新生儿缺氧缺血性脑病的实验研究现状

刘 华，李 芳，张 坤，肖东杰，汪运山

（1山东大学附属济南市中心医院中心实验室，2山东省移植与组织工程研究中心，山东济南250013）

新生儿缺氧缺血性脑病的实验研究现状

刘 华1，2，李 芳1，2，张 坤1，2，肖东杰1，2，汪运山1，2

（1山东大学附属济南市中心医院中心实验室，2山东省移植与组织工程研究中心，山东济南250013）

新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）是由围产期缺氧所致的颅脑损伤，是导致新生儿死亡的主要原因之一，目前还没有很好的治疗措施.因此，了解该病的发病机制，有助于促进基础医学向临床转化.本文总结了HIE发病病因、病理生理机制，结合最新的研究现状，深入探讨HIE潜在的治疗靶点及目前研究的局限性，为制定新的研究方案指明方向，为基础医学向临床转化搭建桥梁.

新生儿；缺氧缺血性脑病；靶点

0 引言

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是围生期由于各种因素引起的新生儿部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停所致的脑组织病变表现.HIE是影响新生儿神经发育，导致新生儿死亡的主要原因之一.在全球范围内，HIE发病率约为1／1000～8／1000，在发展中国家高达26／1000，其中新生儿期死亡率为20%～25%，存活患儿约25%伴有永久性神经系统缺陷［1］.HIE轻症患者在学龄期有正常的认知能力，而中重度的HIE患者则伴有远期后遗症及运动认知障碍.

目前还没有针对新生儿HIE建立有效治疗措施.低温治疗是治疗新生儿中重度HIE常用保护方法.除了低温治疗以外，还需要全面的临床护理如机械通气、生理生化指标监控、神经影像学检查、癫痫检测和监控、神经系统的检查等.虽然低温治疗是目前临床研究中证实有效的治疗措施，但40%的HIE新生儿患者治疗后仍存在神经系统缺陷［2］.由于HIE损伤的病理生理机制相当复杂，因此深入了解新生儿HIE发病机理，有助于找到新的潜在的干预靶点以阻止细胞损伤.本文将会介绍HIE的发病原因、病理机制及研究现状，为基础医学向临床转化搭建桥梁，为治疗HIE提供新的思路.

1 发病原因

1.1 缺氧①围生期窒息:包括产前、产时和产后窒息，胎盘／脐带功能异常，异常分娩，子宫破裂，胎儿发育异常等；②呼吸暂停；③严重肺部感染:新生儿有严重呼吸系统疾病.

1.2 缺血①严重循环系统疾病:如心脏骤停，心动过缓，重度心力衰竭，严重的先天性心脏病等；②大量失血或休克；③严重颅内疾病:如颅内出血或脑水肿等.

在HIE病因中围生期窒息是导致本病的主要原因，产前和产时窒息各占50%和40%，其他原因共占10%.

2 病理生理机制

新生儿HIE损伤是个逐渐发展的过程，可以分为以下三个阶段［3］:

第一阶段是血流改变，原发性能量受损阶段.新生儿窒息胎盘血流中断，体循环动脉压降低，脑血流量减少，机体自我调节机制受损，葡萄糖氧化磷酸化不能进行，细胞的能量代谢变为无氧代谢，从而导致乳酸堆积、ATP耗竭、兴奋性氨基酸释放、Na+、Ca2+内流增加、细胞水肿，组织缺血坏死.细胞内Ca2+的增加将会导致膜电位去极化和脂肪酸的释放.神经元型一氧化碳合酶激活导致自由基堆积和线粒体功能障碍.线粒体功能障碍最终激活细胞凋亡或坏死信号通路.

第二阶段缺血再灌注，又称为“潜伏期”.窒息复苏后，脑血流恢复，磷酸激酶和ATP部分恢复，细胞水肿暂时消退.而在缺血缺氧后的6～48 h再次发生能量衰竭，兴奋性毒性、氧化应激及线粒体损伤等继续发展，此阶段不依赖脑组织酸中毒，所以和第一阶段有所不同.

