甜叶菊体外培养获得甜菊糖的研究与应用进展

曹雪花，董花，刘娜（.甘肃省武威市凉州区农业技术推广中心，武威733000；.凉州区农产品质量安全监督管理站，甘肃武威733000；3.黑龙江大学农作物研究院/中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨50080）

甜叶菊体外培养获得甜菊糖的研究与应用进展

曹雪花1，董花2，刘娜3*
（1.甘肃省武威市凉州区农业技术推广中心，武威733000；2.凉州区农产品质量安全监督管理站，甘肃武威733000；3.黑龙江大学农作物研究院/中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150080）

综述了世界上甜叶菊使用体外繁殖技术，培养基添加物质对甜叶菊诱导、生芽、生根及甜菊糖生产的影响，育种方法对甜菊糖生产的改良等。

甜叶菊；体外培养；培养基；甜菊糖；甜菊糖苷；莱鲍迪苷

甜叶菊无毒、无致癌、无突变[1]。甜叶菊所含的甜菊糖（steviol glycosides，SGs）作为一种天然的、无热量、安全的、稳定的、甜度高的甜味剂在广泛应用，甜菊糖的成分和含量与健康无病相匹配，甜叶菊及其提取物具有较低的血糖指数，因此不影响血糖，其中有些化合物还具有治疗功效，具有降血压特性，还具有抗菌和利尿等作用特性[2-3]。植物细胞和组织培养用于植物育种，可对植物的生长发育和代谢调查研究，可使植物在自然条件下无法实现的微繁殖或体细胞胚胎发生大量的营养繁殖/或再生。体外培养也能获得杂交植株，即使杂交育种无法授粉的植物，也可获得体细胞杂种。花药和小孢子培养可获得单倍体和双单倍体，即生物是完全纯合的。在诱导植物细胞突变和遗传转化的过程中，体外技术的应用最终获得无病毒植株[4-5]。甜叶菊育种中使用体外繁殖技术是其繁殖的重要途径，是产业化大规模生产最快和最有效的方法。由于甜叶菊种子发芽率非常低，因此实际应用该方法更有意义[6]。有性繁殖导致产生不同基因型和表型性状，难以获得甜菊糖等化学成分含量同质的群体。在传统的营养繁殖/繁殖方法中寻找解决方法需要大量的努力，遗传材料的可用率是有限的。生物技术方法在实际中得到很好的应用，并在不断改进中[7-8]。

