循环肿瘤细胞的生物学特性及临床应用

周游，蒋敬庭

循环肿瘤细胞的生物学特性及临床应用

周游，蒋敬庭

恶性肿瘤是一种细胞增殖与死亡失衡的疾病，其导致患者死亡的首要原因是复发与转移。早在 19 世纪就有学者发现肿瘤细胞能通过血流传播到远处器官[1]。1869 年Ashworth[1]首次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）的概念。然而，直到最近二十年 CTCs 才得以分离和鉴定。CTCs 具体是指肿瘤患者外周血中来源于实体肿瘤且在逃避宿主免疫杀伤后存活的一群个数稀少的异质性肿瘤细胞。它不仅存在于转移性肿瘤患者的血液中，也可存在于放疗后的原位癌患者中。目前大量临床研究证实 CTCs是肿瘤侵袭转移的关键因素[2-3]。相比于创伤较大的病理学诊断，外周血 CTCs 的检测取材方便、可重复操作、灵敏度高、特异性强，可实时监测肿瘤细胞的转移情况以及评估肿瘤的进程。它的出现不仅提示可能有复发的风险，而且可被作为预后的分子标记物，具有重要的临床价值。本文就近年来 CTCs 的生物学特性及其临床应用进展作一综述。

1 CTCs 的生物学特性

1.1 CTCs 的增殖活性

肿瘤患者外周血来源的 CTCs 是一群平均半衰期为1 ～ 2.4 h 的异质性肿瘤细胞[4-5]。大部分CTCs 在体内循环过程中处于休眠状态，期间也可能会发生凋亡，最终只有少部分 CTCs 形成转移灶，但目前所用的检测方法难以辨别休眠和活化的 CTCs，同样也不能确定其是否正处于细胞周期，但这些特征都可能影响患者对治疗手段的反应。研究发现，CTCs 低表达增殖相关的核蛋白 Ki-67[6-8]，提示其可能为不处于细胞周期中的静息肿瘤细胞，而且这些非增殖的细胞可能对目前使用的化疗方法不敏感，因此更易于产生化疗耐受从而存活下来。有报道称活化的 CTCs 可分泌细胞角蛋白 19（CK19）和 MUC-1，通过EpiSpot 等技术可将这些蛋白检测出来[9]，而凋亡的 CTCs 可通过 M30 染色进行鉴定[10]，因此通过计算 CK19 和 M30 的比值可以推断活化 CTCs 所占的比例[11]，进而指导下一步的治疗。

1.2 CTCs 标记基因的表达和不完全间质转化

现有研究表明肿瘤细胞具有极大的异质性，而来源于原发灶的 CTCs 同样也是一个异质性极高的群体[12]，因此经典的上皮标记物如细胞黏附蛋白（EpCAM）或 CK 等并不能识别血液中所有的 CTCs 群体[13]。据报道 Normal-like型乳腺癌细胞表达脂肪组织及非上皮细胞标记物，低表达上皮标记基因，因此基于检测 EpCAM 抗原的 CellSearch 系统往往难以检出 Normal-like 型乳腺癌细胞[14-15]，只有使用CD146 才能检测出这群特殊的 CTCs[16]。同时，单一的 CK抗体可能无法检测出所有表达于乳腺癌细胞的 CK 蛋白[17]，合适的或更广谱的 CK 抗体才能增加检出率，降低假阴性。最近关于 EpCAM 通路的研究发现，抗体只能识别糖蛋白的胞外段，但经蛋白酶剪切后 EpCAM 胞内段可重定位到细胞核内，而核内的 EpCAM 在体内往往具有致瘤性[18]。由此可见，肿瘤细胞的增殖可能需要 EpCAM 的短暂表达和剪切，这也给靶向 EpCAM 的 CTCs 检测系统带来了诸多困难。此外，有些肿瘤如黑色素瘤属于非上皮细胞癌，不表达 EpCAM 或 CK，因此从患者外周血中分离出 CTCs异常困难。目前分离这部分 CTCs 的主要方法是抗原筛选技术[19]。近期研究显示，黑色素瘤患者动脉血中的 CTCs 数目明显高于静脉血[20]，可作为 CTCs 的主要来源。与黑色素瘤类似，恶性胶质瘤（GBM）也不表达 EpCAM，并且未有证据表明 GBM 细胞可以通过血脑屏障，因此分离CTCs 同样显得相当困难，目前只有三个研究组报道了从GBM 患者外周血中成功分离 CTCs 的案例[21-23]，并证实CTCs 中含有与原发灶相同的 EGFR 突变。

