人诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化及其应用于临床治疗的研究进展

姬小利，王敏，李玲玲，周君梅

人诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化及其应用于临床治疗的研究进展

姬小利，王敏，李玲玲，周君梅

视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞是位于视网膜最外层的单层细胞，呈六角形，胞内富含黑色素。其功能主要包括：①吞噬感光细胞外节段；②代谢视紫红质；③参与构成血-视网膜屏障；④合成黑色素等。RPE细胞的功能丧失会引起多种视网膜疾病，如年龄相关黄斑变性、Stargardt 病等[1]。RPE 细胞已经到达终末分化阶段，损伤后无法再生，因此细胞移植成为治疗其病变的理想方法。具有多向分化潜能的干细胞可作为 RPE 细胞的种子来源。研究者们曾利用胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）[2]、成体干细胞如骨髓间充质干细胞[3]，定向诱导分化为 RPE 细胞进行移植治疗。但由于 ESCs 存在伦理学和免疫排斥等问题[4]、成体干细胞存在增殖能力和分化潜能有限等问题[5]，阻碍了其在临床上的应用。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的出现为 RPE 细胞的移植治疗带来了新的希望。

ESCs 的研究是 iPSCs 研究的重要前期基础。ESCs 来源于早期囊胚的内细胞团，其在体外合适的培养环境下可自我更新、定向分化。ESCs 的获取需破坏早期胚胎，故其来源受限，且分化后的细胞用于异体移植治疗时会发生免疫排斥。因此，研究者通过向成体细胞中导入和 ESCs 多能性密切相关的基因，以起始的成体细胞为种子细胞，通过诱导重编程建立了具有 ESCs 特性的自体来源的 iPSCs。iPSCs最初于 2006年由日本科学家 Takahashi 和 Yamanaka[6]通过逆转录病毒将 4 种转录因子（Oct3/4、Sox2、Klf4 和c-Myc）导入小鼠的成纤维细胞使其重编程而获得。2007年，Takahashi 等[7]和 Yu 等[8]分别将人的皮肤成纤维细胞重编程为 iPSCs，为其临床应用提供了可能。近年来，iPSCs重编程技术已经从最初的 DNA 途径[6]、RNA 途径[9]拓展到蛋白[10]以及目前的小分子化合物途径[11]。随着定向诱导分化方案的不断优化，其诱导效率及安全性也进一步得到了提高。人 iPSCs 是将患者自身来源的体细胞重编程为多能干细胞，避开了人 ESCs 建系时需要破坏早期胚胎的伦理问题；其在体外可被诱导分化为特定类型的细胞如神经细胞[12]、心肌细胞[13]、视网膜神经节细胞及色素上皮细胞[14-15]等用于自体的细胞移植治疗，解决了免疫排斥和细胞来源受限的问题。由于其具有重大意义，iPSCs 建系仅 6年即获得 2012年诺贝尔生理学或医学奖。近十年来，iPSCs 诱导分化及细胞移植治疗，一直是研究者们关注的焦点。

本文拟就人 iPSCs 向 RPE 细胞分化、利用人 iPSCs来源的 RPE 细胞进行临床移植治疗以及治疗中所面临的问题等进行综述。

1 人 iPSCs 向 RPE 细胞的分化

1.1 自发分化法

自发分化法即不添加任何外源因子，使 iPSCs 自发分化，这是研究者最先尝试的一种诱导分化方法。即通过将iPSCs 培养液中维持其干细胞特性所需的碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）撤去，后续通过不断的培养、分选，即可获得含有色素的小克隆，与人ESCs 来源的 RPE 细胞及流产胎儿来源 RPE 细胞进行比较，iPSCs 自发分化得到的 RPE 细胞在形态、特异性标志物及功能方面均与前两者十分相似[16-18]。自发分化不需要添加外源因子、操作简单，是相对简单的一种分化方法。但由于分化效率低下（＜ 1%）、细胞分化不同步，获得的 RPE 细胞需要长时间分选和纯化后才能用于后续研究。因此，研究者尝试了更高效率的共培养，如根据其发育特点循序添加诱导因子等定向诱导分化方法。