第三阶段慢性炎症阶段.此阶段在整个疾病过程中最为关键，该阶段一旦启动，则会引发一系列级联生化反应.小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞损伤后会释放炎性因子以及其他有害物质，诱导慢性炎症反应，最终引起表观遗传学改变，抑制轴突生长、神经及突触的形成.

因此，HIE早期治疗的目的为减轻兴奋毒性、氧化应激反应及细胞凋亡所导致的细胞损伤，而后期治疗以减轻炎性因子释放，提高神经营养因子表达为治疗重点.其中第二阶段缺血再灌注阶段已证实是减轻脑损伤的最佳治疗时间窗［4］，而目前在国内的临床治疗中尚未被重视.

3 潜在干预靶点

3.1 血脑屏障血脑屏障包括基膜、毛细血管内皮细胞、紧密连接、周细胞及星形胶质细胞［5］.血脑屏障的每个组成部分在维持中枢神经系统稳定和功能中发挥重要作用.HIE发生后血脑屏障受损会严重影响中枢神经系统的功能.Kumar等［6］在分析比较43例HIE新生儿患者与20例健康新生儿脑脊液及血浆白蛋白表达水平中，发现HIE患者脑脊液白蛋白水平高出正常新生儿5倍，而血浆中白蛋白两者没有明显差异，这提示HIE损伤后血脑屏障的通透性发生改变.

有研究认为HIE损伤后血脑屏障的开启经过两个短暂阶段.第一阶段在缺氧缺血后数小时之内发生，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）参与此阶段［7-8］；6～24 h后进入第二阶段，小胶质细胞和星形胶质细胞活化，释放促炎细胞因子，诱导MMP、环氧酶触发蛋白酶的破坏以及氧化应激反应（reactive oxygen specise，ROS）的发生.血脑屏障一旦破坏，血液中的中性粒细胞和单核细胞会侵润到脑组织中加重病情［9］.

目前研究表明HIE损伤后，通过维持血脑屏障的稳定性和减少炎症反应的发生可以减轻脑损伤.Li等［10］在研究中发现在新生鼠HIE模型中，粒系集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）一方面通过抑制炎性因子TNF-α，IL-1β，及IL-12表达，上调抑炎因子IL-10，减轻脑水肿及神经炎性反应，另一方面通过下调内皮细胞黏附分子VCAM-1，ICAM-1，上调紧密连接蛋白Claudins3、5表达来稳定血脑屏障的，从而发挥治疗作用.Yang等［11］在新生大鼠HIE模型中，纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibirtor-1，PAI-1）通过抑制组织型纤溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，tPA），从而抑制MMP的活化，阻止HIE-tPA诱导的血脑屏障通透性增加，发挥治疗HIE的作用.

关于HIE损伤后血脑屏障的改变国内外学者已做了大量研究，但关于血脑屏障通透性改变的具体病理生理机制仍需要更多深入细致的研究.有研究表明内皮细胞对缺氧更加敏感，星形胶质细胞和周细胞对缺氧相对耐受［12］.因此进一步了解血脑屏障各组成部分之间的相互作用，有助于找到治疗HIE的新方法.

3.2 血管生成血管生成即血液进入无血管区域形成新的血管过程.血管生成是一个及其复杂的过程，一般包括血管基底膜的形成、血管内皮细胞的增殖迁移，迁移细胞的管形形成.有研究发现新生儿HIE大脑急性损伤后第一个月，激活新生血管生成［13］.Shaikh等［14］利用低温治疗发生窒息的新生儿，结果显示与正常健康新生儿相比，没有脑损伤的窒息新生儿上调促血管形成蛋白，如脂肪酸结合蛋白4，6-磷酸葡萄糖异构酶，神经菌毛素1，受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3，而发生脑损伤的窒息新生儿则下调表达抗血管形成蛋白，如胰岛素生长因子结合蛋白1，4，6.因此Shaikh等提出不能上调促血管形成蛋白的新生儿更易发生脑损伤，作为代偿，患儿将启动下调抗血管形成蛋白机制.由此可以看出促血管形成可作为出生窒息后是否发生脑损伤的重要决定因素.

