神经干细胞治疗新生儿胆红素脑病的进展

李 玲，李贵南

神经干细胞治疗新生儿胆红素脑病的进展

李 玲，李贵南

新生儿胆红素脑病是导致新生儿脑损伤的常见病因之一，是由于间接胆红素的神经毒性导致基底节、脑干核团及其他神经组织受损，从而表现出不同的神经功能障碍。目前，对胆红素脑病导致的后遗症患儿尚无切实有效的治疗方法。神经干细胞研究的迅猛发展，为治疗胆红素脑病所致的脑损伤带来了新的希望。作者对神经干细胞移植在新生儿胆红素脑病的应用前景作一综述，以期寻求到新的治疗胆红素脑病的有效方法。

神经干细胞；胆红素脑病；治疗；新生儿

干细胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的原始细胞，在一定条件下能分化成多种细胞。干细胞治疗的研究已历经半个多世纪的迅猛发展，且在各学科领域取得了显著的成果，如血液系统疾病、肿瘤、心血管疾病、组织再生等。近年来，神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的发现，使研究者们看到了NSCs移植的治疗前景，并成为大家关注的热点。

新生儿胆红素脑病(neonatal bilirubin encephalopathy，NBE)是由于间接胆红素的神经毒性导致基底节、脑干核团及其他神经组织受损，从而表现出不同的神经功能障碍。其大脑损伤的部位主要是在苍白球、基底核、海马H2～H3区、下丘脑、听神经核、小脑齿状核、黑质、脑白质等，最易受损的是苍白球区。胆红素的神经毒性主要是损伤神经元和星形胶质细胞。重度胆红素脑病患儿可遗留听觉障碍、眼球运动障碍、手足徐动症、智力低下、脑性瘫痪、癫痫以及牙釉质发育不全等后遗症。

1 NSCs概况

一直以来，人们认为成年哺乳动物的神经细胞没有更新能力，一旦受损不能再生，且脑组织中不存在NSCs。然而，NSCs不仅存在于哺乳动物的胚胎时期，同时也存在于成年动物的脑组织内。现阶段，人们在胚胎、哺乳动物和人的脑室管膜下区、海马齿状回颗粒下层、纹状体、小脑皮质等处已分离培养出NSCs。

NSCs是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞，可分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。而且，NSCs不表达成熟的抗原，免疫原性低，可长期存活于宿主体内。这些生物学特性赋予其广泛的临床应用价值。

2 NSCs治疗的主要机制

2.1 内源性NSCs的主要作用机制 在正常情况下NSCs处于静止状态，但在神经系统受损、脑血管疾病、神经系统退行性病变等因素的刺激后，便被激活、不断增殖；在趋化因子的作用下NSCs迁移至损伤部位，分化为相应的神经细胞，填补和部分修复受损的脑组织。此外，NSCs分泌的多种神经营养因子，可促进受损神经细胞的修复，最终帮助实现组织结构和功能的修复[1-2]。但是内源性NSCs修复作用是有限的，大多数情况下不足以替代损伤的神经组织和细胞，不能有效地自我修复。

2.2 外源性NSCs的主要作用机制 修复受损神经脑损伤后移植的NSCs可通过自身在体内的迁移、分化、增殖，产生特定的神经细胞，达到神经修复的作用。Shevde[3]研究证实NSCs具有趋化性，并能向神经损伤部位定向迁移，从而促进受损神经的修复。Mothe等[4]在脊髓损伤模型大鼠的脊髓损伤处移植入神经干/前体细胞后，发现神经干/前体细胞分化可成为胶质细胞及神经细胞。

2.2.1 保护内源性NSCs NSCs移植后能保护成熟的内源性NSCs[5]，并可诱导内源性NSCs向特定的神经细胞分化、增殖[6]。Shetty[7]研究发现，移植的NSCs在宿主体内形成一个生物通路，该通路富含基质金属蛋白酶，将室管膜下区的内源性NSCs摆渡到受损伤的脑组织区域以完成神经修复。

2.2.2 重塑突触联系 外源性NSCs可整合到宿主的神经网络中，参与神经损伤修复，建立新的神经环路，促进神经功能重建[8]。Davis等[9]发现将脐带血转化而来的少突胶质干细胞移植脑内，有望使髓鞘修复而治疗脱髓鞘疾病(如多发性硬化等)。