1.2 共培养诱导分化法

2002年，Kawasaki 等[19]在诱导灵长类动物 ESCs 向外胚层细胞分化的过程中，发现 ESCs 与基质细胞 PA6共培养 3 周后可观察到 RPE 细胞的出现。随后，Haruta等[20]和 Hirano 等[21]通过同样的共培养方式，均获得了ESCs 来源的 RPE 细胞。在此研究基础上，Okamoto 和Takahashi[22]将食蟹猴来源的 iPSCs 与 PA6 细胞共培养，得到的 PRE 细胞不仅具有典型的六边形形态，并且表达其特异性标志物如 RPE65、CRALBP 等。共培养诱导分化体系中，用于共培养的各种细胞通过分泌因子释放到培养液中，提高了 iPSCs 向 RPE 细胞的分化效率，但是具体发挥作用的因子及其机制目前并不清楚。虽然共培养可以在一定程度上提高 iPSCs 向 RPE 细胞分化的效率，但是其潜在的异源细胞污染为临床应用带来了隐患。因此，该诱导方法更多用于研究 RPE 细胞分化的机制，但在分化后的移植治疗研究中并不常用。

1.3 外源因子诱导分化法

根据特定类型细胞的体内发育特点，定向诱导分化法可通过循序添加决定细胞命运的外源因子来缩短诱导时间、提高诱导效率、促进同步分化。目前人 iPSCs 向 RPE 细胞定向诱导分化的外源因子主要包括一些转录因子、重组蛋白和小分子化合物等。

1.3.1 细胞因子或重组蛋白诱导法 基于在前期研究中发现的 Dkk-1、Lefty 和 Noggin 等与外胚层分化的相关性，这些外源性的细胞因子或重组蛋白被应用于多能干细胞向RPE 细胞的定向诱导分化。2008年，Osakada 等[23]使用Dkk-1 联合 Lefty 将人的 ESCs 诱导分化为 RPE 细胞。在此研究基础之上，2009年，该课题组使用同样的方案诱导人来源的 iPSCs 向 RPE 细胞分化，第 35 天观察到约有 30% 的克隆表达 PRE 细胞特异性标记物，第 40 天约有 39% 的克隆有色素形成，随后又观察到 RPE 细胞典型形态的出现。该研究不仅得到了 iPSCs 来源的 RPE 细胞，而且其诱导效率及时间与 ESCs 向 RPE 细胞的诱导十分接近。2011年，Meyer 等[24]在诱导人 iPSCs 向 RPE 细胞分化的过程中，首先加入 Noggin 和 Dkk-1，在第 20 天，观察到约有 20% 的视泡样结构的细胞团出现，将这些细胞团挑选出来继续分化培养，并在诱导体系中加入 TGF-β 超家族成员 Activin A，培养 40～60 d 后发现细胞色素加深、RPE 细胞特异性基因表达水平明显增高。2012年，Zahabi等[25]联合使用 bFGF、Noggin、RA 以及 Shh，诱导 4 周后可以看到分化的细胞团，35 d后可以观察到鹅卵石样色素细胞出现。2016年，Lidgerwood 等[26]通过使用鸡尾酒诱导法（同时加入 IGF1、Dkk-1、Noggin、bFGF、B27 和 N2）诱导 20 d，初步观察到色素克隆的出现，第 40～60 天获得了大量的色素克隆，除了形态学、功能学等方面的鉴定，该团队通过 RNA-seq 对第 60 天获得的 RPE 细胞进行基因表达分析，结果表明人 iPSCs 来源的 RPE 细胞与成人来源的 RPE 细胞在基因表达上具有高度的相似性。在诱导的适当时机循序加入细胞因子或者重组蛋白，缩短了诱导时间、提高了诱导效率，但这些外源性细胞因子或重组蛋白大多是动物源性或者细菌源性，存在着免疫排斥及跨物种污染等风险，且不同批次之间的差异性也可能导致诱导效果的巨大差异，因而也是亟待解决的问题。化学小分子也因其稳定性好、批次差异小以及不存在跨物种间污染等优势而被用于定向诱导分化研究。

