单核苷酸多态性在人类基因组学发展中的应用

蒋刈戴朴韩东一

1中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科（北京100853）

2福建医科大学省立临床医学系、福建省立医院耳鼻咽喉科（福州350001）

·综述·

单核苷酸多态性在人类基因组学发展中的应用

蒋刈1，2戴朴1韩东一1

1中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科（北京100853）

2福建医科大学省立临床医学系、福建省立医院耳鼻咽喉科（福州350001）

第三代基因组遗传标记的单核苷酸多态性（SNP）目前是与分子标记有关领域研究的焦点。通过连锁分析或关联研究方法，单核苷酸多态性应用于生物的起源、进化及迁移等群体遗传学研究、疾病相关致病或易感基因研究和个体化药物治疗等诸多领域。随着检测和分析技术的进一步发展，SNPs作为生物信息学研究的一个热点，将成为人类基因组研究计划走向实际应用的重要步骤。

单核苷酸多态性；基因组学；连锁分析；关联分析

Thiswork was supported by National Key Research and Development Program of China(2016YFC1000700,2016YFC1000704), State Key Program of NationalNatural Science Foundation of China(81230020),Fujian Medical Innovation Project(2016-CX-5).

Theauthorshave declared thatno competing interestsexist.

1 SNPs基本特性

SNPs作为第三代遗传标记，被广泛应用于生物的起源、进化及迁移等群体遗传学研究、疾病相关致病或易感基因研究和个体化药物治疗等诸多领域，成为与分子标记有关的各领域研究焦点，与其基本特性密切相关：

1.1高密度：人类基因组中平均每500～1000个碱基对中存在1个SNP，截至2016年11月07日，db⁃SNP数据库已列出人类的4,578,850个单核苷酸多态性位点，其广泛存在能够为任何一种待研究的目的基因提供一系列标记以进行分析[11，12]。

1.2高保守：与STRs等多态性标记相比，SNPs具有更高的遗传稳定性。STR的突变率为10-3[13]，特别是带有较长重复结构的STR更不稳定，SNPs的突变率很低，大约是10-8[14]，远低于STR的突变率。按照基因中SNPs的位置，可分为基因编码区SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周边SNPs（Peri⁃genic SNPs，pSNPs）以及基因间SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三类。大多数SNPs对个体的表型没有影响：比如位于基因组非编码区的SNPs；或者有些SNPs虽然位于基因组编码区，但是其碱基改变并不影响翻译后氨基酸的表达和蛋白结构。部分SNPs对个体有不同程度影响：比如位于基因启动子中的SNPs，其碱基改变会导致基因转录活性的改变，增加或者减少蛋白表达量，从而影响其生物学活性；部分位于蛋白质编码区的SNPs，翻译后改变关键功能区域的氨基酸序列，从而影响蛋白质的空间结构和功能，最终导致特定环境或条件下疾病的发生[15]。

1.3易分型：SNPs是二等位基因（biallelic），一般只由两种碱基组成。SNPs表现的单个碱基的变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）引起，通常不包括碱基的插入和缺失[16]。在基因组筛选中SNP往往只需+/-的分析，易于基因分型及等位基因频率计算，同时也利于自动化快速检测。

2 SNPs遗传分析方法

遗传学统计方法中最常用方法有两种：连锁分析和关联研究[17]，两者均是以分析致病基因与相邻碱基变异共分离为目的，通过在同一条染色体上设计系列SNPs作为待检测标记，研究潜在致病基因与系列SNPs之间的关系，来判断系列SNPs是否一起与潜在致病基因由父代遗传给子代。在一条染色体区域中，系列相关联的SNPs集合形成一个单倍型（Haplotype）。

2.1连锁分析

在各方的努力下，水科学方面的工作在中国渐见雏形。这主要得益于一批德高望重的科学家的支持，我很感动。由于这是很前沿的研究，发达国家都还没有重大计划，所以我们无法参照，缺乏可借鉴的经验，需要自己一步步探索。水科学对中国的意义又特别重大，因此早晚会成为一个主流科学，这已成为这个领域更多研究者的共识。

连锁分析（Linkage analysis）方法：是家系遗传学研究的一种方法，以连锁原理为基础，通过鉴定一个家系中经多代传递后仍存在的同一染色体上系列遗传标记（SNPs），检测在这个家系中系列遗传标记与疾病的传递是否相关。连锁分析特别适合于单基因疾病的遗传研究，应用于复杂疾病的研究还有很大局限性。