2.2.3 分泌神经营养因子 移植的外源性NSCs可分泌多种神经营养因子，主要有神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子、神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)等。外源性NSCs的存活及分化与神经营养因子密切相关。而且，通过自身分泌多种神经营养因子、抗炎物质、抗氧化应激分子等，启动内源性修复机制，促进受损区结构和功能的恢复[1]。移植的NSCs分泌NGF可调节免疫[10]，抑制细胞凋亡。Lee等[11]发现，外源性骨髓间充质干细胞可通过自身分泌的神经营养因子促进轴突修复。另外，研究发现NGF可能通过上调B细胞淋巴瘤白血病-2基因表达和下调Bax基因表达，抑制神经细胞凋亡，从而发挥脑保护作用[12]。

2.3 基因修饰的NSCs NSCs通过基因修饰，表达的相关产物，可促进其存活及分化；而且通过炎症反应和基因修饰NSCs可使趋化因子或生长因子过度表达，从而提高其迁移能力[13]。NSCs整合了NGF基因后，能表达外源性NGF，促进NSCs的存活与分化[14]。已有研究证实，GDNF基因可以促进NSCs向神经元以及多巴胺能神经元分化[15]。段奎甲等[16]研究发现，孕14～15 d胎鼠中脑源性的NSCs经GDNF基因修饰后，移植于帕金森病大鼠模型的纹状体区，可显著改善大鼠的运动障碍，但其分子机制有待进一步研究。另外，闫宇辉等[17]研究发现，转染了NT-3基因的NSCs可高表达NT-3，并促进NSCs分化为更多的胆碱能神经元，其机制可能与抑制Notch信号通路有关。上述研究均表明经基因修饰的NSCs可以更有利于神经修复的实现。

3 NBE及其发病机制

胆红素脑病的发生是多种因素共同作用的结果，其包括高胆红素血症的严重程度和持续时间、胆红素与白蛋白的结合能力、血脑屏障的通透性以及受累中枢神经系统结构的成熟程度等。间接胆红素的神经细胞毒性作用是胆红素脑病发生的关键，主要的发病机制有3个方面。

3.1 胆红素与细胞坏死、凋亡 胆红素的神经毒性作用表现为神经元和神经胶质细胞的坏死和凋亡，而且神经元和小胶质细胞(与星形胶质细胞相比)更易受累。线粒体是真核细胞的能量供应厂，而胆红素的毒性作用最先作用于细胞的线粒体，影响神经细胞的能量代谢。已有研究证实，胆红素主要是通过解离线粒体氧化磷酸化而发挥毒性作用，Rodrigues等[18]发现，胆红素可改变线粒体膜的通透性，释放细胞色素C，并作用于半胱氨酸水解酶、蛋白激酶C，进而导致神经细胞凋亡。Hanko等[19]表明高浓度游离胆红素可导致细胞膜的完整性缺失，且低浓度游离胆红素也可导致迟发性细胞凋亡。

3.2 胆红素与谷氨酸盐胆红素促进神经细胞凋亡

胆红素与谷氨酸盐胆红素可阻碍星形胶质细胞对谷氨酸盐的摄取，导致细胞外谷氨酸盐的蓄积，使兴奋性氨基酸增加，再通过兴奋N-甲基-D-天门冬氨酸盐受体致神经细胞Na＋、Ca2＋超载，从而促进神经细胞凋亡[20]。已有研究表明，Ca2＋超载与细胞的凋亡密切相关，其可干扰和损伤DNA，促使DNA断裂、降解和细胞凋亡[21]。

3.3 胆红素与炎症介质 研究发现，游离胆红素可促使星形胶质细胞发生免疫应答反应，释放肿瘤坏死因子-α、白介素-1β、白介素-6等炎症因子，促进谷氨酸盐的聚集[22]。Zou和Crews[23]发现肿瘤坏死因子-α、白介素-1β能降低星形胶质细胞谷氨酸盐转运蛋白的活性，从而增加谷氨酸盐的神经毒性。由此可见，胆红素的神经毒性作用也与炎症因子的释放相关联。

