溶瘤病毒的肿瘤免疫治疗研究进展

涂艳阳，李 倩，张永生，成迎端，王 欣，杨宏伟

（第四军医大学:1唐都医院实验外科，2唐都医院，陕西西安710038；3赛福地，美国新泽西08902；4哈佛医学院神经外科，美国波士顿02115）

溶瘤病毒的肿瘤免疫治疗研究进展

涂艳阳1，李 倩1，张永生2，成迎端3，王 欣4，杨宏伟4

（第四军医大学:1唐都医院实验外科，2唐都医院，陕西西安710038；3赛福地，美国新泽西08902；4哈佛医学院神经外科，美国波士顿02115）

溶瘤病毒作为一种新的肿瘤治疗制剂，通过病毒对肿瘤细胞的杀伤作用和诱导全身性抗肿瘤免疫反应两种作用机制引发抗肿瘤免疫反应.其具体的分子机制尚不明确，但可能由病毒在肿瘤细胞中的复制增殖而诱导细胞死亡、与肿瘤细胞抗病毒元件的相互作用、促进内在自发的或适应性抗肿瘤免疫反应等多种作用因素参与.本文综述了溶瘤病毒作为抗肿瘤治疗剂的免疫治疗原理、基因编辑提高溶瘤病毒的治疗效力及其临床应用.

溶瘤病毒；肿瘤细胞；免疫治疗

0 引言

溶瘤病毒是基于天然或基因工程改造的病毒，能够特异性地在肿瘤细胞中复制并杀伤肿瘤细胞.溶瘤病毒的这一肿瘤选择性复制特性距首次发现已有一个多世纪.近年来溶瘤病毒在临床试验中显示出良好的治疗疗效，使其再次成为一个研究热点［1］.近期，一种经工程改造的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）的1型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1，HSV-1）在晚期黑素瘤患者中完成了Ⅲ期临床试验并显示出较好的持久反应率［1］.该病毒由安进公司（Amgen）命名为T-Vec，是首个获美国FDA批准用于肿瘤治疗的溶瘤病毒免疫治疗制剂.

病毒感染结果具有多样性，这取决于病毒编码基因的致病性、病毒与宿主免疫系统之间的相互作用以及病毒复制或诱导潜伏感染的能力差异.与常规病毒疫苗不同的是，溶瘤病毒能够在瘤灶原位直接感染，溶解肿瘤细胞.此外，溶瘤病毒不需借助肿瘤细胞死亡裂解释放的特定肿瘤相关抗原而发挥作用，而且病毒能提供额外的“危险信号”促进有效的抗肿瘤免疫反应.溶瘤病毒通过两种不同的途径发挥抗肿瘤活性.其一，在肿瘤细胞中选择性复制扩增，导致肿瘤细胞直接溶解；其二，诱导全身性抗肿瘤免疫.这两种抗肿瘤机制的比重与肿瘤细胞的类型、病毒的特性以及病毒与肿瘤微环境、宿主免疫系统之间的相互作用密切相关.

溶瘤病毒诱导的免疫反应是一把双刃剑.一方面，在病毒感染活跃期通过肿瘤抗原的呈递病毒能够促进抗肿瘤免疫反应；另一方面，抗病毒中和效应则会抑制病毒复制和感染肿瘤细胞，而最终的治疗效果则是由这两种反向作用来共同决定的.

许多病毒被纳入溶瘤病毒免疫治疗载体之列，已有大量研究旨在优化这些病毒载体，例如减弱病毒致病性、增强免疫原性等［2］.迄今已有腺病毒（adenoviruses）、单纯疱疹病毒（herpes simplex virus）、脊髓灰质炎病毒（poliovirus）、痘病毒（poxviruses）、柯萨奇病毒（coxsackie virus）、新城疫病毒（newcastle disease virus）、麻疹病毒（measles virus）、呼肠孤病毒（reovirus）等用于临床试验.目前两种溶瘤病毒药物T-Vec和H101已获批上市.其中，H101是一种经基因改造的溶瘤腺病毒，是中国首个批准上市的肿瘤病毒治疗制剂，其联合化疗用于鼻咽癌的治疗［3］.

1 溶瘤病毒的免疫治疗原理

溶瘤病毒介导肿瘤消退的具体机制尚未完全阐明，但大多数溶瘤病毒则是凭借其直接杀伤宿主肿瘤细胞实现的.杀伤效力依赖于细胞靶向受体、病毒复制和宿主细胞的抗病毒反应元件的效率［4］.溶瘤病毒的溶瘤能力也依赖于病毒的种类、剂量、病毒趋向性以及肿瘤细胞对不同细胞死亡方式（包括细胞凋亡、坏死、程序性细胞死亡、自噬）的易感性差异.

