内皮祖细胞在缺血性心脏病治疗中的研究进展

李中轩，张颖倩，陈韵岱

• 综述 •

内皮祖细胞在缺血性心脏病治疗中的研究进展

李中轩1，张颖倩1，陈韵岱1

内皮祖细胞（EPCs）是血管内皮细胞前体细胞，病理情况下，EPCs增殖分化能力减低、向损伤部位定向迁移能力及黏附功能减弱，使血管内皮损伤修复受阻或损伤加重，成为缺血性心脏病的重要致病因素。自1997年Asahara[1]

等在Science首次发表EPCs文章以来，近20年国内外学者关于EPCs进行大量研究，如：EPCs培养、纯化、表型鉴定、生物学特性、药物、细胞因子等基础研究，动物实验、小规模临床试验等应用研究。为进一步总结EPCs在治疗缺血性心脏病方面研究进展，为更深入研究寻找新方法、新思路，现对2012年以来及相关原始一次性文献进行综述。

1 内皮祖细胞相关概念

1.1 内皮祖细胞来源 EPCs与血岛内造血干细胞可能来源于同一前体细胞，即血管母细胞。EPCs分为早期EPCs[2]和晚期EPCs[3]，早期EPCs贴壁较晚，增殖高峰在3～10 d，10～21 d凋亡，晚期EPCs贴壁较早，增殖高峰在14～21 d，晚期EPCs可以稳定传代30代以上。EPCs直接参与形成新生血管内皮和管腔样结构，Minami等[4]将人外周血来源的早期或晚期4×105个EPCs静脉注射入单侧后肢缺血的免疫耐受小鼠体内，结果显示晚期EPCs处理组明显血流增强，缺血患肢毛细血管数量增多。证实单个核细胞来源培养17～23 d晚期EPCs修复血管潜能优于其他EPCs亚群，因此人外周血来源的晚期EPCs拥有更高增殖与体外成管腔能力，并高表达血管生成相关基因，如激酶插入区受体（KDR）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）。EPCs参与血管形成，血管发生和血管新生在出生后新生血管形成过程中构成互补机制，EPCs在这个过程中起到核心作用[5]。

1.2 内皮祖细胞分布 骨髓、脐带血、成人外周血等均存在EPCs。Peichev等[6]发现外周血中表达VEGFR-2、AC133、CD34+的EPCs，所有CD34+、VEGFR-2+细胞都表达趋化因子受体蛋白4（CXCR4），并经过基质细胞衍生因子1 （SDF-1）和VEGF处理会进行迁移。Qin等[7]发现一种有效手段扩增人脐血来源内皮祖细胞，体外实验中，人脐血来源EPCs可以形成管腔样结构，因此，EPCs来源广泛，为EPCs移植治疗缺血性心脏病（IHD）应用创造了良好条件。

1.3 内皮祖细胞生物学特性 EPCs具有摄取低密度脂蛋白能力、结合凝集素能力，甚至具有成骨潜能，Yang等[8]认为具有成骨潜能的EPCs数量，可以作为预测冠状动脉疾病严重程度的新指标，有证据表明早期和功能高度活跃的CD34+、CD133+以及VEGFR-2+的循环EPCs，同时具有成骨潜能（OCN+），可能在血管动脉粥样硬化钙化和骨代谢的机制之间起调控作用。近年来，微小RNA（miRNAs）成为理解IHD病理生理的一项工具，微小RNA是一类非编码RNA，调节基因转录后表达，循环miRNAs作为IHD诊断治疗最有潜力的生物标志物已经引起了人们广泛关注，尤其在心血管风险预测和心肌梗死（MI）诊断。Wang等[9]研究发现，miR-23a会抑制冠状动脉疾病（CAD）患者EPCs活性，敲除miR-23a会改善EPCs体外成血管能力，并进一步改善缺血部位血流，Jin等[10]同样发现miR-214也通过抑制VEGF表达影响EPCs活动。Morishita等[11]研究发现，循环EPCs具有分化为成熟内皮细胞能力，在内皮损伤引起的心肌缺血和血管损伤时可以诱导血管生成，血管发生和血管修复。EPCs数量与血清1,5-脱水葡萄糖醇、二十碳五烯酸、花生四烯酸和体质量指数具有相关性，同时餐后高血糖与n-3多不饱和脂肪酸有助于有 2型糖尿病CAD患者的EPCs募集。Chen等[12]关于一氧化氮合酶（eNOS）过表达修复CAD患者循环中血管源性细胞功能的研究，结果提示年龄和CAD可以损害循环血管源性细胞（CACs）多种功能，限制其治疗MI的潜能。eNOS基因来源于老年患者和CAD患者的CACs，该基因可能存在改善自体细胞治疗效果潜力。外源性因素包括药物、细胞因子、信号传导因子等[13]。Eibel等[14]研究发现VEGF基因治疗通过募集循环与免疫系统中因子，动员EPCs。