1 培养基质对培养过程的影响

1.1 生长调节剂的作用

植物生长发育调节剂是调节植物体内生化过程的一类化合物，它们负责植物适当的生长和细胞分裂以及对环境条件变化的反应，如胁迫反应。植物的反应取决于这些化合物的浓度，甚至少量的剂量即可观察到。体外培养应用生长调节剂可诱导不定芽、愈伤组织和生根等，选择其适当的浓度对植物材料的质量和数量是至关重要的。许多文献报道了优化生长调节剂浓度对甜叶菊微繁殖的研究。MS培养基中添加2.0mg/L BA诱导最多的芽数是43.9芽/外植体，但这些芽很薄，含有许多侧生芽，炼苗期间存活率很低[7]。不同浓度的BA、IAA、IBA+MS培养基对不定芽再生最有效的组合是：BA 2.0mg/L+IAA 1.0mg/L，结果顶芽、不定芽和叶为外植体的增殖率分别为11%、10%和8%[5]。添加IBA的培养基再生效率低，稀释双倍却对生根很好，生根率可达100%。该成分的培养基组合对芽的伸长也有积极作用。其它的组合，BA、NAA、KIN与生长素被证明是低效的。Bondarev等[9]观察到0.1 mg/L BA对外植体可产生1.5以上的芽，但对生根有抑制（与标准培养基比较）；另一方面，GA3促进了芽和根的伸长[10]。Jain等人[11]观察到BA 0.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L对芽诱导最佳；使用BA 0.8mg/L和KIN 0.4mg/L的组合芽增殖达到最好的结果。在这些研究中初始外植体为叶和不定芽[13]。另一项研究，芽再生最优组合为：MS+KIN 0.3mg/L，生根最优组合为：MS+IBA 2.0mg/L[12]。MS分别添加BA、KIN和IAA或组合，最好的结果是：MS+BA 1.0 mg/L+IAA 0.5mg/L，与早期报道一致。繁殖率最高的外植体也是顶芽。然而，N6（Nitsch）培养基+IAA 1.0 mg/L对生根是最有效的[13]。Yadav等人[17]使用其他细胞激素组合包括BA与KIN或NAA用于不定芽的诱导。最好的结果：MS+BA 0.5 mg/L+KIN 0.5 mg/L；在MS+ GA3 0.5mg/L培养基，获得最高的茎伸长和叶片数量最高；用IBA 2.0mg/L，生根最高（87.8%）也最快，同时测试了NAA和IAA效果。反之，在没有任何调节剂的MS培养基没有根生长[14]。Thiyagarajan等[3]在MS培养基上添加不同浓度的BA和KIN，获得了不定芽和茎节外植体；另一种情况，添加不同浓度的IAA、IBA和NAA，在BA 1.0mg/L培养基上增殖率最高，每外植体达到15.69个芽，发生率为94.5%。实验旨在大规模生产节点外植体和不定芽，然后转移到MS+BA 1.0mg/L培养基。经过3个增殖周期，每个外植体获得了123个芽，后来被转移到1/2MS添加不同浓度的NAA、IAA、IBA和生长素培养基中，结果培养是成功的。最高的生根培养基是：1/2MS+NAA 0.4mg/L[3]。矮壮素（CCC）与IBA组合，获得甜叶菊最佳的体外培养，研究表明，在添加CCC和IBA的培养基比单用CCC或IBA培养基发育和性状更好。培养基中添加CCC 3.0mg/L+IBA 3.0 mg/L对增加芽数、生存率、生物量和叶绿素及改善甜菊糖含量被证明是最有效的[15]。总之，文献资料表明，外源植物生长调节剂用于芽诱导，通常为：MS+BA 1.0mg/L+细胞激素1.0mg/L或BA1.0mg/L+IAA 1.0mg/L。外植体繁殖率最高的是顶芽。生根及其伸长生长最有效的是，在MS培养基中或MS培养基双倍稀释浓度添加2.0mg/L IBA或NAA 0.4mg/L。

1.2 矿物成分的影响

矿质营养是植物离体培养的基本元素，在基质中其浓度和比例对植株的生长速度和质量起着基本作用，因此在选择培养基的成分时这两个参数必须指定[4]。Ibrahim等研究了不同浓度的MS培养基及其主要成分对甜叶菊体外发育的影响。最好的结果是用MS培养基并改良：NH4NO31237.5mg/L+KNO3950mg/L+MgSO4185mg/L+CaCl2.2H2O 440 mg/L+KH2PO485mg/L+丰富的微量元素+蔗糖30 g/L+甘氨酸2.0mg/L+吡哆醇0.5mg/L+烟酸0.5mg/L+硫胺素0.1mg/L，也以琼脂1.5mg/L做凝固[16]。在MS培养基上加倍浓度的矿物盐对植株生长有良好作用，但导致甜菊糖水平的下降[9]。微量元素的组成和浓度对芽的诱导和叶绿素含量的影响研究表明，该项目使用不同浓度的基质钴、铁、锰、铜和钾碘化物与标准的MS培养基中所获得的结果比较，对于芽诱导的积极影响的方案是：MnSO460.4mg/L+CoCl20.26mg/L+KI 1.7mg/L；而增殖培养基为：CoCl20.26 mg/L+CuSO41.6mg/L+MnSO475.5mg/L+ZnSO414.4mg/L+H3BO324.7mg/L；生物量和叶绿素含量增长的培养基：Fe2(SO4)380mg/L+CoCl20.4mg/L+KI 1.7mg/L[4，11]。其他文献资料表明，铜0.03mg/L对芽的诱导和增殖及对叶绿素含量和生物量有积极影响[11]。

