麻脱胶菌株选育的研究进展与前景

巩继贤，张秋亚，李育强，张春春，张健飞

（1.天津工业大学纺织学院，天津300387；

2.天津工业大学先进纺织复合材料教育部重点实验室，天津300387）

麻脱胶菌株选育的研究进展与前景

巩继贤1，2*，张秋亚1，2，李育强1，2，张春春1，2，张健飞1，2

（1.天津工业大学纺织学院，天津300387；

2.天津工业大学先进纺织复合材料教育部重点实验室，天津300387）

随着环境问题的日益凸显，麻纤维微生物脱胶技术凭借其污染小、能耗低而逐渐被人们重视，并不断应用于生产实践。菌种是生物脱胶过程中的关键因素，随着对其认识与研究不断深入，逐渐形成比较完备的麻生物脱胶用菌种选育技术，并在研究与实践的不断结合中达到了新的高度。文章主要针对麻脱胶菌株选育技术的研究现状进行了综述，并对未来的发展做了展望。

麻；脱胶；菌种选育

麻纤维在我国作为纺织纤维的应用有着悠久的历史。麻纤维因具有吸湿、透气、抗菌等优良性能，而受到人们的青睐。近年来，麻纤维作为一种重要的生物质纤维种类，又受到新的关注。麻纤维可以自然降解，其废弃物不会带来环境负荷。而且此类生物质纤维的应用还能有效缓解由对石油原料过度依赖而造成的能源危机。麻纤维可以利用山坡、荒滩等非基本农田进行种植，不存在与粮争地的问题。为加快麻纤维产业的发展，国家启动了“麻类产业技术体系”建设加以推动。

脱胶是制备韧皮纤维的首要环节。传统的化学脱胶加工存在能耗高、污染大、品质低的问题，严重影响了韧皮纤维产业的发展。随着以生物催化为中心的新型工业生物技术的发展，生物脱胶正逐渐成为韧皮纤维脱胶的发展方向。微生物菌种选育在麻纤维的生物脱胶中占有重要地位，是决定脱胶过程是否具有工业化价值和纤维质量高低的关键。

1 脱胶菌株的分离筛选

高效菌株是麻纤维生物脱胶的关键。目前生产用的优良菌株，大都是从自然界中分离到的。微生物在自然界的分别及其广泛，且不同环境条件下生长的微生物有着不同的代谢类型和独特的生理特性，因此自然界尤其是土壤是取之不尽的菌种宝库。自然环境下的微生物是混杂生长的，要得到理想菌株，就要将它们分离出来。环境微生物的分离一般要经过样品采集、富集培养、分离、筛选和鉴定等环节。在麻脱胶菌株的分离筛选研究中，样品的来源和脱胶菌株的筛选方法是两个关键步骤。

根据目标菌株的特点选择适当的采样环境是菌株分离筛选关键的第一步。麻田中的土壤是人们首先想到的适合分离麻脱胶菌的环境。近年来，仍有研究人员从麻类植物生长的土壤中进行采样，以筛选麻脱胶的高效菌株［1］。有观点认为，果胶是植物细胞间的“粘合剂”，麻的脱胶在某种程度上就是去除果胶质的过程。因此，从富含果胶质的植物及其周围环境中分离麻脱胶菌株，也是一种选择。董政娥［2］等从通过对腐败海草中的生物菌群进行富集培养，筛选出了能够进行生物脱胶的菌种。另外，在液体环境如生产用废水、污泥、发酵液［3］等环境中的生物菌群种类数量繁多，同样可以作为育种的出发点，进行生物脱胶用出发菌种的筛选。

筛选方法的设计是从环境微生物中得到高效脱胶菌株的另一个关键环节。在这一环节，培养基的设计是首先要解决的问题。很长一段时间内，通常认为果胶酶是麻生物脱胶的主要菌种。因此在许多研究中都将果胶作为碳源，用于富集培养、分离和筛选等各阶段［4］。有研究表明，半纤维素酶活对苎麻的脱胶也是非常重要的，于是半纤维素类物质也被用作碳源［5］。后来，人们认识到麻皮中胶质成分的复杂性，又有将麻皮粉碎后，以麻皮粉末的分散液作为培养基［6］。在筛选方法上，已有的研究也多用果胶酶的活性作为指标，比如用刚果红染料透明圈法、卢戈氏碘液法透明圈法、高碘酸透明圈法、十六烷基三甲基溴化铵法和钌红染色透明圈法等。

2 诱变育种

基因突变是微生物变异的主要形式。人工诱变［7－9］是加速基因突变的重要手段。以人工诱变为基础的诱变育种，具有速度快、收效大、方法简单等优点，是微生物菌种选育的重要途径。时至今日，诱变育种仍是麻脱胶微生物育种方面最重要，且最有效的技术。目前诱变育种主要采用物理诱变育种以及物理化学方法结合诱变育种方法。