1.4 内皮祖细胞鉴定 EPCs的可靠鉴定对临床应用至关重要。研究显示[6]，循环中同时表达AC133和VEGFR-2的CD34+细胞具有分化为内皮细胞功能，任何单一表面分子对于EPCs都没有特异性，联合检测CD34、Flk和AC133是目前最常用鉴定EPCs的表面分子抗原组合，应用相对特异的该抗原组合富集较高纯度的EPCs，最常用的分离方法为Ficoll密度梯度离心法。

1.5 内皮祖细胞与血管新生 EPCs在体外培养的时间不同分为早期EPCs和晚期EPCs，早期EPCs即贴壁培养1周的针状细胞没有成血管能力，主要表达一些血管形成因子如：肝细胞生长因子、VEGF、白细胞介素-2、白细胞介素-8，早期EPCs还能表达丰富的促血管形成因子如：趋化因子3/4/18、细胞趋化因子12/16、胰岛素样生长因子1和白介素-10。早期EPCs主要通过分泌功能募集循环系统中成熟内皮细胞并促进其增殖参与血管新生。晚期EPCs即培养2～4周的鹅卵石样细胞依靠其高度增殖能力，分化为内皮细胞，参与新生血管脉管网形成，直接参与血管新生[15]。

2 内皮祖细胞在缺血性心脏病的临床应用

EPCs分泌生长因子保护内皮细胞免受缺血引起损伤和死亡，并通过这些生长因子募集更多EPCs到损伤部位并与其分泌的生长因子一起完成血管新生和修复[16]。外周血EPCs治疗冠心病：EPCs有较强的促进血管新生能力，但一般情况下，外周血中EPCs数量非常少，尤其存在心血管病危险因素者、老年人、心力衰竭患者，其EPCs数量更少。

Cuadrado等[17]在3个西班牙中心入组共100例急性心肌梗死（AMI）患者和50例动脉粥样硬化性脑卒中（AS）患者，在症状发生的24 h内采集血液样本，通过流式细胞术分析EPCs和CEC数量，超声评价颈动脉中层内膜厚度，随访6个月，结果显示，基础EPCs计数和颈动脉中层内膜厚度≥0.9可以作为预测急性心肌梗死患者未来发生心血管事件的风险指标。

Tang等[18]研究发现，脾功能亢进是慢性心衰患者心肌负性重塑的独立危险因素，慢性心力衰竭（CHF）合并脾亢患者EPCs的增殖潜能减低，加速EPCs衰老，导致内皮功能障碍，从而造成CHF合并脾亢患者心脏负性重塑。

Ota等[19]进行了MI后支架内再狭窄患者微量蛋白尿和EPCs衰老之间相关性研究，纳入45例AMI患者，并根据其尿白蛋白排泄定量分为正常组和微量蛋白尿组，结果显示，两组心肌损害程度无显著差异，正常组EPCs粘附功能较基线水平明显改进，微量蛋白尿组粘附功能无改变，衰老细胞比例明显高于正常组。研究提示急性心肌梗死患者合并微量白蛋白尿，是通过加速EPCs内皮细胞衰老，从而导致经皮冠状动脉介入疗法（PCI）支架术后冠状动脉再狭窄发生。EPCs参与血管新生与修复，因而对EPCs动员成为治疗冠心病的一个新途径。

