血小板中NADPH氧化酶的研究进展

罗冬娇 傅圆圆 黄灵芳

血小板中NADPH氧化酶的研究进展

罗冬娇 傅圆圆 黄灵芳

血小板异常活化导致的病理性血栓形成和栓塞是心脑血管疾病发生的主要原因。氧化应激是重要的活化机制之一，调控还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶，NOX）源性活性氧（ROS）的产生将是防治心血管疾病的新策略。本文对血小板NOX特点、ROS活化血小板的机制及与血小板NOX相关的临床和药物研究进展进行综述。

血小板 NADPH氧化酶 活性氧 综述

血小板由骨髓巨核细胞胞质脱落形成，当血管内皮损伤时，血小板活化和聚集形成止血血栓防止血液流失及保持血管壁完整性，但当其功能亢进或异常活化时，易致病理性血栓形成和栓塞发生，后者是心肌梗死和脑卒中等心脑血管疾病发生的主要原因[1]。活性氧（ROS）引起的氧化应激是诱导血小板活化的重要机制，尤其是调控还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶，NOX）来源的ROS，如超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（-OH）和氢过氧化物（HOO-）等[2]。本文对血小板中NOX种类及特点、ROS活化血小板的机制及与血小板NOX相关的临床疾病和药物研究进展等作一综述，现报道如下。

1 血小板中NOX的种类和功能

NOX最初在吞噬细胞中被发现，其激活产生的细胞外超氧化物是微生物感染时宿主防御反应的基础[3]。NOX复合物的组成和活化需要胞膜催化亚基gp91phox（又名NOX2）与gp22phox亚基形成异二聚体，以及胞质亚基p47phox，p67phox，p40phox和小分子GTPases结合蛋白Rac易位至膜上才能完成，后续在非吞噬细胞中发现NOX2的多个同源物，包括NOX1、NOX3、NOX4、NOX5和双氧化酶Duox（Duox1和Duox2），共同构成了NOX家族[3,4]。其中NOX2是血小板中最主要的亚型，在遗传性慢性肉芽肿病（CGD）患者，血小板O2－产生几乎被完全抑制，凝血酶、胶原和花生四烯酸诱导的血小板CD40配体（CD40L）表达和聚集显著减少[5]。与此同时，血小板中相应鉴定出催化亚基gp91phox和p22phox及胞质亚基p47phox的存在，以及NOX2复合物的激活也需要p47phox、p67phox和Rac分子的作用。NOX2敲除小鼠血小板表现为胶原相关肽和凝血酶诱导的ROS产生均减少，体内激光诱导动脉血栓形成受损，但不影响生理性止血功能[6]。近来研究显示血小板也表达NOX1和NOX4亚型，McCrann等[7]在小鼠骨髓和巨核细胞中发现Nox1 mRNA和蛋白的表达，而NOX1敲除小鼠则显示凝血酶和血栓烷A2类似物（U46619）诱导的血小板ROS生成减少和活化受损，但不影响胶原诱导的ROS生成，表明NOX1在血小板激活和血栓形成中的作用不同于NOX2，对NOX4的功能研究目前还未深入。

2 ROS促进血小板活化的作用机制

ROS参与血小板的活化调节，一方面，血管壁ROS的释放通过一氧化氮（NO）的清除，降低血管内皮细胞的抗血小板性能；另一方面，在常见的胶原或凝血酶等刺激下，血小板自身产生ROS，如O2－和H2O2等，作为第二信使通过钙动员，减少NO的利用度或灭活NO，花生四烯酸非酶氧化途径形成异前列腺素，以及促进氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）生成等途径促进血小板聚集和血栓形成。

2.1 H2O2的形成和作用 O2－在超氧化物歧化酶（SOD）作用下转化成化学性质稳定的H2O2。胶原诱导的血小板聚集与H2O2的爆发相关，通过H2O2促进血小板膜上花生四烯酸释放，血栓烷A2（TXA2）和磷脂酶C上调，胞内钙离子动员增加，从而增强血小板活化。衰老相关小鼠血小板活化中，H2O2和整合素αIIbβ3活化增加相关，光化学损伤颈动脉后，稳定血栓形成时间明显缩短，而过表达谷胱甘肽过氧化物酶-1（Gpx1）小鼠则没有上述表现。此外，老龄化小鼠血小板显示p47phox和SOD表达增加，NOX抑制剂聚乙二醇或夹竹桃麻素（apocynin）能抑制αIIbβ3活化[8]。谷胱甘肽过氧化物酶-3（Gpx3）敲除小鼠则显示出血时间缩短，二磷酸腺苷（ADP）刺激下血小板聚集反应增强，体内血小板活化增强和血栓形成。此外，Gpx3敲除小鼠更易发生脑梗死与脑卒中，这些发现与Gpx3缺陷患者易患动脉血栓和中风的研究结果相一致。