1.3 碳源效应

糖类提供了培养基的碳源和能量，加速培养的生长发育，使其可独立光合作用。其过程受体外气体交换条件的抑制。因此，CO2对光合作用是有用的。此外，并非所有体外生长的细胞都必须具有光合能力和碳水化合物的存在。另一方面，糖的存在可以促进培养基上微生物的生长。在生物反应器中，对糖的种类和浓度对甜叶菊芽和甜菊糖含量的影响进行了研究，与蔗糖相比，在含有果糖或葡萄糖的培养基对根系统的发育更有利，但叶质量和甜菊糖含量下降了。为改善组织中甜菊糖含量，测试了不同浓度碳源（1%～5%），而最佳的蔗糖浓度为3%，高浓度促进了根系统发育和生物质的积累[9]。

1.4 甜叶菊体外愈伤组织培养及悬浮培养的影响

体外培养愈伤组织，由于其全能性导致组织分化，用于间接器官发生或形成体细胞胚。愈伤组织培养一般用于获得植物代谢产物。据有关甜叶菊的文献，对愈伤组织诱导最有效的培养基为：MS+2,4-D 0.1mg/L[15]或BA 2.0～3.0mg/L+NAA 2.0mg/L[17]。愈伤组织诱导芽的发育为：MS培养基添加BA和2,4-D[12]。在未添加外源生长调节剂的培养基未观察到愈伤组织发育，说明培养过程是复杂的，需要添加生长调节物质[17]。经体细胞胚胎发生的植物再生，胚性愈伤组织从叶片和小花外植体而形成[18]。甜叶菊悬浮培养的最佳生长是：2,4-D 0.06mg/L+BA 0.6mg/L+抗坏血酸0.01mg/L，该组合的生长速率是2.61/d[17]。甜叶菊悬浮培养的最优改良的矿物盐浓度的标准MS培养基：NH4NO32.0mg/L+KNO35.7mg/L+MgSO40.5mg/L+KH2PO410.2mg/L。另有研究：提高盐的浓度对甜叶菊也有较好的效果[19]。

1.5 瓶内到瓶外炼苗的影响

将体外不育植株转到众多具胁迫诱导因素外部环境的炼苗。植株必须建立一个功能根系、高效蒸腾机制、保护层，开始光合作用。甜叶菊炼苗的基质为混合砂土、蛭石、蚯蚓粪、或椰壳纤维泥炭。比较分析表明，使用砂、土壤和蚯蚓粪以1∶1∶1混合，植株存活率为82%，只用椰壳纤维泥炭的生存率为70%[13，17，20]。

2 几种因素对甜叶菊体外培养甜菊糖生产的影响

甜叶菊中甜菊糖最常见的甜菊甜味物质是甜菊糖苷（stevioside，STV）、莱鲍迪苷A（Reb A）和莱鲍迪苷C（Reb C）。在传统方式种植的甜叶菊，每种化合物的含量占叶干质量的1%或更高。STV、Reb A和Reb C含量分别达到3.3mg/g、1.9mg/g和0.7mg/g干物质[10]。其余的甜菊糖含量很低。不同的研究者体外组织培养植株的甜菊糖含量差异很大。Swanson[21]没有在愈伤组织或芽检测到甜菊糖的存在，认为，只有充分发育的植株可以生产这些化合物。其他作者证明培养的芽有能力合成这些化合物[10，15]。一些作者在愈伤组织和悬浮培养没有检测到甜菊糖[10]，在愈伤组织培养，即使是在水平高出一倍的甜菊叶都没有[4]。2001年的文献表明，体外生长的甜菊叶和茎的甜菊糖含量比传统方式分别低5和3倍[10]。愈伤组织培养几乎不含有任何苷类；Taware等[12]的结果相反，在愈伤组织中STV含量较高。