物理诱变一般包括紫外诱变电离辐射、激光、微波、太空诱变、等离子诱变等［10－12］。而言目前应用较多的是紫外诱变法，紫外诱变具有变异率，操作简单，成本低的优点。卢必涛［13］等，从已经得到的高效脱胶菌株出发，以紫外线为诱变剂，通过对该菌株进行紫外灯照射处理的方式，对菌株分别紫外照射20 s，40 s和60 s，通过照射后的致死率的对比，最后选择了照射60 s的条件，采取该条件诱变后，获得了菌株的脱胶关键酶的活性相应提高的突变株。Molina［14］等在分析能够产生果胶酶的18株真菌的基础之上得到菌株Q176，并以此为出发菌株，以紫外线为诱变剂，通过对该菌株进行紫外灯照射处理的方式对菌株进行诱变，最后从390株变异体中选出39株进行性能的测定，诱变后的菌株相比诱变前的菌株果胶酶活提高了5倍。马伟超［15］等通过复合诱变（超声波处理40 min，紫外照射60 s，经过高通量筛选，得到4株高产菌，经传代培养后证明：C23－7、C23－9这2株菌遗传稳定，酶活分别可达705.7 U/ml和695.0 U/ml，分别比出发菌株（477.3 U/ml）提高了47.85%、45.61%，适合应用。

虽然紫外诱变整体而言应用较广泛，但从某些方面而言紫外线诱也存在有利变异少，工作量较大，具有一定的盲目性的缺点，所以对于紫外诱变同其他物理诱变方法结合起来应用是将来菌种选育中的发展方向之一。除此之外对于化学诱变而言也较为常用［16］，化学诱变方法是借助化学助剂对菌种的诱变作用来实现对菌种的选育，所述的化学助剂包括烷化剂如亚硝酸胍，碱基类物质如5－氟尿嘧啶（5－FU）等，无机化合物如氯化锂等，其他的还如盐酸羟胺等，目前化学诱变单独应用的比较少，往往与物理诱变辅助以化学诱变对微生物群体进行处理，以获得较高的致死率，从而使突变率提高，从而增加获得正向突变的概率。

李慧玲［17］等以产β－甘露聚糖酶的Bacillus subtilis WD23为出发菌株，利用紫外线诱变和甲基磺酸乙酯诱变的方法提高酶的活性，紫外线照射时间选为20～30 s，诱变后酶活提高了8.72%，1%的甲基磺酸乙酯诱变10 min，酶活提高了1.29%。解生权［18］等以紫外线诱变后得到的多脂鳞伞（Pholiota sdiposa）的菌种作为出发菌种，对其进行化学诱变剂处理。结果表明，采用亚硝酸钠终浓度3450 mg/l诱变10 min、亚硝酸钠终浓度6900 mg/l诱变5 min所得到的变异菌株菌丝生长速度、菌丝产量和栽培的生物转化率都有所提高。

3 杂交育种

除了诱变育种，以基因组为基础的杂交育种也是菌种选育的重要途径，其中原生质体融合［19－26］是实现杂交育种的重要技术形式。原生质体融合，将亲株细胞分别去除细胞壁后在高渗条件下辅以多种手段进行融合，经基因组间的交换重组，获得融合子的过程。此技术起源于20世纪60年代，其特点在于亲本细胞随机融合，有效地筛选具有亲本特性的优良融合菌株。

张惠玲［27］等通过在红枣上选育果胶酶PE组分含量低的果胶酶产生菌，并通过与高产菌进行细胞融合，获得产PE组分低，产PG、PL组分高的优良的果胶酶产生菌Rh－12菌株。随着生物技术的研究不断深入，原生质体融合技术的成功研发将传统意义上的微生物领域有关于微生物种间的界限被打破，此技术能够实现远缘菌株的基因重组，对于麻脱胶菌株选育而言，原生质体融合有其独特的优势，能够实现远缘菌种的基因重组，凭借这一优势越来越多有利与麻生物脱胶的性状将会不断的出现。

4 基因工程育种

基因工程，工具酶切割遗传物质，连接载体，导入受体细胞，使外源遗传物质进行正常复制和表达。随机性和盲目性小，可以完全突破物种间的障碍，进行定向变异和育种［28－40］。张懿翔［41］等为了提高菌种的产果胶酶的能力，进而取得较好的亚麻脱胶效果，利用基因工程的方法，将vgb基因整合到Bacillus subtilis A5染色体上，得到了能够正确表达血红蛋白菌株Bacillus subtilis A5－vbg（＋），通过对脱胶前后结晶度以及电镜的测试，测定脱胶效果，结果表明此菌种对亚麻的脱胶效率有提升。陈涛［42］等利用木糖采用进化工程的方法，发现了有利于枯草芽孢杆菌利用木糖生长的基因突变，并获得了能够利用木糖快速生长的枯草芽孢杆菌。

随着生物工程技术的逐渐发展，基因工程的方法在一些微生物育种领域以及某些代谢产物生产领域被广泛的应用，虽然基因工程的方法具有随机性及盲目性的特点，但是在微生物育种利于依然存在着选育菌种稳定性差的问题，所以基因工程方法与其他育种方法的结合运用是目前对基因工程技术在麻生物脱胶育种方面应用的发展方向之一。随着基因工程技术的发展，该技术用于麻脱胶菌种选育和遗传改良所带了基因多样性的优势定会显现出来。