Koller等[20]一项关于CHF循环中EPCs水平与预后的相关性研究，入组185例患者，其中包括87例缺血性CHF患者和98例（53 %）非缺血性CHF患者，结果显示EPCs数量是一个有意义的独立的病死率预测指标，因此EPCs在血管内皮修复机制的病理生理和CHF进展中具有重要作用。丹红具有动员骨髓来源的EPCs，加速再内皮化来修复损伤血管。

Hu等[21]评价PCI术后丹红注射液动员EPCs的能力，以及EPCs介导的血管内皮损伤修复的效果。研究共入组42例进行冠状动脉检查并行PCI手术的冠心病和胸痛患者，随机分为对照组和丹红注射液组，对照组接受标准药物治疗，丹红注射液组接受标准药物治疗联合丹红注射液。结果显示：与对照组相比，丹红注射液组炎性因子表达水平明显降低，循环内皮细胞数量减少，EPCs数量显著增加，说明丹红注射液治疗后通过抑制炎症反应使EPCs动员增加，减少血管内皮损伤，促进PCI术后内皮修复，加速患者恢复，从而避免支架内再狭窄的发生。

Zhao等[22]给予MI后心衰患者G-CSF，观察其对心功能和心肌能量消耗的影响，38例MI后心衰患者被随机分为G-CSF实验组和对照组。结果显示，实验组EPCs数量以及LVEF较对照组明显改善，说明G-CSF不仅可以动员EPCs还可以改善MI后心衰患者心功能。

Li等[23]一项纳入28项随机对照试验共1938例ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者Meta分析结果显示，干细胞治疗可以长期改善左心室射血分数、左心室收缩末期容积以及左心室舒张末期容积显著降低、治疗后12个月STEMI患者梗塞面积显著减少，总而言之，干细胞治疗STEMI患者效果满意，不良事件发生率低。

3 内皮祖细胞对缺血性心脏病的移植治疗

3.1 内皮祖细胞经外周血管内注射移植 EPCs具有归巢功能为临床通过外周血管注射移植成为一种可行途径，优点是：简单、易行、不需要复杂设备和技术、可以通过血液循环定期、定时、持续向缺血病变部位进行移植，从而维持缺血组织有效的EPCs浓度提高疗效。缺点是：主要是冠状动脉血流量仅为心排血量3%，每次心搏只能有一小部分移植的EPCs经过冠状动脉，为达到移植治疗效果，使缺血部位保持一定的移植细胞数量和浓度，就需要反复多次注入移植细胞。

3.2 内皮祖细胞经冠状动脉移植 Lee等[24]经冠状动脉自体移植外周血来源的CD34+细胞，改善不适合介入治疗的终末期弥漫性冠状动脉疾病患者的左室功能，以测试两种不同浓度的CD34+细胞在治疗严重弥漫性冠状动脉疾病的有效性和安全性，并验证经冠状动脉自体移植外周血来源的CD34+细胞，能否改善严重弥漫性冠状动脉疾病且对药物治疗耐受和不适合介入患者的缺血相关性左室功能障碍。研究纳入38例严重弥漫性冠状动脉疾病患者，随机分为两组，经冠状动脉分别注射1.0×107或3.0×107个浓度的CD34+细胞，结果显示，经冠状动脉移植CD34+细胞后，冠状窦血液样本中EPCs含量高于外周血，左室射血分数改善，新生血管生成增加，心绞痛及心衰症状较细胞移植前明显减轻。因此，CD34+细胞治疗可以安全有效改善严重弥漫性CAD，且对药物治疗耐受和不适合介入治疗患者的缺血相关性左室功能障碍。Quyyumi等[25]的关于STEMI后左室功能障碍患者经冠状动脉自体移植CD34+细胞的随机、双盲、安慰剂、对照临床试验，评价经冠状动脉自体移植CD34+细胞治疗STEMI后左室功能障碍患者的安全性及有效性。研究入组161例接受支架植入术伴左室功能障碍的STEMI患者，随机分为自体移植CD34+细胞实验组和安慰剂对照组，随访1年无不良反应和无主要心脏不良事件发生，说明STEMI后左室功能障碍患者经冠状动脉自体移植CD34+细胞具有很高的安全性，并随着移植细胞浓度的增加，左室射血分数明显改善、梗死面积明显减少，院外生存时间延长，有效性良好。