1.3.2 小分子化合物诱导法 小分子化合物以其独特的优势在干细胞研究中的应用越来越广泛，其选择也是基于前期研究中发现的小分子的作用通路和 RPE 细胞的体内发育特征。Osakada 等[27]在其前期用重组蛋白（Dkk-1、Lefty）诱导 ESCs 分化为 RPE 细胞的研究基础上，利用两种分别可以阻断 Wnt、Nodal 信号通路的小分子化合物抑制剂CKI-7 和 SB-431542，诱导人 iPSCs 向 RPE 细胞分化，40 d 后观察到约有 29.1% 的色素克隆出现，第 60 天，约有 29% 的细胞表现出了 RPE 细胞典型的六边形形态。Westenskow 等[28]在诱导人 iPSCs 向 RPE 细胞分化的过程中，对比 Nicotinamide + Activin A 及 Nicotinamide +IDE-1 两种诱导方法，发现用小分子抑制剂 IDE-1 替换Activin A，不仅同样可以在 5～7 周的时间获得 RPE 细胞，而且大大降低了费用。此外，Maruotti 等[29]利用高通量技术筛选出两种可以促进人 iPSCs 向 RPE 细胞分化的小分子化合物 Chetomin（CTM）和 Nicotinamide（NIC），用 CTM + NIC 诱导 2 周后，转移到 RPE 细胞基础培养基中继续培养 1～2 周，即可观察到色素克隆出现，5 周后，色素克隆占满了整个培养基。与 Osakada 等[27]的小分子化合物结合重组蛋白的诱导方案相比，Maruotti 等[29]用两种化学小分子 CTM 和 NIC，将人 iPSCs 向 RPE 细胞的诱导分化时间缩短到 35 d，其诱导效率也提高到了 45% ～60%。综上，从最初的与重组蛋白联合应用以期增加诱导效率、缩短诱导时间，到目前单独应用小分子化合物进行诱导分化，小分子化合物凭借其无免疫排斥和跨物种间污染等风险、化学性质稳定和批次差异性小等优点，在 iPSCs 向RPE 细胞的诱导分化研究中，得到研究者们越来越多的青睐。

2 人 iPSCs 来源 RPE 细胞的移植治疗

眼凭借其组织结构小、修复需要的细胞量少、可直视下手术、定位准确、免疫豁免区有利于移植细胞存活等优点，在细胞移植治疗领域存在较大优势[30]。2004年，Haruta等[20]将猴 ESCs 来源的 RPE 细胞移植到 4 周龄皇家外科学院大鼠（royal college of surgeon rat，RCS）的视网膜下区，移植的 RPE 细胞通过提高感光细胞的存活率而改善大鼠的视功能。随后，研究者们利用人 ESCs 来源的 RPE 细胞在动物模型上进行移植治疗，结果表明，移植 ESCs 来源的 RPE 细胞不仅可以在一定程度上改善其视功能，且安全性和移植效率均可得到保证[31-32]。2011年，美国食品药品管理监督局批准了使用人 ESCs 来源的 RPE 细胞治疗年龄相关性黄斑变性（NCT01344993）和 Stargardt 病（NCT01345006）的 I/II 期临床试验[33]，通过对接受移植治疗的患者进行为期 22 个月的评估观察，接受移植的18 例患者中，10 例患者的视力得到明显改善，7 例视力不变，1 例视力下降。此外，在整个过程中未发现免疫排斥、肿瘤发生等安全性问题。在 ESCs 来源的 RPE 细胞移植的研究基础上，研究者们开始尝试用人 iPSCs 来源的 RPE细胞进行移植治疗，旨在避免使用 ESCs 进行相关实验所引起的免疫排斥及医学伦理等问题。Carr 等[34]将人 iPSCs来源的 RPE 细胞移植到出生 22～23 d RCS 大鼠的视网膜下区，移植的 RPE 细胞可通过不断吞噬脱落的感光细胞膜盘来帮助维持其代谢，从而改善大鼠视功能。Li 等[35]在其前期分别利用胎鼠来源 RPE 细胞[36]以及人 ESCs 来源的 RPE 细胞[37]进行移植治疗的基础上，用人 iPSCs 来源的 RPE 细胞移植到新生 2 d 视网膜变性的模型鼠身上，在其存活的 6 个月内，视网膜电流图显示其视功能有明显的改善。为了确保人 iPSCs 来源的 RPE 细胞在临床应用中的安全性，Kanemura 等[38]和 Kamao 等[39]首先将人 iPSCs来源的 RPE 细胞移植到大鼠和猴视网膜下区，均未观察到免疫排斥或肿瘤发生等安全性问题。在此基础上，该团队于2014年得到日本政府批准后实施了世界上第一例自体iPSCs 来源的 RPE 细胞的临床试验[40]：研究者首先将一位患有年龄相关性黄斑变性患者的体细胞重编程为 iPSCs，再将其定向诱导分化为 RPE 细胞，然后将其用于自身的移植治疗。自体来源的 iPSCs 虽然避免了免疫排斥等问题，但其制备时间及费用、突变位点的纠正等问题不容忽视。2017年 4月，日本实施了世界上首例异体来源 iPSCs 来源RPE 细胞的移植治疗[41]：研究者为一名患有老年黄斑变性的 60 岁男性患者移植了异体来源的 RPE 细胞，移植过程顺利，移植效果目前正在追踪观察中，该研究预计共实施5 例异体 iPSCs 移植。日本目前正在积极创办一个“用于可再生医学的 iPSCs 干细胞库”，以此来满足大多数日本人口的需求匹配。由不同捐献者的 iPSCs 所组成的干细胞库将有望使干细胞移植成本更低且更方便。将来，异体iPSCs 移植有望像同型输血一样方便。