5 进化工程育种

进化工程育种技术［43－47］，是对出发菌种进行基因多样化处理，并对处理后的生物菌群从扩大底物利用范围、提高产品的生产能力、提高微生物的环境耐受性等方面进行选择压力下培养，此过程模拟自然选择进程，经过多代时的培养，使发生定向突变的优势菌群得以保留。在麻脱胶菌种选育中应用较多的是产酶能力高以及耐碱菌株的选育。经过诱变的出发菌种，选择压力培养基的控制可以根据目标菌种的优势性状来确定，如欲得到麻韧皮脱胶效果较好的菌株，可以将选择压力设定为以果胶、木聚糖、麻粉或者麻皮为唯一碳源的液体培养基，进行多次传代培养，使具有多样基因型的诱变菌种在这样的选择压力以及相互竞争环境下优势群体逐渐增长，并经过最后的酶活筛选法选育出最终的目标菌体；而对于耐受性表现型菌种的筛选，可以选择相应耐受型的选择压力，如耐高温型、耐碱型性状的筛选，将基因多样化的诱变菌群在高温或者强碱的选择压力下进行多代时的培养，最后经过耐受性筛选选择出最终的目标菌体。郑权莉［48］等通过对枯草芽孢杆菌进行的进化工程选育，获得一株在较强碱环境（pH9.8）中具有脱胶作用的进化株B2，将菌株培养液以10%的接种量接种于灭菌后的碱性脱胶培养基中，于37℃，140 r/min条件下振荡培养24 h，可使麻皮中的胶质含量分别降至15%，脱胶效果明显提升。

传统诱变育种与进化工程育种技术各有优势，传统诱变侧重于个体表现型与选择压力的相符性，目标明确、操作简单，但缺点在于目标菌种的稳定性较差；进化工程育种技术则侧重于在选择压力下目标菌种的群体进化，在培养的同时不但体现了选择压力环境下对菌种的选择，也反映出在选择压力下群体中微生物之间的竞争关系，在相应的选择压力以及菌群中微生物之间的相互竞争作用下，能够适应环境的菌群优势不断被选择出来，在经过多代的传代培养之后，通过高通量筛选，即当菌群全部成为适应性菌株时，反应器中菌体生长速度大幅增加时，即得到目标菌种。目前传统诱变育种技术与进化工程育种技术不断发展，对两种技术的同时应用不但可以降低对特定菌种选择的时间，同时也可以使目的菌种的稳定性大大提高。

6 结论与展望

随着脱胶用菌种的初筛、诱变、选择等方面研究不断深入，麻纤维生物脱胶技术中的育种技术在菌种选育的多个环节中，菌种初筛方法选择、出发菌种的种类变得更加广泛；同时菌种诱变方法的选择从原来的单一诱变方法向多种诱变方法共同作用的方向发展，同时新技术的应用也越来越多，如基因重排技术的应用，能够高效的构建目标基因，大大地提高了基因多样化的效率；在变异菌种的选择上，也有更多微生物领域的新思想的实践与运用，如进化工程育种技术，侧重于在选择压力环境施加的同时去模拟环境压力下个体之间的竞争关系，又如对于传统平板筛选的改进方法：自控微量平板筛选法的应用，对变异菌种的筛选提高到一个新的高度。

基于其他学科的发展起来的太赫兹时域光谱技术，也已经开始运用于微生物领域，而这些新方法的应用也将推动菌种选育技术的进一步发展。新技术的应用也大大提高的麻生物脱胶菌种选育的效率，就目前的研究而言，新技术的应用较单一，在一定程度上不利于新技术的深入应用与学科的多向发展，目前麻生物脱胶还存在着一些局限性，菌种的单独脱胶效率相对较低，高效率菌种的选育还需继续进行。

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Research Progress and Prospect of Strain Breeding for Bast Fiber Bio－degumm ing

GONG Jixian1，2*，ZHANG Qiuya1，2，LIYuqiang1，2，ZHANG Chunchun1，2，ZHANG Jianfei1，2
（1.School of Textile，Tianjin Polytechnic University，Tianjin，300387，China；2 Key Laboratory of Advanced Textile Composites，Ministry of Education of China，Tianjin 300160，China）

As the growing environmental pollution problem in the textile industrial，the technology of bio－degumming attractedmore andmore attention and was applied in production for its low pollution and low energy consumption.An efficient strain is the key factor in the bio－degumming process..With the deep research of the strain breeding and its application into industrial production，the technology of breeding strain has been improved greatly for a higher degree.This paper reviewed the recent progress of the strain breeding technology for the bast fiber bio－degumming，and it discussed the prospect for its development.

bast fibers；degumming；strain breeding

S563

：A

1671－3532（2017）01－0050－05

2016－09－13

国家重点研发计划（2016YFC0400503－02）；新疆自治区重大专项（2016A03006）

巩继贤（1975－），男，副教授，博士，研究方向：主要从事清洁染整技术研究；E－mail：gongjixian＠126.com