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）引起的表型转变可能是不能通过常规上皮细胞筛选标志检测 CTCs 的另一个原因。内在突变或特定外部刺激均会导致肿瘤细胞向间质或半间质的表型转化[24]，而转化后的细胞上皮表面标记物表达水平很低，可能导致 CTCs 检测的假阴性。Sullivan 等[22]发现与原发灶相比，CTCs 中有更多的间质相关基因如 SERPINE1、TGFB1、TGFB2 等的富集。Aktas 等[25]发现 62% CTCs 阳性和 7% CTCs 阴性的肿瘤患者血液中都至少表达一种 EMT 标记物（Twist1、Akt2 或PI3Kalpha）。而 Raimondi 等[26]发现两种 EMT 标记物vimentin 和 fibronectin 分别在 28% CK 阳性和 38% CK阴性的肿瘤患者中表达，因此，vimentin 等 EMT 标记物可作为上皮标记物的补充在 CTCs 检测中发挥重要作用[27]。

1.3 CTCs 的干细胞样表型

肿瘤细胞的 EMT 特征和干性密不可分[28]，因此部分CTCs 可能具有干细胞样表型。最新单细胞测序结果显示干细胞标记物 ALDH1、CD44 和 KLF4 以及一些细胞增殖相关标记物在前列腺癌 CTCs 中显著富集[29]。研究表明，CTCs 阳性乳腺癌患者血液中 ALDH1 的表达阳性率为46% ～ 70%，且与 EMT 标记物及乳腺癌分期相关[26]。Theodoropoulos 等[30]通过分析 CTCs 基因表达谱发现，约35% CTCs 具有 CD44+/CD24-/low干细胞样表型，17% CTCs 具有 ALDH1high/CD24-/low干细胞样表型，且 ALDH1的表达与患者化疗耐药相关。MRP1、MRP4、MRP5 和MRP7 等耐药相关蛋白表达于超过 80% 的乳腺癌转移患者，且与疾病进展密切相关[31]。

1.4 CTCs 基因型和表型的改变

肿瘤患者的分子诊断和初始治疗方法都基于原发癌进行，但能预示疾病复发或进展情况的是转移性肿瘤细胞。研究表明，CTCs 的成瘤能力比其亲本高出数十倍[32-33]，显然具有强侵袭能力的 CTCs 对患者的风险评估具有更大的意义，并且 CTCs 与原发肿瘤细胞相比基因型和表型的改变可能会影响患者远期疗效[34-35]。研究发现，HER2-原发乳腺癌患者中存在 HER2+CTCs，而 HER2+乳腺癌患者中也存在 HER2-CTCs[36]。类似的情况也出现在 EGFR、雌激素受体 alpha 和黄体酮受体中[25, 31]。此外，单细胞芯片杂交数据显示虽然原发灶、转移灶以及 CTCs 中都存在结直肠癌相关基因 APC、KRAS 和 PIK3CA 等的驱动突变，但仍有相当一部分突变只能在 CTCs 中观察到，而在原发灶和转移灶中的频率很低[37]。由于 CTCs 分子特征与原发癌细胞具有差异，同时 CTCs 可能通过系统治疗经历强烈的选择，其基因组的不稳定可能导致新的癌细胞克隆形成，而这些克隆的基因型和表型不同于原发癌细胞，同样可能影响患者的疗效。而且由于 CTCs 可能从转移癌中进入血液循环，因此其基因型和表型更接近于转移癌。