悬浮培养的甜菊糖的含量变化为15μg/g～3803μg/g，表现为与细胞繁殖周期相关的有特色的动态，其含量在对数增长阶段或在其结束时值最大，然后降到平稳[10，17]。这表明在悬浮培养的生长、细胞分裂与STV的合成呈正相关关系。培养基成分及矿物盐的含量，糖、生长调节剂的种类和浓度，都可能对获得的材料的STV含量水平产生影响[18]。在愈伤组织，在添加7.5mM脯氨酸和5%PEG时，SGs含量分别从0.27%（对照）增加到1.09%和1.83%。在悬浮培养下，相同的脯氨酸和PEG浓度使SGs含量在第10天分别从1.36%（对照）增加到5.03%和6.38%[22]。0.5 g/L ALG和2.0 g/L酵母提取物处理的体外苗STV产量分别从1.56mg/g干重增加到14.69和14.54mg/g。仅在0.5 g/L海藻酸（ALG）处理观察到Reb A为0.55mg/g干重，田间生长的植物的STV含量为15.06mg/g干重[23]。再生植株和种子幼苗转移到大田16周，其植株叶SGs含量（叶干重比）之间没有差异，Reb A含量为4.7%～5.0%（w/w），而STV含量为6.4%～6.9%（w/w）[24]。外源生长调节剂几乎总是使甜菊糖水平下降[9]。这也部分解释了不同培养基类型甜菊糖的不同浓度变化。然而，没有发现在体内外植体类型和糖苷含量间这样的相关性[10]。细胞分化似乎对糖苷产生影响。据Bondarev等人，在形成愈伤组织的这些化合物的含量高4～5倍，而在形成芽的情况下甚至比悬浮培养高37倍[10]。在甜菊糖的合成过程也存在细胞解体的作用[17]。

甜菊糖的化学结构对于其生产是很重要的，因为决定其味觉特性。在甜菊糖的差异，特别是由于很多配基转移酶的存在，会发生残留糖被糖苷配基取代现象[25]。糖苷类的多样性体现在他们的特性，尤其是在感知的味觉和在水中的溶解度。总之，当羟基或糖基团在C-19位时即能感知到甜味，这些位置取代基团的差异决定化合物的性质[26]。例如，Reb A与STV比在味觉上感觉更好，STV具有特定的回味，有些人觉得不愉快或苦味，而且没有Reb A那么甜[4]。据观察，STV和Reb A的等同物分别是杜尔可苷A（Dul A）和Reb C，是葡糖基团被鼠李糖取代的结果。到目前为止，基于苷配基（不同于分离自Stevia paniculata,Stevia ovata及Rubus suavissimus的甜菊醇）的糖苷类的研究表明，甜菊醇产生最甜的糖苷类，甜菊糖的味道依赖于其结构[26]。因此，已经尝试修改它们的化学结构以期改进味道。由于其天然来源（和食品应用），酶修饰法是首选的化学方法。生物转化作用是酶催化的化学化合物的转化过程。可控的生物转化已对经济价值化合物进行修饰和生产。生物转化反应功能之一是化合物的糖基团的修饰、连接、基团的拆分和转糖基。一般来说，生物催化是一个有用的工具，例如特定的异构体的合成、选择性合成、低毒性或低活性化合物的合成。这通常是并不需要特殊的反应条件和不产生危险废物的化学合成，对人类和环境更友好。CGTase与淀粉反应形成环糊精，也催化反式α-1,4反式葡糖基化，在可溶性淀粉存在下STV在CGTase作用下分解为糖苷。性味改良了更多的葡糖基化化合物，虽然C-19位影响糖基化衍生物的口味。后来被用于其他反应中，使用更特异的酶，以便获得最需要的化学化合物[26]。支链淀粉酶似乎比CGTase更高效，所需产品具有较高的特异性[27]。在糊精葡聚糖酶（DDase）也被用于STV的苦-甜化合物的改良[28]。一个有趣的例子：经Actinomycete培养STV也可以形成C13-O-β-6(2)-β-glucosylsophorosyl-C19-O-β-glucopyranosyl steviol。

