组织芯片技术在消化道肿瘤研究中的应用

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(南华大学附属第二医院消化内科，湖南 衡阳 421001)

·小专论·

组织芯片技术在消化道肿瘤研究中的应用

付实，张琍*

(南华大学附属第二医院消化内科，湖南 衡阳 421001)

组织芯片是一种高密度的组织微点阵，它能高度集中多种不同类型的组织标本，从而一次性完成大样本指标筛选工作。相比于传统的石蜡切片，组织芯片有着更高的效率，在肿瘤学研究中得到广泛的应用。本文根据国内外研究成果，就组织芯片技术的概念、分类及其在消化道肿瘤研究中的应用进展等方面予以综述。

组织芯片技术； 生物芯片； 消化道肿瘤

生物芯片技术起源于核酸杂交理论，随着20世纪90年代的人类基因组计划和分子生物等相关学科的进展，生物芯片技术也得到了迅猛的发展。它将大量生物医学检测相关的材料整齐有序的集成在玻片等固像载体上而形成的可与目的靶分子互相作用、并行反应的固相表面。根据固定在载体上的物质成分可分为基因芯片、组织芯片、蛋白质芯片等，这些高通量的筛选技术从根本上改变了生物医学的研究。组织芯片自提出以来，以其高通量、平行性、节省性等优点迅速引起了广大关注，它可以研究特定基因及其表达产物与疾病的相关性,在肿瘤分子病理研究上极具潜力和价值，它已成为解剖病理学家在肿瘤研究中最具前途的工具之一。

1 组织芯片的概念及分类

组织芯片也称组织微阵列(tissue microarray,TMA),它的物质成分为标本组织，研究者可通过免疫组化、荧光原位杂交、原位PCR等方法，对组织中特异性的靶点进行高通量的分析。它可以同时在DNA、RNA及蛋白水平上对大量标本进行检测分析，TMA可以通过成百上千的标本对某一特定的基因进行分析，这与基因芯片有所区别,基因芯片一般是从单一的组织或者细胞系中对成百上千的基因进行分析[1]。

按照TMA样本含量的大小可分为低密度芯片(小于200个点)，中密度芯片(200～600个点)，高密度芯片(大于600个点)。按照组织来源分为人类、动物、植物三大类芯片，而人类组织芯片又可分为正常组织芯片、疾病组织芯片、胚胎组织芯片。人类肿瘤组织芯片属于人类疾病组织芯片中的一种。肿瘤组织芯片又可分为多肿瘤组织芯片、肿瘤进展(演进)芯片和预后组织芯片。多肿瘤芯片是包含多种肿瘤类型的芯片，可以用它来筛选出不同肿瘤类型中的分子差异，肿瘤进展(演进)芯片可以研究某一特定肿瘤不同阶段的分子改变，预后芯片包含可用的临床随访资料的肿瘤样本，可以用其检测肿瘤预后分子的变化，从而了解该因子与肿瘤预后的关系。

2 组织芯片技术在消化道肿瘤中的应用

从目前国内外的资料来看，组织芯片在肿瘤研究中得到广泛的应用，包括对前列腺癌、阴茎癌、平滑肌肉瘤等[2-4]。在肿瘤中的应用主要是肿瘤标记物的筛选、肿瘤中免疫表型的相关研究、肿瘤病因学、与基因芯片联合检测[5]。

2.1肝癌肝癌是少数几种可以直接由病毒诱发的肿瘤之一，目前乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)是肝癌的首要诱因。组织芯片联合基因芯片技术可以更好的来研究肝癌与HBV之间的联系。Ma等[6]注意到羧酸末端截断的HBX(HBV的产物)时常在肝癌中出现，羧基末端截断型HBx即3’端的X基因的缺失的HBx，完整的HBx包含HBx-Ab1和HBx-Ab2，而截断型HBx只能由HBx-Ab1来认定，为了验证羧基末端截断型HBx在肝癌中起关键作用，Ma团队利用组织芯片联合基因芯片技术对肝癌中的HBx进行了检测，组织芯片结果显示羧基末端截断型HBx在HCC有79.3%的表达。基因芯片结果显示HepG2-X1(与截断型HBx有关)具有促进增殖、抗凋亡的效果，最后得出羧基截断的HBx蛋白在肝癌的发生中起着重要的作用的结论。Ma等分别用PCR、RNA印记杂交对组织芯片、基因芯片的结果进行了验证，结果证明了组织芯片及基因芯片的可靠性。组织芯片还可以研究罕见的肝癌类型，Riehle等[7]利用包含正常肝组织，肝癌、肝纤维板层型癌，胆管癌、肝局灶性结节性增生等组织的组织芯片进行实验，结果发现mTORC1和FGFR1与纤维板层肝细胞癌的发生密切相关。

2.2胃癌胃癌是中国排名第三的癌症死亡原因，每年约有70余万人死于胃癌[8]。胃癌的发生通常与多种环境因素及遗传因素有关。研究胃癌的发生、发展机制对胃癌的诊治起到至关重要的作用。吴勇军，等[9]用含152例胃癌、上皮内瘤变48例及正常胃粘膜60例构成的进展组织芯片来验证胃癌中Cofilin1表达及其意义，结果表明Cofilin1在正常胃黏膜组织、上皮内瘤变组织、胃癌中表达分别为36.67%、66.67%、78.95%，它与胃癌肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、临床分期密切相关，且与胃癌进展及预后密切相关，它们可能是胃癌侵袭转移重要的生物标记物。

