、EMS、DES、MNUA、ENU[25]，其中秋水仙素又名秋水仙碱，对诱导多倍体的形成最为有效，在很多作物中是重要的多倍体诱变剂。当秋水仙素与正在进行有丝分裂的细胞接触时，能与细胞中的微管蛋白结合，使纺锤丝合成受到阻碍，抑制已经复制的染色体分向两极，最后加倍的染色体留在同一细胞，当秋水仙素解除后，细胞有丝分裂又能正常进行[20]。EMS（CH3SO2OC2H5）也是广泛流行使用的化学诱变剂，它属于单功能烷化剂，可诱导化学变化，导致核苷酸分子的错配和碱基改变，导致高的基因突变频率和低的染色体畸变率，由于烷基化，鸟嘌呤形成O6乙基鸟嘌呤（O6-ethylguanine），这很容易与胸腺嘧啶配对而代替胞嘧啶，进一步在随后的DNA修复，原来的G/C对被A/T替代，EMS在碱基间创建一个转换/颠换现象，偶尔出现错义突变和无义突变[5，24，26]。对化学诱变剂有效剂量的选择取决于其强度、处理周期，使用的溶剂或溶液的pH值[23，26]。

化学诱变剂的优点：⑴使用经济方便，只需少量的药剂和简单的设备；⑵有一定专一性，特定的化学药剂，仅对某个碱基或几个碱基有改变作用，因此可改变品种单一不良性状，而保持其它优良性状不变；⑶破坏性小，与遗传物质发生生化反应，多引起基因的点突变，不像辐射诱变尤其高能辐射致使染色体结构变异广泛。使用方法：如果是种子，干种子预先浸泡，使细胞活泼增加敏感性、提高膜透性；细胞处DNA合成阶段时，对诱变剂最敏感，诱变处理应在DNA合成前进行。处理方法有浸泡法、涂抹法、滴液法、注入法、熏蒸法和施入法等。诱变后处理：清水反复冲洗或使用化学清除剂，以降低残留。注意：化学诱变剂都有不同程度的毒性，如烷化剂是潜在的致癌物质，在使用时应避免皮肤接触或吸入体内[1，23-24]。

物理与化学诱变剂比较：物理诱变剂比化学诱变剂的风险小、无毒，操作后无需对材料解毒及清洁。化学诱变剂处理通常是不成功的，不易对无性繁殖的植物如甜叶菊进行诱导突变，主要是由于化学化合物的吸收和渗透力很低，无法进到植物组织内。而物理诱变因素特别是γ射线，可提供准确的剂量、具有足够的重现性和一致的高渗透能力作用于植物组织[1，26-27]。然而，诱变处理的结果仍然是随机的、不育率高。因此，对每种基因型处理都需要剂量优化[23，26]。随着诱变剂的不断开发，无论是物理的还是化学的，植物育种者有能力诱导突变体并在育种计划中使用。

2 化学育种技术在甜叶菊中的应用

2.1 秋水仙素创造甜叶菊多倍体品系

Handro等采用不同浓度的秋水仙素（0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.50%和2.50%）处理甜叶菊（2n＝22）诱导多倍体。用流式细胞术分析，确定倍性水平。获得的四倍体植株叶中甜菊糖苷（STV）含量比对照高2.5倍[3]。Rameshsing等使用上述剂量的秋水仙素处理开发不同的甜菊突变体，采用流式细胞分析术测定倍性水平。结果，一些多倍体表现为STV和莱鲍迪苷A（Reb A）含量增加两倍（与对照比）。因此，甜叶菊多倍体诱导证实秋水仙素作为创造新的高甜菊糖（STV和Reb A）含量有效的诱变剂，有助于甜叶菊作物的改良[10]。Hegde等用不同浓度的秋水仙素诱变多倍体甜叶菊，通过流式细胞术验证，诱变的倍性水平包括二倍体、三倍体、四倍体和混倍体形式。在最初的试验表明这些多倍体表现为可变性，诱变的多倍体具有较好的农艺性状与最大糖苷含量。因此，倍性水平可以产生变异，并可改善甜叶菊的品质[11]。