3.3 内皮祖细胞经心内膜注射移植 Fuente等[26]对20例左室射血分数≤40%的心衰患者，经心内膜自体移植骨髓EPCs治疗，证明左室射血分数和运动耐受时间显著提升，且该方法安全有效。Wojakowski等[27]把31例难治性心绞痛患者非随机分为治疗组和对照组，主要研究终点为心肌缺血面积减少，次要终点为左心室功能和容积改变。通过经心内膜注射方法移植自体骨髓CD133+治疗，结果显示，治疗组与对照组比较左室收缩末期和舒张末期容积均有明显改善，但该方法远期安全性有待于进一步证实。

3.4 内皮祖细胞经心外膜注射移植 直视下经心外膜心肌内注射EPCs，不仅可以保证植入部位准确和植入细胞数量，还可省略EPCs动员和归巢过程提高了移植细胞利用效益。因为心肌内注射具有创伤性，存在显著的围手术期风险，不适合MI患者，而对于实施冠状动脉旁路移植术患者同时进行经心外膜心肌内注射移植是一种合理选择。Stamm等[28]为一名实施冠状动脉旁路移植术患者同时经心外膜心肌内注射骨髓AC133+细胞进行细胞移植治疗。经心外膜心肌内注射EPCs移植诱发室性心律失常风险有待进一步观察。

3.5 内皮祖细胞移植对冠心病支架术后再狭窄预防 冠状动脉支架术后支架内血栓和再狭窄防治成为临床亟待解决的课题。当前主要应用药物洗脱支架（DES）进行支架置入后再狭窄的防治，但该方法有其局限性，仍然会发生支架内血栓，出现与损伤愈合相关的新生动脉粥样硬化，以及晚期支架内再狭窄所需的再次血运重建障碍。近年来，应用EPCs移植或EPCs动员剂在血管内支架上接种技术，开发EPCs捕获支架预防血栓形成和再狭窄成为研究热点。Woudstra等[29]报告纳入2013年6月～2014年3月间共1000例患者，评价组合支架使用1年的安全性和临床结果，应用同时携带雷帕霉素生物可降解涂层和CD34+抗体涂层的新型生物组合支架，募集EPCs以此促进血管重塑，从而防止内膜增生和再狭窄。结果发现，其中49.9%的患者出现急性冠状动脉综合征，5.7%的患者发生TLF，1.7%的患者发生心源性死亡，靶血管MI和TLR发生率分别是0.7%，4.4%，0.5%的患者支架内血栓形成。此研究显示在所有患者中应用新型组合生物支架1年临床结果理想，应用新型组合生物支架1年观察结果显示了良好的前景。

4 展望

随着EPCs研究和探索不断深入，EPCs对IHD的治疗研究一定会取得更大的进展，但我们仍需保持清醒认识，进一步研究任重道远，我们对EPCs生物学特性、对其促进血管新生机制及信号传导途径仍需要深入研究和探索。如何选择移植细胞合适治疗浓度、移植远期安全性、移植治疗诱发肿瘤风险、骨髓来源EPCs在治疗中的利弊、EPCs移植治疗技术与血管重建技术的有机结合[30]，这些课题仍然是我们进一步研究的重点。我们相信，EPCs治疗IHD方法和技术会更加成熟，具有乐观的前景。

[1] Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J]. Science,1997,275(5302):964-7.