2.2关联研究

关联研究（Association analysis）方法：是群体遗传学分析方法的一种，以重组和连锁不平衡为基础，用于检测无亲缘关系群体中，某种疾病和待检测标记（SNP）的相关性的研究方法[18]。理论上，在随机交配的群体中，疾病基因的相关基因片段区域非常小，通过多代的传递，重组可能使突变与最初单倍型中的SNPs分离开，部分SNPs与突变组成新的单倍型传递很多代，这种SNPs与突变形成的非随机关联就是连锁不平衡。连锁不平衡相对于连锁分析更易检出相对风险率小于5.0%的微效基因，相比于单基因遗传模式更适合于多基因遗传模式遗传研究。为了避免人群混杂和基因重组对统计分析的影响，关联研究需要在正确的群体分层的条件下，选取与目的基因距离1CM遗传单位内一定等位基因频率的系列SNPs，进行显著性差异的统计学分析。SNPs与疾病关联的原因有两种：一是致病基因与SNPs存在很强的连锁不平衡；另一原因是SNPs本身与疾病的发生有关。

3 SNPs检测方法

SNPs的检测技术主要划分为传统经典检测时代和高通量检测时代[19]。传统经典检测技术主要是基于单链或者双链结构构象改变进行凝胶电泳检测的技术，包括限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)、等位基因特异聚合酶链反应分析(AS-PCR)、单链构象多态性分析(SSCP)、变性梯度凝胶电泳分析(DGGE)等，这些技术不能进行自动化检测，只能进行小规模的SNP分型测试，目前已不作为常规检测方法。高通量SNP分型技术已广泛运用于临床及科研[20-23]，按其技术原理可分为：基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy trans⁃fer,FRET)（例如Taqman），基于DNA聚合酶的微测序引物延伸法（例如SNaPshot、Mass Array），基于核酸杂交（例如基因芯片、高分辨率熔解曲线分析（HRM）法），基于结构构象（例如HRM）等。以下对这些技术特点进行分别描述：

3.1实时荧光PCR分析法（TaqMan探针法）

针对染色体上的不同SNP位点设计相应PCR引物和荧光TaqMan探针，探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。在PCR扩增中，与靶序列完全匹配的探针被核酸外切酶切割，从探针上切割下来5’-端报告基团远离淬灭基团，释放荧光信号，利用多通道荧光PCR仪进行检测，可以判读SNP的基因型。通常用于少量SNP位点分析，因设计探针捕获已知SNP，不能同时发现未知位点信息。

3.2 SNaPshot法

该技术基于单碱基延伸原理。设计5’-端碱基紧挨SNPs位点的引物，通过多重PCR反应体系扩增获得带有SNPs位点的PCR产物，在DNA聚合酶、四种荧光标记标记ddNTP和PCR产物模板的反应体系中，进行单个碱基延伸。通过单碱基延伸扩增后产生带有荧光标记的产物，经测序仪检测后，根据荧光的颜色可判读SNPs碱基种类，确定其基因型。通常用于10-30个SNPs位点分析。

3.3飞行时间质谱（MALDI-TOF）和MassArray法

质谱分析法主要是通过对样品的离子质荷比进行分析从而实现对样品定性和定量的检测方法。飞行时间质谱（MALDI-TOF）技术是在真空管中对待测样本与芯片基质共结晶体进行瞬时纳秒(10-9s)强激光激发，待测样本的核酸分子解吸附成为单电荷离子，其在电场中飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间可以获得待测样本精确分子量，该检测方法检测通量大、周期短、灵活性强，性价比高。

MassArray分子量阵列技术将基质辅助激光吸收/离子飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析与单碱基延伸技术相结合，首先通过PCR扩增出含有SNPs位点的一段DNA序列，用SAP酶纯化，单碱基延伸引物延伸，探针在SNPs位点处仅延伸一个碱基。同时用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基。基于MassArray平台的技术可以设计最高达40重的PCR反应，可以根据需求个性化设计SNPs位点，完成批量样本的同时检测，实验设计灵活，基因型检测结果准确性高。

3.4高分辨率熔解曲线分析（HRM）法

基于每条DNA序列都有其特定的熔解曲线和熔解温度原理，实时监测升温过程中双链DNA解链成单链DNA分子、荧光染料与双链DNA脱离时检测体系内的荧光信号。荧光信号值随着温度变化形成由强到弱的溶解曲线。不同片段大小及碱基序列的DNA形成独特的熔解曲线外形。SNP位点的杂合状态或者甲基化程度等都会影响熔解温度和溶解曲线，能够有效区分不同SNP位点基因型。同时该检测方法无需设计特异性探针，在PCR结束后直接运行HRM完成样品基因型的分析，操作简便、快速，成本低，结果准确，并且因真正的闭管操作避免污染，能同时检测扩增区域已知和未知的SNP。但是这类技术需要特殊检测仪器和染料，检测条件优化过程复杂。