Ghonema等以0.01%、0.05%、0.10%、0.25%和0.50%浓度的秋水仙素处理甜叶菊种子和一个月的芽，秋水仙素处理的种子和芽的致死浓度为0.10%～0.50%。0.01%、0.05%处理与对照的种子存活率分别为5.2%、3.0%和4.1%，芽的存活率分别为37.2%、36.3%和48.5%。甜菊糖总含量，0.05%处理的种子增加到100.31mg/g（对照84.49 mg/g），0.01%和0.05%处理的芽下降到49.73 mg/g和76.36 mg/g（对照98.04 mg/g）。对处理种子纯化染色质DNA的化学成分分析表明，0.05%秋水仙素处理组蛋白高于其他处理，对照的组蛋白含量最低；芽对照组蛋白高于秋水仙素处理，其中0.01%秋水仙素处理组蛋白含量最低。0.05%秋水仙素处理的种子基因组抑制片段为83.0%（对照为66.7%），其基因组活性片段为17.0%（对照为33.3%）；0.01%秋水仙素处理的种子基因组抑制片段为63.7%（对照为79.3%），其基因组活性片段为20.7%（对照为36.3%）。非组蛋白的转录活性排序为，种子：对照＞0.01%秋水仙素处理＞0.05%秋水仙素处理；芽：0.05%秋水仙素处理＞0.01%秋水仙素处理＞对照。组蛋白的转录活性排序为，种子：对照＜0.01%秋水仙素处理＜0.05%秋水仙素处理；芽：0.01%秋水仙素处理＜0.05%秋水仙素处理＜对照。0.05%秋水仙素处理的种子和芽脯氨酸含量分别为17.5μg/g和45.95μg/g，表明，这些甜叶菊的处理是由于脯氨酸差异表达而致的遗传或至少基因表达。脯氨酸作为一种相容的细胞质溶质，可平衡细胞质外盐的积累。得到两个多倍体植株，有可能通过组织培养进行繁殖[12]。

张虹等采用不同浓度秋水仙素、不同时间处理对甜叶菊萌动种子进行诱导，研究表明，含2%二甲基亚砜（DMSO）的0.1%秋水仙素处理甜叶菊萌动种子1d可有效诱导产生多倍体，其诱导率为20%。对根尖细胞染色体和流式细胞术检测表明，诱导的植株染色体数目和DNA含量均为二倍体植株的2倍。四倍体植株性状表现为：叶片大、扭曲皱缩而色深绿，叶片下表皮气孔大、密度低，花蕾大、开花延迟等[13]。漆慧娟采用不同浓度秋水仙素、不同时间处理甜叶菊（2n=22）萌芽种子和无菌苗茎段，结果表明：0.3%秋水仙素浸泡甜叶菊萌芽种子1d和0.1%秋水仙素浸泡甜叶菊茎段2d，获得最高的同源四倍体（2n=44）诱导率（分别为11.63%和32.50%），也就是：用秋水仙素高浓度短时间或低浓度长时间处理效果较好。种子浸泡法和茎段离体诱导法各获得13株和45株四倍体植株（共58株），离体诱导多倍体比种子处理的效果更好。染色体检测要注意辨别同时存在两种染色体条数（2n=22和2n=44）的嵌合体植株。与二倍体植株相比，四倍体植株生长缓慢，叶片皱缩、叶色深、叶宽厚，叶干物质重，花序较大；四倍体保卫细胞增大、叶绿体数增多、叶绿素含量增高，气孔明显增大而密度显著减小。四倍体植株的SrKO、SrKA13H和SrUGT74G1基因表达量显著高于二倍体植株，而SrUGT85C2和SrUGT76G1基因则相反[14]。李红以二倍体甜叶菊健壮嫩芽为外植体建立甜叶菊无菌快速繁殖体系，在此基础上，用0.05%、0.10%及0.20%的秋水仙素溶液处理甜叶菊不定芽试图诱导同源四倍体，用染色体检测和流式细胞术鉴定其倍性。结果表明，0.20%秋水仙素溶液浸泡甜叶菊不定芽12h，可诱导32.14%的同源四倍体，高于其它处理。与二倍体相比，四倍体植株叶片大、肥厚、皱缩、叶色浓绿，气孔大；除MDA的含量显著低于二倍体外，其蒸腾速率、光合速率、光合色素含量、气孔导度、胞间CO2浓度、SOD、CAT和POD明显高于二倍体，其STV和Reb A含量分别比二倍体高4.45%和4.68%。与二倍体比，四倍体基因组DNA的总、全甲基化率均降低，而半甲基化率则升高，其29.72%的甲基化发生了改变[15]。