[2] Emontzpohl C,Simons D,Kraemer S,et al. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery[J]. J Vis Exp,2017,120:e55192.

[3] Xia WH,Chen L,Liang JW,et al. BMP4/Id2 signaling pathway is a novel therapeutic target for late outgrowth endothelial progenitor cell-mediated endothelial injury repair[J]. Int J Cardiol,2017,228: 796-804.

[4] Minami Y,Nakajima T,Ikutomi M,et al. Angiogenic potential of early and late outgrowth endothelial progenitor cells is dependent on the time of emergence[J]. Int J Cardiol,2015,186:305-14.

[5] Lee JH,Ji ST,Kim J,et al. Specific disruption of Lnk in murine endothelial progenitor cells promotes dermal wound healing via enhanced vasculogenesis,activation of myofibroblasts,and suppression of inflammatory cell recruitment[J]. Stem Cell Res Ther, 2016,7(1):158-70.

[6] Peichev M,Naiyer AJ,Pereira D,et al. Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34+cells identifies a population of functional endothelial precursors[J]. Blood,2000,95(3):952-8.

[7] Qin M,Guan X,Wang H,et al. An effective ex-vivo approach for inducing endothelial progenitor cells from umbilical cord blood CD34+cells[J]. Stem Cell Res Ther,2017,8(1):25-35.

[8] Yang SW,Hennessy RR,Khosla S,Lennon R,et al. Circulating osteogenic endothelial progenitor cell counts:new biomarker for the severity of coronary artery disease[J]. Int J Cardiol,2017,227:833-9.

[9] Wang S,He W,Wang C. MiR-23a Regulates the Vasculogenesis of Coronary Artery Disease by Targeting Epidermal Growth Factor Receptor[J]. Cardiovasc Ther,2016,34(4):199-208.

[10] Jin Y,Yang CJ,Xu X,et al. MiR-214 regulates the pathogenesis of patients with coronary artery disease by targeting VEGF[J]. Mol Cell Biochem,2015,402(1):111-22.

[11] Morishita T,Uzui H,Ikeda H,et al. Association of CD34/CD133/ VEGFR2-Positive Cell Numbers with Eicosapentaenoic Acid and Postprandial Hyperglycemia in Patients with Coronary Artery Disease[J]. Int J Cardiol,2016,221:1039-42.

[12] Chen Q,Varga M,Wang X,et al. Overexpression of Nitric Oxide Synthase Restores Circulating Angiogenic Cell Function in Patients With Coronary Artery Disease:Implications for Autologous Cell Therapy for Myocardial Infarction[J]. J Am Heart Assoc,2016,5(1): e002257.

[13] Park YJ,Kim JY,Park J,et al. Bone erosion is associated with reduction of circulating endothelial progenitor cells and endothelial dysfunction in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheumatol,2014,66(6):1450-60.

[14] Eibel B,Markoski MM,Rodrigues CG,et al. VEGF gene therapy cooperatively recruits molecules from the immune system and stimulates cell homing and angiogenesis in refractory angina[J]. Cytokine,2017,91:44-50.

[15] Cheng CC,Chang SJ,Chueh YN,et al. Distinct angiogenesis roles and surface markers of early and late endothelial progenitor cells revealed by functional group analyses[J]. BMC Genomics,2013,14:182-92.

[16] Zhao YH,Yuan B,Chen J,et al. Endothelial progenitor cells: therapeutic perspective for ischemic stroke[J]. CNS Neurosci Ther,2013,19(2):67-75.

[17] Cuadrado-Godia E, Regueiro A, Nú ez J,et al. Endothelial Progenitor Cells Predict Cardiovascular Events after Atherothrombotic Stroke and Acute Myocardial Infarction. A PROCELL Substudy[J]. PLoS One,2015,10(9):e0132415.