2.2 对NO的影响 血小板活化受内皮细胞和血小板来源的NO和前列环素（PGI2）严格调控[9]。NO能抑制血小板黏附、分泌和聚集，涉及的机制包括NO/环磷酸鸟苷/蛋白激酶 G/蛋白激酶 A（NO/cGMP/PKG/PKA）途径及蛋白质亚硝基化和硝化反应。O2-作为第二信使能干扰NO活性或生物合成，并和NO结合形成过氧化亚硝酸盐，以及与氨基酸如酪氨酸产生酚环反应影响血小板功能。鸟苷酸环化酶（GC）基因敲除显示NO-GC是血小板NO主要受体，表明NO对血小板功能的抑制作用[10]。CGD患者血小板O2-产生显著受抑制与NO升高相关，也证实NOX2在降低NO活性中的作用。

2.3 花生四烯酸非酶氧化途径形成异前列腺素 ROS能促进花生四烯酸非酶超氧化途径产生F2-异前列腺素，尤其是8-异前列腺素F2a（8-iso-PGF2a）的形成，以及环氧酶（COX-1）活化产物TXA2的增多[11]。gp91phox基因缺陷患者血小板TXA2形成正常但8-iso-PGF2a显著减少，血小板招募受损。使用NOX2特异性抑制剂 gp91ds-tat，F2-异前列腺素产生明显受抑制，同时1 500s－1剪切力血流灌注条件下，血栓形成也明显减少，表明NOX2在8-iso-PGF2a形成中起主要作用[12]。此外，CGD患者和携带者体内血小板活化标志物血浆sCD40L水平和可溶性P-选择素减少，异前列腺素表达下调和NO生成增强，而肥胖患者则呈现高水平血浆sCD40L和P-选择素，同时NOX2和异前列腺素表达上调，表明体内血小板NOX2调节程度、异前列腺素形成与活化之间关系紧密。

2.4 促进氧化型低密度脂蛋白的生成 NOX2来源的氧化应激促进ox-LDL生成，ox-LDL通过凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）增强血小板活化[13]。gp91phox缺陷患者血小板产生少量的ROS和LDL弱修饰，而高胆固醇血症患者显示ox-LDL和ROS生成增强，表明血小板通过NOX2介导的氧化应激修饰LDL。使用NOX2抑制剂gp91ds-tat或小鼠血小板NOX2敲除，ox-LDL诱导的血小板ROS产生和活化均被抑制。Magwenzi等[14]认为ox-LDL的作用机制涉及其与CD36分子结合，激活酪氨酸激酶和蛋白激酶C（PKC）依赖的NOX2活化途径，从而削弱cGMP对血小板聚集的抑制作用。

3 与血小板NOX相关的临床研究

NOX与血小板活化相互作用的体内研究比较少，临床研究包括经皮冠状动脉介入治疗（PCI），动脉粥样硬化高风险因素如2型糖尿病，肥胖症，心房颤动（AF），非酒精性脂肪肝（NAFLD），人类免疫缺陷病毒（HIV-1）感染和肺炎等，这些疾病都与细胞及全身性氧化应激相关[11,15-17]。

3.1 经皮冠状动脉介入治疗 PCI以复杂的缺血/再灌注过程和ROS爆发为特征。尽管阿司匹林抗血小板治疗，患者仍显示血小板血栓烷B2（TXB2）产生增加，同时血清NOX2增高，表明NOX2表达和COX1过度活化之间存在潜在关系。静脉输注抗坏血酸抑制ROS活性，发现NOX2下调及TXB2生成减少，说明NOX2在PCI术后TXB2过度产生中发挥作用[18]。

3.2 2型糖尿病 2型糖尿病患者存在动脉粥样硬化加速和血小板活化现象，血小板活化标记物可溶性CD40L和P-选择素及TXB2尿排泄增加[19]。患者显示血小板氧化应激增强和异前列腺素形成增加，并与NOX2活性调节有着显著的相关性，提示NOX2在促进血小板异前列腺素过度产生和活化中的作用。阿司匹林治疗时，氧化应激介导的血小板异前列腺素过度产生能削弱阿司匹林对TXA2的抑制作用，而增强血小板招募。如除阿司匹林外再给予他汀类药物，如加服阿托伐他汀则能够下调NOX2和异前列腺素形成，继而降低血小板活化[20]。

3.3 肥胖和高胆固醇血症 代谢综合征患者存在血小板TXB2过度产生和氧化应激增强现象，如8-iso-PGF2α尿排泄增加。低热量饮食减轻体重后，血小板TXB2和异前列腺素形成均减少，NOX2来源的氧化应激下调，血管内皮功能得以改善[21]。