陈绍潘等的研究表明，用0.1%秋水仙素溶液处理甜叶菊（2n=22）苗生长点诱变产生四倍体植株，以8次点滴处理诱变率最高（31.25%）。与二倍体植株比，四倍体植株叶色更浓绿、叶片肥大，叶长、宽和厚度分别是二倍体的2.1倍、2.3倍和1.7倍，茎秆矮壮，叶片气孔增大、密度减少，其叶片甜菊糖含量为15.7%，比二倍体（10.8%）提高4.9个百分点[16]。王波等用不同浓度的秋水仙素对甜叶菊（2n=22）茎段外植体进行不同时间处理，结果，甜叶菊受秋水仙素的影响很大，再生苗生根也受到了一定影响；诱导四倍体的最佳剂量为0.1%秋水仙素处理3d，多倍体诱导率达42.3%，且再生植株存活率高。四倍体植株叶色深、叶片肥厚、植株矮壮，气孔增大、密度变低，细胞核体积增大[17]。彭程等亦用不同浓度的秋水仙素对甜叶菊（2n=22）茎段外植体进行不同时间处理，结果，0.025%的秋水仙素比较适宜甜叶菊多倍体离体诱导的持续诱变，直至试管苗再生而无需清洗外植体和更换培养基，简化了甜叶菊多倍体诱导操作环节，提高了离体诱导效率。诱导的四倍体植株与以上同类研究相似：叶片肥厚、花蕾大、开花延迟等[18]。张路路以0.1%秋水仙素对7个甜叶菊品系的离体苗茎段进行诱导处理3d，将诱导茎段转移到继代培养基继续培养约1个月。结果表明，在处理的7个品系中，B1品系的四倍体诱导率最高（26.7%），获得的诱导苗最多。这可能与品种本身遗传差异有关，不同生长阶段的材料对秋水仙素的敏感性不同。秋水仙素对材料有一定的毒害作用，早期诱导植株的多倍体特征并不明显，生长势比较弱，苗矮化现象较为严重，有部分伤害，部分芽褐化死去或形成畸形苗，所以早期形态学鉴定并不可靠。后期大田栽培的四倍体植株表现为较矮，叶厚实、色深绿，叶长宽变大，气孔大、密度小。四倍体Reb A占总糖苷含量的74.6%，比对照高3.8个百分点[20]。

Rameshsing等采用0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.50%和2.50%秋水仙素处理甜叶菊获得突变体，用流式细胞术检测处理植株的DNA含量，以确定倍性的变化。结果每个突变体植株的生长、产量和活性成分含量都有提高。即秋水仙素处理的植株株高、叶片大小、厚度、叶绿素含量都有增加，而节间长度降低；诱变的四倍体STV和Reb A含量最高，分别为13.969%和4.53%（对照分别为9.534%和4.11%）。因此，甜叶菊诱变四倍体是有效的，可提高生物量和甜菊糖（STV和Reb A）含量有助于甜叶菊作物的改良[21]。苏婷婷用0.01%、0.05%、0.10%和0.20%四个浓度秋水仙素对甜叶菊组培苗分别处理12、24、48h诱导多倍体，结果，以0.10%秋水仙素处理1d诱导率最大（26.7%），在获得的130株四倍体植株有6株甜菊糖和Reb A含量极显著高于对照，其中一株的STV和Reb A含量分别是对照的3.1倍和6.7倍。四倍体植株的叶绿体含量和气孔等性状显著高于二倍体植株。秋水仙素浓度和处理时间对甜叶菊组培苗根尖细胞有丝分裂的影响结果为：从0.01%浓度处理12h到0.10%浓度处理24h，对根尖细胞分裂有促进作用，有丝分裂指数由19.72%增加到最高的30.99%；随着处理剂量和时间的增大，有丝分裂呈下降趋势，至0.20%浓度处理48h的有丝分裂指数为18.93%，对甜叶菊根尖细胞的分裂产生抑制作用[22]。

2.2 EMS、NaN3在甜叶菊中的应用

周玉丽为获得甜叶菊耐盐突变体，采用化学诱变剂EMS处理甜叶菊组养苗茎段、以NaCl作为选择压力，将甜叶菊组培苗置于浓度为0～1.2%的EMS中，分别浸泡震荡0h～12h后，接种于培养基培养，低浓度EMS和短时间处理对甜叶菊组培苗株高、生根率和存活率影响较小，当EMS浓度＞1.0%、处理时间＞8 h或浓度＞0.8%、处理时间＞10 h，甜叶菊组培苗有一半存活，因此，EMS处理甜叶菊组培苗腋芽茎段的适宜浓度和时间分别为0.8%～1.0%和8～10h。将甜叶菊组培苗茎段经1.0%EMS处理8h后，接种于含1.0%NaCl的MS培养基中，45 d的存活率（13.67%）显著高于对照（3.33%），获得的41株耐盐变异株中有4株在DNA水平上表现出变异。变异株的相对电导率和MDA含量显著低于对照，其叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量显著高于对照，CAT、POD和SOD酶活性在多数盐胁迫条件下显著高于对照。这表明，EMS诱导甜叶菊组培苗产生的突变体经筛选后可增强其耐盐性。移栽的成苗与对照株比叶片肥大、叶色浓绿、生长健壮[4]。