正常细胞中存在多种用于检测、清除病毒颗粒的信号通路［5］.这些信号通路可被局部释放的干扰素（IFN）、胞内Toll样受体（TLRs）刺激，后者可被病毒元件所激活［6］.TLRs是细胞表面和胞内的识别受体，可与病原体相关分子（PAMPs）反应激活，PAMPs在病原细菌、病毒中十分常见，包括病毒衣壳、DNA、RNA、病毒蛋白产物.TLR信号可以激活宿主细胞的抗病毒反应和全身性天然免疫反应.一些参与溶瘤病毒清除的下游宿主细胞因子和受体主要包括TNF相关因子（TRAF）［7］、IFN调节因子（IRF）［8］和视黄酸诱导基因蛋白I（retinoin acid inducible gene-Ⅰ，RIG-Ⅰ）［9］.这些抗病毒机制加强了IFN的局部释放，从而激活PKR活性.PKR可由病毒元件激活，激活后会终止细胞蛋白的合成、促进细胞迅速死亡和病毒的清除.肿瘤细胞中上述信号通路则存在异常，因此病毒清除受阻［10］.不同种类的病毒会利用自身不同的异常信号通路来阻止细胞凋亡的发生，从而为病毒争取更多时间来完成病毒的生命周期.病毒在肿瘤细胞中复制后，大部分溶瘤病毒会诱导细胞死亡的发生，可以直接消除活的肿瘤细胞，也能启动全身性免疫应答.宿主免疫应答由细胞死亡类型和病毒感染细胞所释放的危险信号共同诱导.

1.1 适应性免疫应答病毒的扩增复制和病原性是机体免疫系统进化的主要驱动因素，且病毒疫苗还能够引发适应性免疫应答.溶瘤病毒介导的免疫治疗作用主要是通过激活或改变天然免疫和适应性免疫反应以达到抗肿瘤的治疗疗效.病毒感染宿主后天然免疫和适应性免疫细胞、信号因子（细胞因子和炎症趋化因子）均参与其中，二者之间的相互作用在抗肿瘤免疫治疗的有效性上发挥着重要作用.溶瘤病毒感染引发的炎症反应导致适应性免疫应答，反过来又会抵抗病毒的扩散.因此，最初机体的免疫系统被视作溶瘤病毒治疗中的一种负向作用，其原因包括:①原有的或治疗诱导的免疫反应抑制病毒的感染和传递；②抗病毒天然免疫反应抑制病毒的复制扩增；③天然免疫细胞的浸润限制了病毒的扩散传递［11］.早期的研究利用缺乏适应性免疫应答的免疫缺陷小鼠的人类异种移植肿瘤模型，而目前应用免疫功能正常小鼠的同源肿瘤模型进行的研究表明，借助引发免疫反应来实现抗肿瘤的治疗效应具有可行性和有效性［11］.多种溶瘤病毒可充当病毒疫苗，在肿瘤灶局部引发强烈、持久性、特异性的适应性免疫反应，发挥抗肿瘤效应.

溶瘤病毒感染肿瘤细胞进而引发炎症级联反应和免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD），使得溶瘤病毒成为启动抗肿瘤免疫应答的一种有力诱导物［12-13］.其中一些细胞死亡方式具有免疫原性并释放出诸如钙网蛋白、ATP等危险相关分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMP）和肿瘤相关抗原（TAA）.研究［14］报道肿瘤细胞感染多种溶瘤病毒后均会发生ICD，而且应用溶瘤腺病毒联合替莫唑胺化疗药物治疗的患者同样有ICD发生，该病毒的治疗特性使其与其他免疫治疗方法可协同作用.但溶瘤病毒介导细胞死亡的机制和应用该特性增强免疫原性仍有待于进一步研究.慢性炎症反应也会促进肿瘤形成、抑制T细胞的抗肿瘤活性［15］.因此，抑制抗病毒免疫反应和促进抗肿瘤免疫应答处于一种复杂的平衡关系中，其共同决定溶瘤病毒治疗的最终疗效.例如，在一些小鼠肿瘤模型中，溶瘤病毒呈低量级的复制或不扩增，抗肿瘤效应则主要依赖于溶瘤病毒所引发的免疫反应［16］.

1.2 天然免疫反应尽管适应性免疫应答是溶瘤病毒发挥抗肿瘤效应的主要方式，但在病毒注入机体的最初阶段，宿主的固有免疫反应能够清除病毒、杀伤已感染病毒的细胞，使后续的由于病毒大量复制增殖、介导细胞毒性效应而引发的免疫反应无法发生.溶瘤病毒注射给药的部位也是宿主抗病毒反应的一个重要决定因素.例如经静脉、动脉内注射给药途径，溶瘤病毒会被体液防御系统中的循环补体、抗体快速识别、清除，并已被大量研究报道证实［17-19］.此外，肿瘤细胞内和微环境中的防御性抗病毒反应也会显著抑制病毒复制数量级［20-24］.天然免疫细胞会对注入的溶瘤病毒做出迅速反应，清除病毒和受病毒感染的肿瘤细胞［25-26］.利用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂、免疫调节药物、抗病毒反应抑制基因等均能够抑制天然免疫反应，从而增加溶瘤病毒的复制扩增和细胞毒性效应［27］.这种药物在溶瘤病毒进入机体的瞬间能够暂时性地干扰机体的抗病毒反应，确保溶瘤病毒大量复制增殖，发挥高效的溶瘤作用.当药物抵抗宿主天然免疫反应的效力减弱时，已有大量病毒和肿瘤相关抗原得到释放，可被机体抗病毒反应所识别，引发继发的长效性免疫效应启动肿瘤免疫.目前这种由溶瘤病毒引发的天然免疫调节的应用仍需大量实验证实.