4 NSCs治疗NBE的可能性

4.1 新生儿神经系统的发育潜能大 在经历胎儿期(孕40周)后，新生儿大脑的神经细胞数目已接近成人水平，神经元之间的突触联系及主要的神经传导通路已形成。但新生儿的脑发育潜能很大，神经元的增殖可延续至出生后1年左右，且髓鞘的形成从胎龄4个月开始可延续至成年。随着日龄的增加，脑的重量将不断增加，神经细胞胞体逐渐增大，突触的不断增多和延长，神经纤维的髓鞘化不断进行，神经突触联系不断精确，最终形成一个复杂的神经网络。正由于新生儿脑发育尚未完善，对于遗留有重度脑损伤的患儿尚有希望通过新的治疗方法，促进神经损伤的修复，改善预后。

4.2 NSCs治疗NBE的可能机制

4.2.1 修复受损神经细胞，促进神经再生及髓鞘化形成 NBE是由于胆红素的神经毒性导致神经元和神经胶质细胞坏死和凋亡，移植的NSCs经迁移、分化、增殖，替代坏死和凋亡的神经细胞。同时，外源性NSCs可促使内源性NSCs发挥修复作用，并建立新的突触联系，促进髓鞘化形成。

4.2.2 神经营养因子的作用 移植的NSCs除通过增殖对受损组织起替代作用外，还可以通过分泌一些细胞因子影响宿主微环境而发挥积极的作用，而且神经生长/营养因子可促进NSCs的增殖、分化和神经损伤的修复。研究表明，NSCs移植可以增加内源性髓鞘再生和减少星形胶质细胞增生，这可能与分泌的生长因子相关[24]。这些细胞因子或许可以挽救濒临坏死和凋亡的神经细胞，促进其功能修复。

4.3 NSCs在胆红素脑损伤的基础研究 NSCs的研究是近年细胞替代治疗、组织再生医学、药物筛选等领域研究的热点，在脑损伤的应用价值也逐步体现。Amini等[25]研究了在核黄疸的动物模型予以人脂肪干细胞治疗的效果，发现脂肪干细胞治疗组失去活动能力、行动缓慢和滑倒的现象明显减少，且与对照组相比基底神经节和小脑的细胞凋亡都显著减少，在出生后2个月听性脑干反应的严重程度也明显减轻，移植治疗大幅减轻了大鼠的行走障碍、细胞凋亡和听觉功能障碍。这表明，人脂肪干细胞治疗应用于围产期脑损伤可减少潜在的感觉运动障碍的发生。杜宜洋[26]建立的新生大鼠高胆红素血症模型发现，造模后脑组织出现不同程度的水肿、萎缩及液化坏死，在予以NGF干预后脑组织的病变减轻，这从病理学的角度验证了高胆红素血症所致的神经损伤可通过NGF治疗而减轻；其可能的机制是通过下调Fas/Fas配体的表达从而减轻脑组织损伤过程，且在接受干预48～72 h时效果最明显。

4.4 NSCs在新生儿及儿童脑损伤的临床应用 随着基础研究的不断深入，NSCs移植治疗神经系统疾病的临床应用也逐见疗效。栾佐等[27]于2005年首次对一重度新生儿缺氧缺血性脑病患儿进行人NSCs移植，术后近期临床疗效显著，患儿运动功能明显改善，但远期疗效有待进一步随访观察。2012年在《中华医学会第十七次全国儿科学术大会》会议上相关报道阐明了移植人神经前体细胞在治疗新生儿继发性脑损伤的有关进展及疗效，其中包括新生儿重度缺氧缺血性脑病、一氧化碳中毒、低血糖重度脑损伤[28]。另外，有研究总结出人神经前体细胞移植在重度脑性瘫痪(cere-bralpalsy，CP)的治疗中不失为一种安全有效的新手段[29]。周菊花等[30]对近年来NSCs移植对CP患儿的治疗研究进展进行了阐述，并认为这为CP患儿带来了新的希望。另外，王风和栾佐[31]的临床研究结果显示，人间充质干细胞活性因子鞘内注射治疗新生儿中-重度缺氧缺血性脑病，短期疗效显著，远期预后有待更多病例观察分析。李迎[32]临床研究发现，脐血干细胞移植与神经生长因子联合治疗CP疗效显著，安全性高。由此可见，NSCs治疗在新生儿脑损伤的应用前景可观，并有望成为NBE新的治疗方案。