何克勤等采用不同浓度的NaN3和不同处理时间对甜叶菊离体培养的茎段进行诱变处理，结果表明，NaN3处理的LD50为9 mmol/L、浸泡4 h，该处理的植株矮化、腋芽数减少，较低浓度的NAN3（3mg/L）诱变处理对再生苗伤害较小，较适合NaN3离体诱变的技术体系为3mg/L处理20 d。RAPD和SRAP检测表明，有28.6%再生苗的DNA序列发生了一定程度的变异，最高多态性比率为54.2%，这为使用NaN3对甜叶菊进行大规模的离体诱变奠定技术基础[6-8]。

2.3 化学诱变剂复合处理在甜叶菊中的应用

甜叶菊叶外植体经一系列的EMS（化学诱变剂）和γ辐射（物理诱变剂）处理，所有处理中，0.4%v/v EMS和0.95 kR剂量的γ辐射是最有效的处理，可直接将芽诱导突变体。对EMS（E）、γ辐射（G）处理和对照（C）植株进行光合参数研究，其中E和G植株表现出较低的叶绿素含量、蒸腾速率、CO2交换率和气孔导度。植株收获时测定其生长过的土壤有机碳（OC）、电导率（EC）、磷（P）、钾（K）、总凯氏氮（TKN）含量均减少。 ISSR 分析E、G和C的多态性条带占总107条的63%，E植株与C植株在系统发育上更遥远。在植物化学分析中，G植株的Reb A含量成倍增高而STV含量（3.2±0.22%DW）降低，而E植物的STV含量（8.2±0.56%DW）和Reb A 含量（6.7±0.34%DW）比对照增高 1.5～2.0倍，甜菊醇含量：E 植株（3.1±0.15%DW）和 G 植株（2.3±0.21%DW）都很低。RT-PCR分析表明，甜菊糖的增加是由于UGT74G1和UGT76G1分别执行STV和Reb A的生物合成。 而 E 植株在 UGT74G1（RQ=5.51±0.5）和 UGT76G1（RQ=6.61±0.5）基因表达中增加 5～6 倍，G植物在 UGT76G1（RQ=5.29±0.2）基因表达中增加 5 倍[5]。

3 展望

用于诱变育种的化学诱变剂较多，有的尚未在甜叶菊中应用；秋水仙素和组织培养法结合是目前诱导多倍体常用方法之一，其优点是操作简便省时，重复性好，诱导率高，易于大批繁殖。在今后是否可以将以往成功的化学诱变剂做进一步的探索研究，或与已在其它作物上应用而甜叶菊未用过的化学诱变剂结合，或与物理诱变方法结合，也许会产生特异的、某种性状更优良的新的突变体，为甜叶菊进一步改良做亲本加以利用。

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Development of Chemical Mutation Breeding of Stevia

WEN Wu1,ZHANG Wen-bin2,WU Ze-dong2,3*
（1.Agrotechnical Station of Liangzhou District Gucheng Town,Wuwei 733000,Gansu;2.Crop Academy of Heilongjiang University/Sugar Beet Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080;3.Key Laboratory of North Sugar Crop Resource and Utilization,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080）

The advantages and disadvantages of physical and chemical mutagens were introduced.The development of chemical mutagenesis breeding （mutagens:colchicine,ethyl methyl sulfonate,sodium azide,etc.）breeding research in stevia was reviewed to provide references for the rapid creation of high-quality stevia germplasms.

stevia;chemical mutation breeding;colchicine;mutagen;steviol glycoside;stevioside;rebaudioside A

S566.9

B

1007－2624（2017）06－0063－04

10.13570/j.cnki.scc.2017.06.020

2017-04-06

文 武（1983-），男，甘肃武威人，助理农艺师，主要从事农业技术推广工作。Email：gcznjz@163.com

吴则东（1972-），男，黑龙江依兰人，副研究员，博士，从事作物遗传及分子育种研究。E-mail：331056376@qq.com