1.3 肿瘤免疫逃逸的阻断肿瘤细胞自身进化出多种复杂的免疫逃逸机制.例如，肿瘤细胞和其肿瘤微环境表达具有免疫抑制功能的表面受体，能够失活效应性免疫细胞，并且分泌IL-10、TGFβ等细胞因子来募集免疫抑制细胞到达肿瘤部位［28-31］.溶瘤病毒则能够借助改变细胞因子环境和免疫细胞的种类等多种机制来逆转这种免疫抑制微环境［32］.这些改变促进了免疫介导的肿瘤细胞的识别和清除、引发肿瘤相关抗原的扩散［33-34］.肿瘤细胞的杀伤死亡导致新的肿瘤抗原的释放，而这些抗原原先由于呈递受阻而掩蔽于免疫系统中.

2 提高溶瘤病毒免疫疗效

利用基因工程改造将外源治疗性转基因插入溶瘤病毒基因组中，使其兼具治疗基因局部高表达和溶瘤活性的功能.基因表达于肿瘤部位可避免由全身用药所引起的免疫调节反应毒性.GM-CSF是目前临床上应用最多的细胞因子，已被整合入多种溶瘤病毒的基因组中，在临床前研究中显示了一定程度的治疗效力［33，35-36］.此外，其他细胞因子如白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-12（IL-12）、干扰素（IFN）、肿瘤坏死因子（TNF）、可溶性CD80、CCL3等也已被用于肿瘤病毒治疗研究中［37］.肿瘤微环境的细胞因子和趋化因子能够打破免疫细胞的抑制状态产生治疗性免疫反应.IL-12是一种有效的抗肿瘤细胞因子，具有抗血管生成活性.在具免疫功能的肿瘤干细胞模型中，HSV表达IL-12减少了新生血管的形成和肿瘤调节性T细胞（Treg），引发了T细胞介导的免疫反应［38］.表达CXCR4拮抗物的牛痘病毒（vaccinia virus，VV）减少了肿瘤脉管系统的数量以及骨髓来源上皮和髓样细胞的累积，诱导发生抗肿瘤体液免疫应答［39］.

多种免疫调节剂用于抵抗抗病毒反应和促进溶瘤病毒的扩增、传播.环磷酰胺能够通过抑制天然免疫细胞、抗体反应、减少Treg细胞和增强CTL的抗肿瘤活性来增加溶瘤病毒的复制和抑制肿瘤生长［26，40］.另外，溶瘤病毒治疗还可与化疗联合应用，能诱导ICD、增强肿瘤细胞抗原性或对免疫细胞的易感性、抑制具有负调控的Treg细胞和髓样来源的抑制细胞（MDSC）［41］.

3 临床治疗应用

许多溶瘤病毒免疫治疗已应用于临床试验中，但绝大部分仍处于Ⅰ、Ⅱ期临床试验阶段.目前有报道表达GM-CSF的HSV-1（T-Vec）已进行Ⅲ期临床试验，其适应症是黑素瘤［1］.受试者随机分组接受T-Vec或GM-CSF的瘤内注射治疗.初步报告显示，T-Vec治疗组的持久反应率达到16%，而GM-CSF治疗组的持久反应率仅为2%；在总反应率上，T-Vec治疗组为26%，也明显高于GM-CSF治疗组的6%.两组的中期分析同样显示T-Vec治疗组具有更好的总生存率.

表达GM-CSF的牛痘病毒（JX-594）在肝癌患者中已完成Ⅱ期临床试验［42］.低剂量和高剂量的JX-594均采用血管内给药途径注入肝肿瘤中，发现病毒注射部位和远端肿瘤部位在这两种病毒剂量下均呈现出相同的反应率和肝病控制程度，表明其抗肿瘤效应归功于免疫反应.研究发现JX-594抗肿瘤免疫反应发生于JX-594病毒复制和GM-CSF表达之后.

溶瘤呼肠孤病毒也完成了Ⅱ期临床试验，用于转移性黑素瘤患者的治疗，给药方式是静脉注射［43］.尽管在21例患者中均未见客观性治疗反应，但在具有评估价值的13例患者的活检组织中，发现2例患者的免疫组化结果显示病毒在肿瘤中进行了有效的大量复制，并且这些患者体内的中和抗体滴度也明显升高.研究人员推测，该治疗无效的原因可能与抗病毒的中和抗体滴度迅速增高有关.

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R730.5

A

2095-6894（2017）01-20-04

2016-12-09；接受日期：2016-12-23

国家自然科学基金资助项目（81572983，81272419）

涂艳阳.副主任医师，副教授.Tel:029-84777469 E-mail: tufmmu＠188.com

张永生.教授，主任医师，院长.Tel:029-84777001 E-mail: zhangys_td＠163.com