胆红素脑病是新生儿常见的获得性脑损伤，大多数后遗症患儿的听力、运动及智力发育均受到严重的影响。鉴于目前NSCs在脑损伤及其他神经系统疾病的研究结果表明，NSCs不仅通过再生起到替代受损组织的作用，还通过多种其他方式共同作用改善疗效，包括免疫调节和营养支持机制。现阶段，NSCs移植和神经营养/生长因子，无论是在动物实验或是临床试验中的研究在不断深入，其应用价值让医学研究者们看到的前所未有的曙光。因此，早期发现和诊断胆红素脑病，并在脑损伤早期进行NSCs移植或神经营养/生长因子治疗，可能成为治疗胆红素脑病的新方法。

[1]Lee HJ，Kim KS，Park IH，et al.Human neural stem cells over-expressing VEGF provide neuroprotection，angiogenesis and functional recovery in mouse stroke model[J].PLoS One，2007，2(2):e156.

[2]Butti E，Cusimano M，Bacigaluppi M，et al.Neurogenic and non-neurogenic functions of endogenous neural stem cells [J].Front Neurosci，2014，8:92.

[3]Shevde N.Stem cells:flexible friends[J].Nature，2012，483(7387):S22-S26.

[4]Mothe AJ，Zahir T，Santaguida C，et al.Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation[J].PLoS One，2011，6(11):e27079.

[5]Cova L，Armentero MT，Zennaro E，et al.Multiple neurogenic and neurorescue effects of human mesenchymal stem cell after transplantation in an experimental model of Parkinson’s disease[J].Brain Res，2010，1311:12-27.

[6]Lee JS，Hong JM，Moon GJ，et al.A long-term follow-up study of intravenous autologous mesenchymal stem cell transplantation in patients with ischemic stroke[J].Stem Cells，2010，28(6):1099-1106.

[7]Shetty AK.Hippocampal injury-induced cognitive and mood dysfunction，altered neurogenesis，and epilepsy:can early neural stem cell grafting intervention provide protection? [J].Epilepsy Behav，2014，38:117-124.

[8]Rosenblum S，Wang N，Smith TN，et al.Timing of intra-arterial neural stem cell transplantation after hypoxia-ischemia influences cell engraftment，survival，and differentiation[J].Stroke，2012，43(6):1624-1631.

[9]Davis H，Guo X，Lambert S，et al.Small molecule induction of human umbillical stem cells into MBP-positive oligodendrocytes in a defined three-dimensional environment[J]. ACS Chem Neurosci，2012，3(1):31-39.

[10]Giuliani M，Fleury M，Vernochet A，et al.Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation[J].PLoS One，2011，6(5): e19988.

[11]Lee SH，Jang AS，Kwon JH，et al.Mesenchymal stem cell transfer suppresses airway remodeling in a toluene diisocyanate-induced mutine asthma model[J].Allergy Asthma Immunol Res，2011，3(3):205-211.

[12]朱珊，阴怀清，刘榕.神经生长因子对高胆红素血症新生大鼠脑组织Bcl-2和Bax表达的影响[J].中国妇幼保健，2016，31(9):1957-1960.

[13]Jenny B，KanemitsuM，Tsupykov O，et al.Fibroblast growth factor-2 overexpression in transplanted neural progenitors promotes perivascular cluster formation with a neurogenic potential[J].Stem Cells，2009，27(6):1309-1317.

[14]何俊峰，顾国妹，龙大宏.神经生长因子重组反转录病毒载体在神经干细胞中的表达[J].中国组织工程研究，2014，18(19):3100-3104.

[15]何佳，鄢波.转染胶质细胞源性神经营养因子诱导神经干细胞分化[J].中国组织工程研究，2015，19(50): 8167-8171.

[16]段奎甲，王向鹏，杨智勇，等.GDNF基因修饰神经干细胞移植治疗大鼠帕金森病[J].南方医科大学学报，2016，36(1):32-38.

[17]闫宇辉，李少恒，孔亮，等.NT-3高表达促进神经干细胞向胆碱能神经元分化[J].中国药理学通报，2016，32 (5):631-637.