血管生成可以作为新生儿HIE一个新的治疗靶点.然而新生儿HIE损伤发生后，如何激活血管生成，对寻找新的治疗策略提高脑损伤后功能及结构的恢复至关重要.Shaikh等利用磁共振成像技术（magnetic resonance imaging，MRI）检测新生儿窒息后脑血流变化，发现HIE损伤后一个月大脑高灌注激活血管生成.Pimentel-Coelh等［15］也表明移植脐血来源的CD34+细胞，通过诱导血管生成，促进损伤修复.综上所述，新血管生成对提高患儿生存率至关重要，将成为治疗HIE的潜在新靶点［16］.

3.3 神经再生神经再生包括神经细胞的增殖、迁移和分化.神经再生可持续存在，并贯穿到成人期.神经再生多发生在脑室下区和海马齿状回颗粒下层，这些区域的微环境调节神经再生的发生［17］.有研究表明HIE脑损伤可促进神经再生，但这一内源性修复机制仍然不能阻止脑损伤的发生［18］.Ong等［19］发现，HIE损伤后1～3周内同侧脑室下区免疫组化染色，未成熟神经元微管蛋白（Doublecortin，DCX）表达增加.然而，4周以后却检测不到新生的成熟神经元，这表明在HIE病理状态下，不利于新生神经元的存活和成熟.如何提高内源性修复机制，促进神经再生都将成为研究的热点.

大量研究发现外源性干细胞移植也能促进损伤后的神经再生.例如Zhang等［20］及van Velthoven等［21］研究证实在HIE动物模型中，脐带／骨髓来源的间充质干细胞可以明显促进神经再生和少突胶质细胞的形成.因此研究生理及病理条件下影响神经再生的各种因素，有助于找到新的治疗靶点.

3.4 自噬HIE损伤后不同的细胞有不同的死亡机制.自噬是近年来引起科学界关注的一种新的程序性细胞死亡方式，将其定义为Ⅱ型程序性细胞死亡，有望成为一种新的治疗靶点.自噬发生需要众多分子的参与，其发生过程分为启动、延长、成熟、裂解4个阶段.研究报道表明，自噬在疾病的不同时期，起到不同的作用.适量的自噬可以清除细胞内受损、变性的蛋白质、核酸及细胞器，并产生氨基酸、核苷酸供细胞循环利用.自噬的持续活化会导致细胞内蛋白质、细胞器大量降解，细胞无法维持基本功能，导致细胞凋亡或坏死的发生.

目前关于HIE损伤后自噬所起的作用尚存在争议.Balduini等［22］研究发现在新生鼠HIE早期，凋亡自噬同时增加，神经保护药物促进自噬的发生，而抑制自噬可促进神经细胞从凋亡向坏死转化.Chen等［23］发现浓度为50～200 ng／mL的脑源性神经生长因子（brain derived neurophic factor，BDNF）在体外通过诱导自噬保护缺氧后受损的神经元.BDNF通过PI3K-Akt-mTOR信号通路调控自噬.活化的mTOR复合物1可以引起蛋白翻译调控因子p70S6K的磷酸化，最终可以诱导自噬，起到神经保护作用.而Zhou等［24］在小鼠局造性脑缺血模型中发现，N-乙酰血清素通过抑制线粒体细胞凋亡途径及细胞自噬发挥神经保护作用.

自噬是一个复杂的过程，因此自噬在HIE发生或治疗作用中是起到神经保护作用还是损伤作用主要取决于自噬发生的部位、损伤的严重程度以及激活的时间.过去的十年中自噬作用越来越受到重视，但是自噬的作用机制尤其是神经损伤后的作用机制仍需要进一步研究.

4 研究现状的局限

4.1 体内外实验的局限一般来说，实验研究包括体内实验和体外实验.因为体外实验相对简单易行，所以大部分实验从体外实验开始.但体外实验脱离了细胞生存的内环境，存在一定的限制和不足，所以体内实验验证必不可少.如果体内实验可以验证体外实验，那结果会很有意义.大多数情况下，药物临床实验的体外实验有效，而动物体内实验无效.究其原因，可能与给药途径、药物毒性以及给药过程中存在的问题有关［25］.尽管一些研究证明动物体内实验价值不大，但在药物应用到临床之前这些实验是必需的.