然而并非所有肿瘤原发灶和转移灶均发生明显的基因型改变。比较原发前列腺癌和转移前列腺癌的突变谱发现两者具有很高的相似性，由此证实 CTCs 基因组可作为一种非侵入性手段用于评估转移性前列腺癌的突变图谱[38]。此外，全基因组扩增结果显示，大部分去势抵抗性前列腺癌（CRPC）患者中的 CTCs 拷贝数变异同样也出现在原发灶中。同时，前列腺癌中 CTCs 也表现出显著的异质性，包括雄激素受体（AR）突变体和剪切变异体的表达，这可能是患者产生抗雄激素治疗的原因[29, 39]。总之，在治疗原发灶的同时辅以针对 CTCs 的有效治疗措施有望成为一种新的治疗策略。

2 CTCs 在肿瘤中的临床应用

2.1 CTCs 与肿瘤的辅助诊断和分期

Bevilacqua 等[40]通过 CTCs 检测发现一例临床诊断为“低分化神经内分泌瘤”的患者外周血中存在EpCAM+CK+CTCs，肝脏穿刺活检显示肝内转移灶，最终确诊为小细胞肺癌（SCLC），提示 CTCs 具有辅助诊断肿瘤早期转移的价值。研究表明，CTCs 高表达于部分 TNM 分期较早的肿瘤患者外周血中，可导致肿瘤的快速转移和复发，且与肿瘤分期相关。Sastre 等[41]检测了 94 例大肠癌患者外周血中 CTCs 的表达，结果显示，CTCs 阳性率与结肠癌患者的临床分期相关。Krebs 等[42]通过 CellSearch 系统检测 III ～ IV 期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的 CTCs，发现 IV 期 NSCLC 患者 CTCs 数量显著高于 IIIb和IIIa期 NSCLC 患者。Naito 等[43]也发现广泛期 SCLC 患者外周血 CTCs 中位数为 9.5 个/7.5 ml，而局限期 SCLC患者外周血 CTCs 中位数仅为 1 个/7.5 ml，提示 CTCs 数目与 SCLC 患者分期相关。报道显示，乳腺癌 CTCs 中GA733-2、MUC1、MGB1 和 SPDEF 的表达状态与乳腺癌临床分期相关[44]。

2.2 CTCs 与肿瘤的疗效和预后

研究显示，观察患者治疗前及治疗过程中外周血中CTCs 数目的变化有助于评估肿瘤进展和药物治疗疗效。Sastre 等[45]发现化疗前外周血 CTCs ≥ 3 个/7.5 ml 和＜ 3 个/7.5 ml 的患者中位无进展生存期（mPFS）和中位总生存期（mOS）均有显著差异。相较于化疗后外周血 CTCs水平较高的患者，化疗后外周血 CTCs 水平低的患者的mPFS 和 mOS 显著延长，提示治疗前及治疗过程中 CTCs数目的变化是转移性结直肠癌患者无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）的独立预后因素。研究显示，相较于外周血基线 CTCs 数目较高的 CRPC 患者，外周血基线 CTCs数目较低的 CRPC 患者 mOS 更长，且经三个周期的多西他赛化疗后患者生存期也显著延长[46]。Normanno 等[47]发现患者一轮化疗后的 CTCs 数目较基线水平 CTCs 更能反映进展期 SCLC 的预后和疗效。Martín 等[48]也证实患者一轮化疗后 CTCs 数目可作为转移性乳腺癌患者 PFS 和OS 的独立预后因素。与乳腺癌类似，晚期前列腺癌和胰管腺癌（PDAC）患者的 CTCs 数目也可以预测疾病进程和预后[49-50]，但在局部前列腺癌和 GBM 中，研究者并未发现CTCs 数目与患者临床指标明显相关[23, 51-52]。