此外，通过检索美国临床试验注册网站（https://www.clinicaltrials.gov），其中涉及到 iPSCs 向 RPE 细胞分化及应用的临床试验项目共有 4 项（NCT02162953、NCT02464956、NCT01432847 和 NCT02193724），由此可见，虽然 iPSCs 在临床应用中的安全性问题有待进一步考察，但是其凭借自体来源，避免了免疫排斥及医学伦理等优势，在临床应用中具有更加广阔的前景。

3 人 iPSCs 来源的 RPE 细胞用于临床治疗所面临的问题

虽然人 iPSCs 及其向 RPE 细胞分化的研究已经取得突破性进展，但目前亟待解决的问题还有很多，主要包括：①如何进一步提高移植细胞安全性；②如何解决移植细胞的流失问题；③对于遗传所致的视网膜变性患者，如何规避移植 iPSCs 来源的 RPE 细胞的遗传缺陷等。针对这些问题，研究者们也在不断提出新的解决方案：针对移植细胞的安全性，通过优化重编程方案[6-11]（重编程水平从病毒转染、蛋白质诱导到目前的小分子化合物诱导）、纯化诱导后细胞[23-24]（流式细胞分选纯化、手动挑选色素克隆），可以降低 iPSCs 重编程过程及其本身定向分化不完全所致的潜在致瘤性、大大提高移植细胞的安全性；针对移植细胞流失的问题，细胞膜片[39]及支架材料[42]的应用可提高移植细胞在视网膜下区的定植和存活；针对遗传所致的视网膜变性患者面临的移植细胞的遗传缺陷，利用 CRISPR-Cas9 等新一代基因编辑技术，对患者的病变基因位点予以纠正，其用于自体移植治疗的细胞不再携带有致病基因位点，可避免移植自体来源 RPE 细胞的再致病。目前 CRISPR-Cas9 技术在临床上已经开始应用，2016年 10月，四川大学肿瘤学家卢铀团队，首次利用 CRISPR-Cas9 技术对免疫细胞进行基因编辑，然后将其用于肺癌患者的自体治疗[43]。北京大学研究团队也正在筹划将该技术应用到膀胱、前列腺以及肾脏等方面的恶性肿瘤治疗上[44]。虽然目前 CRISPR-Cas9 用于临床疾病的治疗尚在起步阶段，我们相信，随着技术的成熟，将 CRISPR-Cas9 技术联合 iPSCs 应用于遗传因素所致的RPE 患者的治疗具有重要前景。此外，异体 iPSCs 的移植也为解决该问题开辟了一条更方便、快捷的新途径。

综上所述，iPSCs 技术的建立被认为是干细胞研究领域的重大突破，不仅因为其在基础研究领域的重要性，更因其在许多难治病和罕见病的细胞移植治疗方面正逐渐从基础走向临床。目前人 iPSCs 向 RPE 细胞的诱导分化方案已经较为成熟，相信人 iPSCs 来源的 RPE 细胞的移植可作为一种新的治疗方法应用到临床中，以造福视网膜色素变性患者。

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国家自然科学基金（81270742、81370700、81470911）；上海交通大学医工交叉基金（YG2016MS32）；上海市卫计委重点课题（201540389）

200040 上海交通大学附属儿童医院中心实验室（姬小利、王敏）；200040 上海市儿童医院中心实验室（李玲玲、周君梅）

周君梅，Email：junmei_zhou@139.com

2017-05-08