糖尿病勃起功能障碍动物模型的制备

曾 杰 刘 瑶 焦薇薇 许明贺 王 杰综述 王传航审校

1. 中日友好医院（北京 100029）；2. 西南医科大学护理学院

·综 述·

糖尿病勃起功能障碍动物模型的制备

曾 杰1刘 瑶2焦薇薇1许明贺1王 杰1综述 王传航1审校

1. 中日友好医院（北京 100029）；2. 西南医科大学护理学院

流行病学调查显示，糖尿病患者中ED的发病率为19.5%～75.2%[1,2]。随着糖尿病发病率的不断升高，糖尿病勃起功能障碍（DMED）的发病率也日渐增高，预计我国到2025年DMED患者会达到4000万[3]。对疾病的发病机制进行研究可以指导临床诊疗，而制备合适的动物模型是进行高质量实验研究的前提。本文针对DMED动物模型的制备进行综述。

一、造模动物的选择

综合考虑实验目的、经费状况、动物自身特点、饲养环境和与人体结构的相似度等因素，选用恰当的造模动物可以确保实验的科学性和可信性。实践中常选择大鼠、小鼠、兔、猪等动物，少数情况下也选择灵长类动物如猴[4]。

在DMED的造模中，啮齿类动物因为价格较低和技术成熟等原因故较多的被选用[5]。其中，大鼠盆腔及阴茎组织的神经反射、血管走向以及相关受体分布等与人类有较强相似度，而且抗感染能力强和繁殖周期短[6]，故在DMED的造模中使用最多。小鼠因体型小易捕捉，发育迅速，性成熟早，尾部血管丰富，在DMED的分子病因学机制研究中选用较多[7]。

与其他常用实验动物相比，猪和人类在解剖结构、生理病理等方面具有更大的相似度，与人的基因纯合度为95%，人工选育的小型猪由于性格温顺而易于进行实验操作，特别是随着现代动物保护意识的增强和“3R原则[即减少（Reduction）、优化（Refinement）和替代（Replacement）]”的实行，小型猪在动物实验中具有更大优势[8]。有研究采用高脂高糖饲料喂广西巴马小型猪，半年后有50%小型猪产生糖尿病，1年后DMED的总成模率为13%[9]。

兔大小适宜、方便管理，其阴茎结构和人很相似，尤其是在海绵体张力的神经与非神经因素方面[10]，且没有阴茎骨，海绵体组织相对丰富。陈国强等[11]从兔的耳缘静脉注射四氧嘧啶，成功建立糖尿病动物模型，再通过测定海绵体内压，成功建立DMED动物模型。Pereira等[12]采取相同的方式建立家兔DMED模型，通过病理和免疫组化检测，发现发生ED的机制是血管结构变化，阴茎血液供应减少。

啮齿类动物虽然广泛用于建立人类疾病动物模型，但是由于存在巨大的种属差异，很多在动物研发中证明对鼠有效的药物却对人无效。灵长动物从生物学上来说是人类的近亲，相比其他动物模型，灵长类动物可更好地复制人类疾病[13]。但是由于数量相对少、费用昂贵等因素，目前缺少使用非人类灵长类动物建立DMED模型的报道。

二、DM动物模型的建立

（一）1型糖尿病（Type 1 diabetes mellitus，T1DM）动物模型

T1DM动物模型的建立多基于破坏动物胰岛，方式有药物诱导和手术切除胰腺[14]。手术切除胰腺对实验动物伤害较严重，操作有一定难度，批量造模困难。药物诱导简便易操作，常用的药物有链脲佐菌素（STZ）和四氧嘧啶（alloxan,ALX）。STZ和ALX对动物胰岛β细胞有特异的破坏作用，可减少或终止动物胰岛素分泌，引起实验动物患糖尿病。

STZ是一种诱导DNA双键断裂的强烷基化药剂，可抑制葡萄糖运转，影响葡萄糖激酶功能，损伤胰岛β细胞。据报道[15]，成年雄性长尾猴静脉注射STZ,两个月后再次注射该药,定期静脉抽血可发现长尾猴血糖水平明显升高，内源性胰岛素明显降低。由于大鼠和小鼠以及同种动物不同品系之间对STZ敏感性不同，药物注射剂量和给药方式等也有差异。有报道称，一次性给小鼠大剂量注射STZ（100mg/kg）[16]，大鼠注射STZ（55～65mg/kg）[17]可导致胰腺β细胞坏死，建立无炎症性T1DM模型。也有研究报道，小鼠小剂量（40mg/kg）连续腹腔注射STZ，可引发自身免疫性损害，诱导产生免疫性T1DM动物模型[18]。

ALX对胰岛β细胞具有特殊的破坏作用，可通过产生超氧自由基终止胰岛素的分泌。以兔为造模动物，可采用耳缘静脉注射ALX的方式，连续2次小剂量（首次按80mg/kg，24h后按照120mg/kg）给药比1次大剂量（150mg/kg）给药成模率更高（80%/20%），实验动物死亡率更低（10%/70%）[19]。梁沛余等[20]认为多次ALX给药法建立糖尿病大鼠模型时，第1次大鼠腹腔注射ALX 100 mg/kg，24h后补注相同剂量是最佳给药时间和剂量。丁利等制备T1DM小鼠模型时[21]，利用ALX腹腔两次注射法，首次剂量为120mg/kg，24h后再次注射80mg/kg，可防止小鼠低血糖的发生，降低死亡率。