2.3 CTCs 与肿瘤的复发和转移

脱离原发灶进入血液循环的肿瘤细胞能否导致肿瘤的复发转移不仅取决于肿瘤微环境，还取决于血液循环中肿瘤细胞的特性。只有具备自我更新和无限增殖潜能的循环肿瘤干细胞（circulating tumor initiating cells，CTICs）才能引起肿瘤的复发和转移。因此，动态监测治疗过程中患者 CTICs的变化可更加准确地评估疗效。一项前瞻性研究显示，前列腺癌骨转移患者的 CTCs 数目显著高于淋巴结转移的患者[53]。越来越多的证据表明，CTICs 在肿瘤转移中具有重要作用。CD44 是胃癌干细胞的表面标记。Li 等[54]发现CTCs 与胃癌患者的淋巴结转移、远处转移及复发显著相关，且相较于 CD44-患者，CD44+CTCs+患者更容易出现转移和复发，复发时间也相对较短。COX 比例风险模型显示，CD44+CTCs 和 TNM 分期可作为胃癌复发的独立预后因素。通过 CellSearch 系统检测 492 例乳腺癌患者外周血CTCs 发现，基线 CTCs ≥ 5 个/7.5 ml 外周血的患者存在更多的转移部位，且其在化疗失败后更易产生新的病变和转移病灶，生存期也较短，提示基线 CTCs 水平可预测乳腺癌转移[55]。此外，单细胞 RNA 测序结果显示，人和小鼠PDAC CTCs 均高表达基质来源的 ECM 蛋白，表明其可能通过表达 Wnt 通路效应分子和 ECM 蛋白来促进肿瘤转移[56]。

2.4 CTCs 与肿瘤的个体化医疗

随着分子靶向治疗的不断发展，人们发现靶基因与肿瘤患者的疗效密切相关，如表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂对 EGFR 突变型非小细胞肺癌敏感，而伊马替尼则可用于 KIT 激活突变的胃肠道间质瘤和黑色素瘤等，因此，明确肿瘤的靶基因对患者的治疗具有积极意义。作为“液体活检”的 CTCs 分子特征谱可用于检测肿瘤治疗相关的基因突变或蛋白，从而实时监控肿瘤细胞的生长和变化，指导患者的个体化治疗。Maheswaran 等[57]发现接受吉非替尼治疗的 NSCLC 患者其 CTCs 存在 EGFR 突变（T790M），而且 CTCs 携带的基因信息与肿瘤组织具有高度一致性，因此 CTCs 可以替代肿瘤组织指导靶向治疗。HER2 是重要的乳腺癌预后因素，抗 HER2 靶向治疗可显著延长HER2 高表达乳腺癌患者的生存期，并改善其生活质量。但有研究显示，HER2 受体在乳腺癌患者肿瘤组织和 CTCs中的表达不一致[58]，而目前还缺乏针对肿瘤组织 HER2 阴性而 CTCs HER2 阳性的患者靶向治疗疗效的临床研究。

3 展望

近年来，单细胞全基因组测序技术的迅速发展使基于CTCs 基因组和基因表达谱的肿瘤标志物检测成为新的研究热点，CTCs 检测也取得了突破性的进展，但仍然面临诸多挑战。由于 CTCs 具有异质性，现在还没有发现任何一种能够检测所有 CTCs 的方法，因此亟需进一步研究CTCs 的分子生物学特征，寻找可进一步提高 CTCs 检测敏感性、特异性和可重复性的先进技术，并统一其检测标准，以期发现可指导患者个体化治疗的新靶点。综上所述，CTCs作为非侵袭性诊断标志物，在恶性肿瘤的早期转移诊断、分期、预后评估、疗效监测以及个体化医疗方案制定等方面具有重要作用，随着研究的不断深入，CTCs 将为肿瘤的诊断和治疗提供新策略和新前景。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.012

国家科技支撑计划项目（2015BAI12B12）；国家自然科学基金（81171653）；江苏省条件建设与民生科技专项资金（BL2014034）；江苏省重点研发计划基金（BE2015633、BE2015634）

213003 常州，苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心/江苏省肿瘤免疫治疗工程技术研究中心/苏州大学细胞治疗研究院

蒋敬庭，Email：jiangjingting@suda.edu.cn

2016-11-17