[18] Tang Y,Lu W,Zhang Z,et al. Hypersplenism:an independent risk factor for myocardial remodeling in chronic heart failure patients[J]. Int J Clin Exp Med,2015,8(4):5197-206.

[19] Ota H,Takehara N,Aonuma T,et al. Association between microalbuminuria predicting in-stent restenosis after myocardial infarction and cellular senescence of endothelial progenitor cells[J]. PLoS One,2015,10(4):e0123733.

[20] Koller L,Hohensinner P,Sulzgruber P,et al. Prognostic relevance of circulating endothelial progenitor cells in patients with chronic heart failure[J]. Thromb Haemost,2016,116(2):309-16.

[21] Hu Z,Wang H,Fan GW,et al. Effect of danhong injection on the mobilisation of endothelial progenitor cells to vascular repair after percutaneous coronary intervention: a randomised controlled trial[J]. The Lancet,2016,388:S34

[22] Zhao Z,Luo J,Ma L,et al. Effect of granulocyte colony stimulating EPC on cardiac function and myocardial energy expenditure in patients with heart failure after myocardial infarction[J]. Int J Clin Exp Med,2015,8(9):16578-84.

[23] Li R,Li XM,Chen JR. Clinical efficacy and safety of autologous stem cell transplantation for patients with ST-segment elevation myocardial infarction[J]. Ther Clin Risk Manag,2016,12:1171-89.

[24] Lee FY,Chen YL,Sung PH,et al. Intracoronary Transfusion of Circulation-Derived CD34+ Cells Improves Left Ventricular Function in Patients With End-Stage Diffuse Coronary Artery Disease Unsuitable for Coronary Intervention[J]. Crit Care Med,2015;43(10):2117-32.

[25] Quyyumi AA,Vasquez A,Kereiakes DJ,et al. PreSERVE-AMI: A Randomized,Double-Blind,Placebo-Controlled Clinical Trial of Intracoronary Administration of Autologous CD34+ Cells in Patients With Left Ventricular Dysfunction Post STEMI[J]. Circ Res,2017,120(2):324-31.

[26] de la Fuente LM,Stertzer SH,Argentieri J,et al. Transendocardial autologous bone marrow in myocardial infarction induced heart failure, two-year follow-up in an open-label phase I safety study (the TABMMI study)[J]. EuroIntervention,2011,7(7):805-12.

[27] Wojakowski W,Jadczyk T,Michalewska-Wludarczyk A,et al. Effects of Transendocardial Delivery of Bone Marrow-Derived CD133+ Cells on Left Ventricle Perfusion and Function in Patients With Refractory Angina: Final Results of Randomized,Double-Blinded,Placebo-Controlled REGENT-VSEL Trial[J].Circ Res,2017,120(4):670-80.

[28] Stamm C,Westphal B,Kleine KD,et al. Autologous bonemarrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration[J]. Lancet,2003, 361(9351):45-6.

[29] Woudstra P,Kalkman DN,Heijer PD,et al. 1-Year Results of the REMEDEE Registry: Clinical Outcomes After Deployment of the Abluminal Sirolimus-Coated Bioengineered (Combo) Stent in a Multicenter, Prospective All-Comers Registry[J]. JACC Cardiovasc Interv,2016,9(11):1172-34.

[30] 张百灵,王照飞,张航,等. CXCR4基因过表达HUCB-late EPCs移植对大鼠后肢缺血组织血管新生的影响[J]. 中国动脉硬化杂志,2017,25(3):238-43.

本文编辑：杨新颖，姚雪莉

欢迎投稿，欢迎订阅！

中国科技核心期刊，科技论文统计源期刊

E-mail:ebcvm_cj@126.com；

网址：www.ebcvmcj.com/www.ebcvmcj.org

R542.2

A

1674-4055(2017)07-0873-03

1100853 北京,中国人民解放军总医院心血管内科

陈韵岱,E-mail:cyundai@vip.163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.07.35