（二）2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）动物模型

在T2DM模型动物的构建中，为避免大剂量注射STZ导致T1DM和动物血糖过低而死亡，可采用烟酰胺（NAA）预先15min注射保护胰岛β细胞，再给STZ破坏，能够建立成模率高、病死率低、症状明显的T2DM模型[22,23]。大鼠可预先注射NAA100～200mg/kg，小鼠可预先注射NAA120～240mg/kg，有助于清除氧自由基，减轻STZ导致的胰岛细胞氧化损害。

饮食联合药物干预也是建立T2DM动物的重要手段，乐岭等[24]利用高脂饮食喂养SD大鼠，8周后大鼠体质量增加，腹腔脂肪明显增多，以小剂量STZ腹腔注射诱导糖尿病，检测发现大鼠出现甘油三酯、游离脂肪酸和胰岛素抵抗指数升高，高血糖与胰岛素抵抗均出现，与人类T2DM病理生理特点相似。在利用小鼠[25]、猕猴[26]造模时，给予高脂高糖饮食饲养后，再使用药物制备DM模型，也能发现实验动物出现肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗，符合人类T2DM的临床特点和病理特征。因此，这种造模方法简便可行，重复性好，是研究T2DM机制和并发症较为理想的模型。

在实验性DM动物模型之外，近年也有自发性T2DM动物模型应用于相关研究。例如OLETF大鼠、GK大鼠、db/db小鼠、黑线仓鼠等，具有慢性DM病程、多食、轻度肥胖、胰腺增生等特点，早期可出现胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱，继而胰岛功能逐步减退，很接近人类T2DM。而且，OLETF大鼠具有由于代谢紊乱而致的血管内皮功能障碍的病理表现[27]，血管内皮功能障碍是ED的病理基础之一，因此利用自发性T2DM动物建立2型糖尿病勃起功能障碍模型是值得研究的方向。

近年来基因编辑技术已成为生物医学领域的一大热点，通过对基因组进行精确定点修饰，可快速构建动物模型。利用基因编辑技术，研究者已经成功制备T2DM动物模型[28]。然而，目前基因工程动物模型有成本较高、单基因模拟、繁殖时间长等缺点，也可能因脱靶效应而引发生物安全风险，仍需随着基因工程技术进一步发展，建立科学安全的多基因修饰的动物模型。

三、勃起功能的评估

DM造模成功后，下一步需评估实验动物的勃起功能。诱导阴茎勃起的方法有血管活性药物海绵体注射法、负压吸引法、电刺激法、可视性性兴奋刺激法等，在实际实验中常使用阿扑吗啡实验、电刺激法以及模拟自然状态下交配行为等。

阿扑吗啡（APO）作为一种非选择性的中枢多巴胺受体激动剂，可通过激动D1、D2样受体，诱发实验动物产生阴茎勃起。研究者对DM兔予APO皮下注射,观察和记录勃起状态，发现DM兔表现出显著的勃起功能抑制[29]。DM大鼠成模后进行APO实验，随着时间延长，勃起次数和勃起率逐渐降低，从中可筛选出DMED大鼠进行研究[30]。此法评价阴茎勃起的判定标准具有一定主观性，对于动物同样的表现，不同的实验者可能会产生判断上的差异。

运用电刺激动物阴茎海绵体神经诱发勃起，再通过换能器读取阴茎海绵体内压（ICP），ICP可直接反映阴茎的勃起功能，因此该法较为客观准确。用电刺激大鼠阴茎海绵体神经后测量ICP及平均颈动脉压（MAP），对比正常组和T2DM组大鼠的ICP和MAP，可发现T2DM组的ICP明显低于正常组[31]。通过改良ICP测量方法，选择阴茎脚作为穿刺部位，利用倒刺状穿刺针进行穿刺，可使进针稳定精准，实验测定ICP成功率可达100%[32]。利用电刺激盆神经，也可以诱发兔[11]、狗[33]等动物阴茎勃起，评价其勃起功能。电刺激法在国外是评价阴茎勃起功能的标准方法，稳定准确，重复性较好，故应用较为广泛[34,35]，但也有操作方法复杂、对动物创伤大、电刺激参数难以把握等不足。

评价动物勃起功能也可采用交配实验，通过以药物诱导雌鼠发情，随后将雌鼠和STZ注射后的糖尿病雄鼠放在一起，观察记录雄鼠乘骑、插入、射精次数及射精潜伏期、射精后间隔来评价勃起功能[36]。马凯伟等[37]将DM大鼠分为APO组、西地那非组和模型组，分别予以相应药物干预后用发情雌鼠与之配对，结果发现造模动物经过药物刺激后的状态难以准确体现勃起功能，相比之下，由发情雌鼠诱导更可能激发出模型雄鼠阴茎的确切勃起。该法易受环境影响，有的勃起功能正常的动物可能因与雌性动物同笼受惊，缺乏交配主动性，从而会导致假阳性的实验结果。

四、小结

目前，在人类身上进行性功能的相关研究受到伦理等多方因素的制约，因此研究者需要设计各种DMED的动物模型，研究并阐明糖尿病导致ED的发病机制、药物的药理作用等。在DMED实验动物模型中，啮齿类动物模型的建立比较成熟，在较大程度上取代其他动物成为DMED的主要动物模型。最后，探索建立更加符合人类生理病理特点的糖尿病动物模型，提高评价勃起功能的方法的准确性，减少实验动物伤害，降低实验成本，提高成模率，是今后研究工作的着力点之一。

致谢：本课题受国家自然科学基金资助（编号：81673978）

糖尿病; 勃起功能障碍; 疾病模型, 动物

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（2017-05-30收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.04.017

R 587.1; R 698.1