胃癌的分子靶向治疗逐渐走向临床应用，曲妥珠单抗是针对Her2因子原癌基因产物的单克隆抗体，与Her2结合后可间接发挥抗肿瘤作用，现已应用于乳腺癌中Her2表达阳性的患者。为了验证Her2在胃癌中表达，Grabsch等[10]构建了含高密度的胃癌标本(单位面积中肿瘤含量大于50%)、低密度的胃癌标本(单位面积中肿瘤含量小于50%)的组织芯片，并用非肿瘤性胃粘膜标本作为对照，结果表明Her2在非肿瘤胃粘膜表达阴性，且只在肠型胃癌的一小部分亚型中表达，Her2在胃癌中的表达存在明显的异质性，故今后对于有相同的形态学表型而有不同的分子表型的胃癌患者可能需要不同的治疗策略，此研究为曲妥珠单抗治疗Her2阳性胃癌提供了依据。

2.3食管癌食管癌的发病率虽没有胃癌高，但5年生存率仍较低。值得庆幸的是近年来食管癌患者5年生存率逐年提高[11]。组织芯片在食管癌中也同样应用广泛，可以检测食管癌B7-H1可以作为其预后因子[12]、食管癌中存在上皮—间充质转化等[13]。组织芯片技术是可靠的，Li等[14]用组织芯片采用RNA原位杂交的方法研究miR-375在食管癌及正常食管粘膜之间的联系及临床意义，同时他的团队为了验证组织芯片所得结果的可信度，又利用qRT-PCR的方法进行了验证，结果跟RNA原位杂交的基本一致。这些都证明了组织芯片在食管癌检测中的实用性及可靠性。

2.4大肠癌大肠癌最容易发生肝转移，可以用组织芯片研究大肠癌转移瘤的情况，Katz等[15]利用188例直肠癌肝转移术后患者的标本及预后信息制作了预后组织芯片，用来研究肿瘤浸润淋巴细胞(CD3、CD4、CD8及调节性T细胞)计数与患者预后的关系，结果显示含有大量调节性T细胞的患者预后差，这可能与免疫抑制有关，而肿瘤的免疫反应可以作为大肠癌肝转移患者预后的一个独立指标。组织芯片还可以与其他技术联合运用，来筛选与大肠癌相关的肿瘤标志物，Kume等[16]做了迄今为止规模最大的生物标志物膜蛋白验证研究，首先对来源于大肠癌及息肉中的5566种蛋白进行筛选，利用去细胞成分分析、TMHMM算法、质谱选择反应(多反应)检测技术等多项方法，筛选出ITGA5、GPRC5A、PDGFRB、TFRC等这些已经证实与大肠癌相关的蛋白，同时也筛选出C8orf55这个功能尚不明确蛋白，Kume团队又利用包含14种常见肿瘤及13种正常组织做成的组织芯片了解该蛋白在不同组织表达情况，结果显示C8orf55在结肠癌中相比正常结肠组织有更高的表达，C8orf55可能是结肠癌的生物标志物。

2.5胰腺癌相比大肠癌，胰腺癌预后差，病死率高，具有“难发现、易转移、难治疗”这三大特点，有“癌中之王”之称，所以做到早发现、早诊断至关重要。Wen等[17]首先利用人胰腺癌组织芯片对Oct4和NanogOct4进行检测，结果显示Oct4和NanogOct4均在化生管中有强表达，随后又用金黄地鼠胰腺癌模型进行了验证，分别于第15、19、24周处死地鼠获得相应组织进行实验，结果显示第15周可检测到化生管，第24周的组织出现胰导管内癌，而化生管中Oct4强表达(因没有免疫反应性，地鼠组织中NanogOct4无法评价)，在肿瘤的早期出现上述因子，考虑Oct4、NanogOct4可能与胰腺癌的早期发生密切相关。筛选与预后相关的标志物也很重要，能为靶向治疗提供依据。Winter等[18]利用预后组织芯片将多个肿瘤标志物进行对比，结果表明，相比其他标志物，MUC1、间皮素能更好的了解胰腺癌预后。miRNA是内源性非编码RNA分子，与胰腺癌的诊断、治疗效果、预后密切相关。杨珂[19]就采用原位杂交、免疫组化的方法检测106例胰腺癌组织芯片中miR-150及其靶蛋白c-Myb、MUC4在胰腺癌中的表达情况，得出miR-150及其靶蛋白与胰腺癌预后相关的结论。

3 TMA的缺点

组织芯片优点众多，同时它也有自身的不足。例如因为肿瘤的异质性，所取样本并不一定能代表肿瘤组织，制备的过程需要专业的人员和设备，制作成本较大，存在抗原变化等问题[20]。同时也存在组织芯片的制作尚不能自动化，标本脱片、移位及相应的读片及信息处理系统不完备等问题。

4 应用前景

组织芯片以其高通量、节省性等优点在肿瘤中的应用非常广泛，使得分子病理学的研究取得了重大发展。它仍有许多潜在的应用，当前组织芯片绝大多数都应用于肿瘤研究，相信以后也可更多的应用于炎症、心血管系统、神经系统等非肿瘤疾病方向。组织芯片还可运用于转基因的动物，以研究特定基因表达，为疾病的靶向治疗提供依据。未来的组织芯片所包含的样本可以更大，将有利于疾病的大数据研究。虽然组织芯片实现了小型化，但读片与大数据的分析仍需要耗费大量时间，相信以后随着与之配套的读片与分析仪器设备的出现，其必将发挥更大的效能和作用。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.019

2016-07-14；

2017-01-16

国家自然科学基金资助项目(No.81372378)

*通讯作者，E-mail:hyzhanglig@163.com.

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