3.5基因芯片

基因芯片是基于核酸分子杂交原理，在小面积固相载体内按照位置预设核酸分子所组成的微点阵列。在一定条件下，标记后的样品核酸片段与固相载体上预设的核酸分子杂交，能在专用的芯片阅读仪上检测到杂交信号。基因芯片主要由寡核苷酸芯片和cDNA芯片两大类组成。目前用于分析单核苷酸多态性研究的基因芯片多是基于特异性寡核苷酸杂交设计的芯片，根据需求将数十万甚至上百万个特异性寡核苷酸探针原位合成固定于芯片基片上，将PCR扩增并标识的待检测目标DNA混合物与探针杂交，可同时完成检测。比如Illumina公司的Infinium全基因组SNP芯片[24]包括4种产品：Human1M-Duo、Hu⁃man660W-Quad、HumanCytoSNP-12和HumanEx⁃on510S-Duo。它们分别包含了1.1M、658K、300K和510K个标签SNP。Human1M-duo芯片包含超过110万个标签SNP并且可以同时检测两个样品，平均检出率和重复性超过99%。HumanCytoSNP-12芯片能同时检测12个样品。Affymetrix公司设计的全基因组SNPArray6.0[25]，在一张芯片上可以分析一个样品的906,600个SNPs，同时含946,000个CNV探针。基因芯片具有高通量、高效性，但是此类芯片适用于全基因组SNP扫描，价格昂贵，不适用于单基因SNP检测。

4 SNPs检测用途

4.1 SNPs与疾病

SNPs与疾病研究的方式主要有两种，一种主要通过比对健康和患病人群或者比较高危与低发人群SNPs发生频率的差异，发现疾病相关基因。比如，全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies，GWAS）[26-27]，通过应用全基因组范围高密度遗传标记（SNP或CNV）检测芯片对大规模人群样本DNA进行分型检测,用关联分析的方法来定位一系列疾病的主要致病基因与SNPs之间的相关性，已在癌症、糖尿病、高血压、传染性疾病（艾滋病，麻风病，肝炎等）、自身免疫病、神经精神病、忧郁症和哮喘等疾病中找到多个疾病相关易感基因[28-34]。另一种是通过研究SNP与疾病预后相关位点的关联性，特别是影响肿瘤发生转移的代谢通路、信号通路等中某些关键基因的相关性，来研究疾病或肿瘤预后。通过基因易感性的分析，对疾病的预后进行评估，为个体化治疗提供理论支持[35-38]。

SNPs的疾病研究方法也运用在耳聋研究中，早期的研究主要集中在常见耳聋基因热点突变始祖效应研究[38-42]，近年来文献报道主要集中在通过高通量检测技术发现老年聋、突发性耳聋和噪声性耳聋等疾病的遗传危险因素[43-47]：可以通过GWAS进行人群分层检测发现特异性SNPs，如Hoffmann等运用GWAS对非西班牙裔白人、拉丁美洲人、东亚和非洲裔美国人四组人群的老年聋患者与正常对照人群研究，发现与非西班牙裔白人人群中老年性耳聋特异性的SNPs位点，可能与其老年聋发生相关[43]；也可以通过设计已知基因的关联SNPs发现可能的致病基因，如Ryosuke等人设计了192个基因的相关SNPs检测192例突发性耳聋患者，分析发现日本突发性耳聋的可能关联的SNP为SOD1 rs4998557[44]。总之，SNPs检测广泛运用在耳聋基因定位、相关致病基因关联性和遗传危险因素的研究中[45-46]。

4.2 SNPs与药物代谢

药物代谢酶（Drug metabolizing enzymes, DMEs）和药物作用靶点基因特性的变化可影响药物的体内浓度和靶组织对药物的敏感性，导致个体对药物反应性（包括药物的疗效和不良反应发生）存在差异。目前，个体化用药分子检测项目包括药物代谢酶与转运体基因遗传多态性检测、药物作用靶点基因遗传变异检测、其他基因变异检测和药物作用靶点基因mRNA表达检测四种类型。其中，药物基因组生物标志物的检测，比如SNPs，将有助于了解在不同遗传变异个体中的药物（代谢）动力学差异，是临床实施个体化药物治疗的前提。细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)是人体中最重要的药物代谢酶，CYP2D6和CYP2C19与药物代谢的个体差异关联性最大。目前国家卫计委认可的药物代谢酶多态性检测项目包括CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、ADCB1等15个基因[48-51]。