4.2 动物模型的局限HIE和新生儿中风都是一个复杂的疾病，因此寻找适宜的动物模型，建立完善的大脑损伤后神经发育和行为学评价系统仍是一项艰巨的任务.Ashwal等［26］用MRI方法比较了rice-vannucci法HIE模型和线栓法新生儿中风模型，发现中风的损伤区域主要为身体同侧大脑中动脉区，而HIE损伤会造成大脑皮层广泛缺血，甚至对侧也可能存在损伤.

最近又有人提出了新的新生儿HIE模型，如围产期大鼠产时子宫外置，缺血缺氧20 min造成新生鼠大脑广泛损伤［27］.另一个围产期HIE模型则是通过切断胎儿的胎盘血液供应，模仿早产儿脑损伤［28］.产后永久性脑损伤模型则是用电凝法闭塞大脑中动脉，造成一个高度可重复的、一致的、可选择的皮质梗死区［29］.

大量实验动物模型的建立及新的实验方案出现提示选择合适的动物模型对验证治疗方案非常重要.在不同的动物模型制备中HIE损伤的时间和性质是关键因素.由于种族差异及神经系统对感觉运动皮层的反应不同，从动物研究到临床应用尚需要大量研究.由于灵长类动物跟人的神经系统相似，因此开展灵长类动物实验十分有必要.而目前为止仅有一例围产期灵长类动物的HIE模型［30］.尽管在动物模型的研究中与人类的生物学特性越接近越好，但是目前95%以上的动物实验还是以大鼠和小鼠为研究对象.另外还有几点需要注意:临床症状与治疗开始的延迟现象；动物模型结果评价的短期性与临床患者长期疗效评价的差距.

尽管在过去的几十年中，动物实验及动物实验技术的发展已经取得了很大的进步，但寻找可以充分模仿人类病理生理机制的动物模型仍面临巨大的挑战.

4.3 中枢神经系统给药途径的局限药物如何通过血脑屏障进入大脑是中枢神经系统给药所面临的挑战.在大多数研究中，研究者极少对药物复合物通过血脑屏障作出预测与评估，这也极大地限制了中枢神经系统给药途径的发展［31］.如果不能解决血脑屏障的问题，中枢神经系统药物只能局限于脂溶性、小分子量的化合物［32］.分子神经学的发展可能为中枢神经系统疾病的治疗提供新的研究方向.分子神经学研究的重点集中在信号通路及其传导机制，包括血脑屏障的转运机制和大脑-脑脊液血流屏障.

最新研究显示，新生大鼠HIE损伤后，紧密连接蛋白表达改变，出现快速短暂的血脑屏障损伤，并激活一些补偿机制［33］.这一现象的发现对药物早期进入脑组织提供了良好的治疗窗口.

4.4 新生儿用药的局限新生儿处于生理和代谢过程迅速变化的阶段，对药物具有特殊的反应.儿童，尤其新生儿参与的药物临床试验一般都放在成人药物临床Ⅲ期之后才开始.新生儿由于脏器发育尚不成熟，酶系统尚不健全，所以给药剂量、给药途径及给药时间需要根据新生儿自身的情况及药物代谢动力学特点个性化给药［34］.只有这样才能保证安全、有效的用药，发挥最佳治疗作用，减少毒副反应.而这无疑增加了新生儿药物开发，临床推广应用的成本.因此如何促进新生儿药物的开发，研制适合儿科的剂型、剂量对治疗HIE具有重要的临床意义.

综上所述，HIE是一个多因素、多环节综合因素造成的病理生理损伤，这需要针对不同阶段采用不同的治疗方法.任何单一的治疗措施都不能完全有效的阻断疾病的进展.针对HIE的治疗措施都应从“治疗时间窗”，血脑屏障的通透性，促进损伤部位的血管神经再生，阻止神经细胞死亡，提高药物治疗的安全性、有效性等多个方面考虑，联合治疗必将成为HIE治疗方向.

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R722.12

A

2095-6894（2017）01-72-04

2016-11-11；接受日期：2016-11-26

国家青年科学基金项目（81200950）；山东省科技发展计划（2014GSF118173）；中国博士后科学基金面上项目（2016M590637）

刘 华.博士，主管技师.研究方向:干细胞基础研究及临床转化.Tel:0531-85695365 E-mail:liuhuagreen＠126.com

汪运山.E-mail:sdjnwys＠163.com