3.4 AF和非酒精性脂肪肝 经历过AF的患者NOX2和异前列腺素的基线值与未经历者相比差异显著，表明在AF发生过程中NOX2来源的ROS发挥重要作用，因此NOX2和异前列腺素水平可以预测AF患者心血管事件发生的风险。此外，从单纯的脂肪肝到脂肪性肝炎的进展中，氧化应激的作用导致细胞死亡、炎症和肝纤维化的发展，NAFLD患者NOX2血清水平与肝细胞损伤标志物血清细胞角蛋白-18密切相关[22]。

3.5 感染 血小板膜表面具有病毒和细菌特定的受体，通过与相应配体的作用导致血小板活化。对HIV-1感染和肺炎患者的研究表明NOX2和血小板活化相关。HIV-1感染者血清sCD40L水平升高，血小板sNOX2-dp和8-iso-PGF2α显著增加，感染与血小板氧化应激增加及NOX2激活相关，阿巴卡韦（abacavir）治疗能减少血小板sNOX2-dp和8-iso-PGF2α产生[23]。肺炎患者血清心肌肌钙蛋白T升高，心肌损伤与NOX2上调之间存在显著相关性，发生心肌梗死的肺炎患者血浆可溶性P-选择素、sCD40L与TXB2基线水平明显增高，表明NOX2来源的氧化应激参与了急性期肺炎的心肌损伤。

4 以血小板NOX为靶点的药物研究

药物抑制血小板NOX研究主要包括非特异性抑制剂如他汀类和多酚及特异性抑制剂如夹竹桃麻素等。

4.1 他汀类药物 属于3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，阿托伐他汀和瑞舒伐他汀体内外药理研究表明其抗血小板与抗氧化应激作用机制涉及NOX2表达下调。高胆固醇患者服用阿托伐他汀2h后即显示血小板NOX2和异前列腺素下调及血小板聚集受到抑制，体外研究显示其抑制NOX2和PLA2的激活呈剂量依赖关系，异前列腺素和TXA2的形成及血小板招募均减少，同时NO生成增加，瑞舒伐他汀在体内外的作用结果与前者类似[24]。他汀类药物抑制血小板NOX2来源的氧化应激以及增强NO生成等表现与其在内皮细胞中的作用相似。

4.2 多酚类 槲皮素和儿茶素在体外以协同方式抑制PKC依赖的NOX2活化和ROS生成，减少血管损伤处血小板的招募和αIIbβ3表达，同时增强NO作用[25]。富含多酚的营养物，如葡萄酒和可可的体内研究进一步证实这种作用，服用富含茶多酚的黑巧克力2h后，血小板活化即明显受到抑制，同时NOX2来源的ROS生成减少，异前列腺素产生受到抑制及NO产生/利用度增加。因此，黑巧克力依赖其多酚含量可降低吸烟者的氧化应激反应。此外，服用较高多酚含量的红葡萄酒后，多酚混合物能抑制LDL氧化和NOX2活化，8-iso-PGF2a也显著下降。

4.3 夹竹桃麻素 又名罗布麻宁，为天然化合物，体外研究表明夹竹桃麻素能抑制p47phox易位，干扰NOX2活化从而抑制血小板活化[26]。尤其是夹竹桃麻素抑制刺激剂诱导的血小板ROS形成，降低异前列腺素产生，显著减少血小板招募。这些作用也在动物模型中得到了进一步验证，易患动脉粥样硬化小鼠喂服夹竹桃麻素后，血小板活化受到抑制，P-选择素表达和血小板黏附均减少。而另一抑制剂山奈酚（Kaempferol），则通过直接结合p47phox，抑制胶原诱导的p47phox丝氨酸磷酸化和NOX2 活化[27]。

5 小结和展望

迄今为止的研究表明,ROS在血小板活化功能中涉及多种机制，临床研究与NOX抑制剂的作用研究证实血小板NOX2所起的关键作用。但是尽管NOX2缺陷，CGD患者仍有少量ROS产生，提示血小板可能表达NOX其他亚型的作用[5]。未来针对NOX降低氧化应激相关的血小板活化将是抗血栓形成的策略之一，但同时必须注意细胞吞噬细菌的能力是否受到影响。此外，尚有研究表明,NOX2缺陷的女性携带者表现全身氧化应激和动脉粥样硬化均减少的同时，机会性感染也减少[28]。由此，我们推测NOX活性适当的抑制，将有可能使动脉粥样硬化疾病高风险患者避免遭受严重并发症的发生。此外，还需要进一步研究血小板其他NOX亚型的功能。

[1]Otsuka F,Yasuda S,Noguchi T,et al.Pathology of coronary atherosclerosis and thrombosis[J].Cardiovasc Diagn Ther,2016,6(4):396-408.doi:10.21037/cdt.2016.06.01.