3 通过育种改进甜菊糖的生产

传统选育方法和分子工具结合选择最期望的特性，即通过多倍体化或在基因组更彻底的调停和生产转基因品种，与特定特性结合进行选择性标记测定。所有这些方法都有助于生物体的发展和完善遗传和商业需要，了解给定的特征及其遗传本质是进一步修改生物体性状的有力工具。代谢途径分析、测定酶参与途径、调控的方法和基因的负责过程提供了重要的信息，均可帮助开发所需的性状[29]。

甜叶菊最典型的特点是其生物合成甜菊糖的能力，因此该物种的繁育研究针对这些化合物含量与成分的改进。由于STV的特殊味道使我们注意到降低其在总甜菊糖含量的份额，而增加Reb A和Reb C却没有苦味。在叶中甜菊糖含量最高，因此其他改良性状是叶产量和叶茎质量比。研究表明甜叶菊经济上重要的繁殖性状具有较高的种群内的变异和高遗传力特性，这些性状包括叶产量（h2=62.1）、叶茎比（h2=78.8）和甜菊糖含量（h2=76.6）。因遗传力高容易进行选择修改[30]。此外，STV和Reb A含量呈负相关，而Reb A与Reb C含量呈正相关。Reb A是否存在由一个单一的主基因控制，而它的量是由较高的位点数目调节。Reb A和Reb C比率由单一加性基因决定，这些性状的基因进行共分离。同一个酶负责两种化合物的合成[4，31]。甜叶菊这些特点使其成为育种潜力高、易于改良的植物，能获得更高效的品种。

在甜叶菊，如果植株经常自花授粉，在特定的性状常表现出很高的差异性，那么选择是获得改良品种的有效方法。甜叶菊经过30多年的选育，叶中甜菊糖的含量已从2%～10%提高到20%（干物质）[29]。迄今为止基于表型性状已经做了选择，更取决于选育条件和植物的年龄。据估计，在幼苗的情况下，只有20%～30%的变异是基因决定的。因此，应对成熟植株进行选择，但又延长了所需的时间。此外，用HPLC测定叶糖苷含量是昂贵和费时的[32]。生物技术工具为所需的甜叶菊性状改善提供了机会。在花药培养体外组织培养用于大规模繁殖和/或获得完全单倍体基因型。分子遗传标记鉴定针对影响甜菊糖的生物合成的基因型的基因定位。更深入理解甜菊糖的生化合成途径、调节基因如何表达也很重要。诱导突变可能成功地被用于改善种群内变异性低的性状。到目前为止，很少有甜菊糖产量高的甜叶菊品种获取专利。选育的栽培种具有特定用途或观赏性状、稳定性和均匀性，通过选择、杂交育种、多倍体化或突变等方法而获得。品种最常见的是无性系，为保持其性状需要限制其生殖繁殖，代替以利用营养繁殖。

在性状高变异的异花受粉物种（如甜叶菊）中，用特殊技术改良数量性状进行循环选择。重组选择与普通群体及进一步重组杂交选育相比性状表现较好。在亚群决定所需性状的等位基因发生率比初始种群高。如此循环重复，直到达到显著效果。改良糖苷含量的甜叶菊育种品系RSIT 94-1306和RSIT 751是控制杂交育种和选择方法获得的[30]。在1998年，由于其Reb C与STV比率的独特性，育成了RSIT 95-166-13品系[33]。这3个品系都是营养体无性繁殖选育的。发展综合和复杂的品种是特别重要的，生产这样的植物如，AC Black Bird和PTA－444，即改变糖苷含量[34-35]。一些品种，尽管糖苷生产非常高，因自交不育只能进行营养体无性繁殖。然而，PTA－444可由种子繁殖。使用营养体育种提高了植物生产的成本，并限制其商业用途，但它们仍然可用于杂交种生产[20，34]。