4.3 SNPs与生殖医学

因SNPs在世代中的数量及遗传稳定，对表型没有影响的SNPs在全基因组关联研究中也仍然有用。在胚胎植入前遗传学诊断（Preimplantation ge⁃netic diagnosis，PGD）中设定与致病基因紧密连锁的SNPs，通过分析亲代和子代连锁的SNPs可追踪染色体的亲本来源，可最大限度地监测并消除扩增过程中位点丢失（Allelic drop-out，ADO）对诊断的影响，同一染色体上的系列SNP位点和致病基因位点同时发生ADO的概率比单一位点的ADO概率低得多[52]，也可用于单亲源性二倍体的检测。在PGD实践中，也可以运用微阵列单核苷酸多态技术（SN⁃Parray），全面检测染色体组的数目异常和结构异常，除了已知的染色体CNVs外，还能检测出更小片段的缺失和重复[53-54]。

4.4 SNPs与遗传分析

在群体进化研究及亲缘关系的法医学检测中，STRs检测被认为是金标准[55]。虽然SNPs突变率远低于STRs，同样适用于连锁分析的亲缘关系鉴定和关联分析的群体遗传学。然而，单个SNP提供的遗传信息尚不能满足分析的需要，在批量样品检测中，对3-4个SNPs结果综合分析相当于1个STR基因座检测结果，需要设计50-60个互不连锁的SNPs进行联合分析，以提高单次检测的信息量和个体识别能力，满足检验鉴定要求[56-57]。因此SNPs多用作STRs检测的补充[55]。

5 SNPs数据库

SNPs公共数据库主要有美国的NCBI数据库(dbSNP)(Database of Single Nuleotide Polymor⁃phisms)[58]、欧洲SNP数据库(HGVbase)(Human Ge⁃nome Variation Database)[59]、美国麻省理工MIT数据库[60]和日本JST数据库（The Union of Japanese Sci⁃ence and Technology Corporation）[61]，这些数据库主要收集文献报道的SNPs的研究数据，均可以通过网站查询使用说明。然而既往关于中国SNPs的大部分研究，均存在检测样本量小或者SNPs位点少的短板，不能全面地反映中国人群基因组变异的情况，国际公共数据库中与中国人相关SNPs信息亦不全面，随着人类基因组单倍体型图（Haplotype map,Hapmap）计划网站的停用，主要的中国人群SNPs信息来源于NCBI数据库的千人基因组[62]，其中包括206名中国北京人和216名中国南方人群数据。然而这些样本的全基因组数据没有对纳入检测人群进行分层研究。新加坡科学家和中国安徽医科大学科学家合作通过地域分层，在全基因组范围设计350,000个SNPs位点，对8,200例汉族人群进行检测，发现南方汉族和北方汉族源于同一祖先然而存在3%的基因差异，丰富了中国人群基因组SNPs数据信息[63]。然而，对于某种疾病的中国不同地域的SNPs差异仍缺乏大样本系统的研究。

SNP是个体基因组中最常见的变异，除了作为遗传学分子标记物用于疾病和基因的关联研究寻找疾病相关基因，还在药物基因组学以及人类进化史方面也都有着很重要的意义。随着检测和分析技术的进一步发展，SNPs作为生物信息学研究的一个热点，将成为人类基因组研究计划走向实际应用的重要步骤。

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Single nucleotide polymorphism in the development of human genom ics

JIANGYi1,2,DAIPu1,HANDongyi1
1DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing 100853,China
2Departmentof ProvincialClinicalMedicine,Fujian ProvincialHospitalDepartmentofOtolaryngology, Fujian MedicalUniversity,Fuzhou 350001,China

HANDongyi Email:hdy301@263.net

Singlenucleotidepolymorphism(SNP)labeling comprises the third generation of geneticmarkers.Used in linkageand association analyses,ithasbeen applied in various fields in theareaofbiologicalorigin research,including evolution andmigration ofpopulation genetics,pathogenic ordisease related susceptiblegenes,individualized drug therapy.SNPsand related studieshavebecome the focusof the research aboutmolecularmarkers.With furtherdevelopmentof detection and analysis technologies,SNP research w ill acclerate progress of bioinformatics,and become an important step towardspracticalapplication of thehumangenomicsproject.

Singlenucleotidepolymorphism；Genomics；Linkageanalysis；Association analysis

R764

A

1672-2922（2017）02-239-6

2016-12-26审核人：袁永一）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.02.019

国家重点研发计划2016YFC1000700、2016YFC1000704；国家自然科学基金重点项目81230020；福建省卫生计生委医学创新课题项目编号2016-CX-5

蒋刈，在职博士，副主任医师，主要研究方向：耳科学及耳聋基因

韩东一，Email：hdy301@263.net