[18]Rodrigues CM，Solá S，Silva R，et al.Bilirubin and amyloid-beta peptide induce cytochrome C release through mitochondrial membrane permeabilization[J].Mol Med，2000，6(11):936-946.

[19]Hankø E，Hansen TW，Almaas R，et al.Bilirubin induces apoptosis and necrosis in human NT2-N neurons[J].Pediatr Res，2005，57(2):179-184.

[20]Grogean S，Koziel V，Vert P，et al.Bilirubin induces apoptosis via activation of NMDA receptors in developing rat brainneurons[J].Exp Neurol，2000，166(2):334-341.

[21]Dimitrov T，Krajcsi P，Hermiston TW，et al.Adenovirus E3-10.4K/14.5W protein complex inhibits tumor necrosis factor-induced translocation of cytosolic phospholipase A2 to membranes[J].J Virol，1997，71(4):2830-2837.

[22]Fernandes A，Brites D.Contribution of inflammatory processes to nerve cell toxicity by bilirubin and efficacy of potencial therapeutic agents[J].Curr Pharm Des，2009，15 (25):2915-2926.

[23]Zou JY，Crews FT.TNF alpha potentiates glutamate neurotoxicity by inhibiting glutamate uptake in organotypic brain slice cultures:neuroprotection by NF kappa B inhibition [J].Brain Res，2005，1034(1/2):11-24.

[24]Einstein O，Friedman-Levi Y，Grigoriadis N，et al.Transplanted neural precursors enhance host brain-derived myelin regeneration[J].J Neurosci，2009，29(50):15694-15702.

[25]Amini N，Vousooghi N，Hadjighassem M，et al.Efficacy of human adipose tissue-derived stem cells on neonatal bilirubin encephalopathy in rats[J].Neurotox Res，2016，29 (4):514-524.

[26]杜宜洋.神经生长因子对高胆红素血症新生大鼠脑组织Fas/Fas-L表达的影响[D].太原:山西医科大学，2015.

[27]栾佐，尹国才，胡晓红，等.人神经干细胞移植治疗重度新生儿缺氧缺血性脑病一例[J].中华儿科杂志，2005，43(8):580-583.

[28]栾佐，屈素清，杜侃，等.人神经前体细胞移植治疗新生儿脑损伤后遗症——重度视觉障碍的临床观察[C]//中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编(上册).北京:中华医学会，2012.

[29]刘卫鹏，屈素清，栾佐，等.人神经前体细胞移植治疗重度脑瘫患儿疗效观察[J].中国当代儿科杂志，2012，14 (10):759-762.

[30]周菊花，方素珍，周细中，等.神经干细胞移植治疗重度脑瘫患儿的研究进展[J].临床儿科杂志，2014，32(1):85.

[31]王凤，栾佐.人间充质干细胞活性因子鞘内注射治疗新生儿中-重度缺氧缺血性脑病1例[J].转化医学杂志，2014，3(5):318-320.

[32]李迎.脐血干细胞移植与神经生长因子联合治疗小儿脑性瘫痪的安全性分析[J].中国组织工程研究，2014，18(28):4588-4592.

The trends of neural stem cells in the treatment of neonatal bilirubin encephalopathy

LI Ling，LI Guinan
(Department of Neonatology，Hunan Children’s Hospital，Changsha Hunan 410007，China)

Neonatal bilirubin encephalopathy(NBE)is one of the common causes of brain injury in newborns，which is caused by the neurotoxicity of indirect bilirubin to the basal ganglia，brain stem and other nerve tissue damage，then shows different nerve dysfunction.At present，there is no effective treatment for the sequela of bilirubin encephalopathy.With the rapid progress in the study of neural stem cells，it brings new hope for the therapy of brain damage caused by bilirubin encephalopathy.This review will expound the application prospect of the neural stem cells transplantation in NBE，expecting to find a new effective method to treat bilirubin encephalopathy.

Neural stem cells；Bilirubinencephalopathy；Treatment；Neonate

R722.15＋9

]A

2095-3097(2017)03-0181-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.03.013

2016-11-01 本文编辑:徐海琴)

410007湖南长沙，湖南省儿童医院新生儿科(李 玲，李贵南)

李贵南，E-mail:172605814＠qq.com