植物杂交种是由不同的种、属杂交育种而成的。有意的、可控的杂交生产允许引入新的基因进入基因库，有助于丰富遗传多样性。这对作物同质群体是有益的，它可以提高杂种优势，也可能是育种者利用抗病或活力等优良性状创造新品种的方法。在2006年，Wang获得选育甜菊杂交植物的专利方法[36]。在2001年，Sun用生产营养体杂交的技术获得种子的方法[32]。一种营养杂交体形成是将植物的一部分嫁接到另一株植物上的结果。诱发突变是一种工具，与传统的育种方法比，加速了植物所需性状的培育。使用物理和化学的诱变剂，在一个群体更快地获得遗传多样性。该方法的应用，给定的性状在群体中显示非常低的变异。直到现在，这个方法还没有用于甜叶菊，因为其他方法是易于使用的和高效的。

多倍化成功地用于提高农作物产量。多倍体植株往往具有环境条件的适应性强和较大的器官与细胞。不同染色体数目的杂交育种而产生的植物通常是完全或部分不育的。通过秋水仙素溶液处理甜叶菊种子或经四倍体作母本与二倍体作父本杂交育种而获得三倍体。三倍体植株叶大、Reb A含量较高[37]，四倍体的叶片较大、较厚，可能使生物产量增加。所有的多倍体都有非功能性花粉[38]。花药培养，即从未成熟的花药在体外培养形成，用于获得单倍体植株。它们可获得的双单倍体植株是完全纯合的。纯合群体的性状可用于杂交。以花药培养成功地再生甜叶菊植株[4]。在利用分子标记与特定性状连锁的标记识别创造新的可能性和植物育种途径。在植物发育中借助可检测的分子标记，使所需的性状发现更早。这可无需生产成熟的植株，并大大缩短评估性状所需的时间。而且，能够在较小的种群中执行选择过程。在1999年，用RAPD创建了甜叶菊的遗传图技术[32]。遗传图谱构建甜菊选育中（基于遗传标记）使用分子选择技术，并将为甜叶菊基因组组织和代谢研究奠定基础。下一步的研究应包括与重要经济性状相关的特异标记，并对其进行整形，使其易于在植物材料中应用。尽管上述甜叶菊的研究相当有限，将来的工作，开发新品种和调整育种技术将通过提高产质量增强其在食品工业和保健上的应用价值与潜力。

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Advances in Research and Application of Stevia in vitro Culture to Im prove Steviol G lycoside Content

CAO Xue-hua1,DONG Hua2,LIU Na3*
(1.Agricultural Technology Service Center of Liangzhou District,Wuwei733000,Gansu;2.Agricultural ProductQuality Safety Supervision and Management Station of Liangzhou District,Wuwei733000,Gansu;3.Crop Academy of Heilongjiang University/ Sugar Beet Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080,Heilongjiang)

The use of in vitro propagation techniques of Stevia in the world was introduced,and the effects of culturemedium on the induction,germination,rooting and steviol glycoside,and effects of breeding approach on production of steviol glycosideswere summarized.

Stevia;in vitro culture;medium;steviol glycosides;stevioside;rebaudioside A

S566.9

B

1007－2624（2017）04－0048－05

10.13570/j.cnki.scc.2017.04.017

2012-02-27

曹雪花（1974-），女，甘肃武威人，农艺师，主要从事作物病虫害测报与防治工作。

刘娜（1974-），女，黑龙江通河人，助理研究员，主要从事甜菜生理学和栽培学研究。E-mail：ln5-8@163.com