[2]Chen Q,Wang Q,Zhu J,et al.Reactive Oxygen Species:Key regulators in vascular health and diseases[J].Br J Pharmacol,2017.doi:10.1111/bph.13828.

[3]Babior B M,Lambeth J D,Nauseef W.The neutrophilNADPH oxidase[J].Arch Biochem Biophys,2002,397(2):342-344.

[4]Panday A,Sahoo M K,Osorio D,et al.NADPH oxidases:an overview from structure to innate immunity-associated pathologies[J].Cell Mol Immunol,2015,12(1):5-23.doi:10.1038/cmi.2014.89.

[5]Violi F,Carnevale R,Loffredo L,et al.NADPH Oxidase-2 and atherothrombosis:insight from chronic granulomatous disease[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2017,37(2):218-225.doi:10.1161/ATVBAHA.116.308351.

[6]Delaney M K,Kim K,Estevez B,et al.Differential roles of the NADPH-Oxidase 1 and 2 in platelet activation and thrombosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2016,36(5):846-854.doi:10.1161/ATVBAHA.116.307308.

[7]McCrann D J,Eliades A,Makitalo M,et al.Differential expression of NADPH oxidases in megakaryocytes and their role in polyploidy[J].Blood,2009,114(6):1243-1249.doi:10.1182/blood-2008-12-195883.

[8]Dayal S,Wilson K M,Motto D G,et al.Hydrogen peroxide promotes aging-related platelet hyperactivation and thrombosis[J].Circulation,2013,127(12):1308-1316.doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.112.000966.

[9]Kumar S,Singh R K,BhardwajTR.Therapeutic role of nitric oxide as emerging molecule.Biomed Pharmacother,2017,85:182-201.doi:10.1016/j.biopha.2016.11.125.

[10]Dangel O,Mergia E,Karlisch K,et al.Nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase is the only nitric oxide receptor mediating platelet inhibition[J].J Thromb Haemost,2010,8(6):1343-1352.doi:10.1111/j.1538-7836.2010.03806.x.

[11]Pastori D,Pignatelli P,Carnevale R,et al.Nox-2 up-regulation and platelet activation:Novel insights[J].Prostaglandins Other Lipid Mediat,2015,120:50-55.doi:10.1016/j.prostaglandins.2015.03.010.

[12]Pignatelli P,Carnevale R,Di Santo S,et al.Inherited human gp91phox deficiency is associated with impaired isoprostane formation and platelet dysfunction[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(2):423-434.doi:10.1161/ATVBAHA.110.217885.[13]Carnevale R,Bartimoccia S,Nocella C,et al.LDL oxidation by platelets propagates plateletactivation via an oxidative stress-mediated mechanism[J].Atherosclerosis,2014,237(1):108-116.doi:10.1016/j.atherosclerosis.2014.08.041.

[14]MagwenziS,Woodward C,Wraith K S,et al.Oxidized LDL activates blood platelets through CD36/NOX2-mediated inhibition ofthe cGMP/protein kinase G signaling cascade[J].Blood,2015,125(17):2693-2703.doi:10.1182/blood-2014-05-574491.

[15]Pignatelli P,Pastori D,Carnevale R,et al.Serum NOX2 and urinary isoprostanes predict vascular events in patients with atrial fibrillation[J].Thromb Haemost,2015,113(3):617-624.doi:10.1160/TH14-07-0571.

[16]DelBen M,PolimeniL,Carnevale R,et al.NOX2-generated oxidative stress is associated with severity of ultrasound liver steatosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease[J].BMC Gastroenterol,2014,14:81.doi:10.1186/1471-230X-14-81.

[17]Cangemi R,Calvieri C,Bucci T,et al.Is NOX2 upregulation implicated in myocardial injury in patients with pneumonia?[J]Antioxid Redox Signal,2014,20(18):2949-2954.doi:10.1089/ars.2013.5766.

[18]Basili S,Pignatelli P,Tanzilli G,et al.Anoxia-reoxygenation enhances platelet thromboxane A2 production via reactive oxygen species-generated NOX2:effect in patients undergoing elective percutaneous coronary intervention[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol2011,31(8):1766-1771.doi:10.1161/ATVBAHA.111.227959.

[19]Cangemi R,Pignatelli P,Carnevale R,et al.Platelet isoprostane overproduction in diabetic patients treated with aspirin[J].Diabetes,2012,61(6):1626-1632.doi:10.2337/db11-1243.

[20]Carnevale R,Iuliano L,Nocella C,et al.Relationship between platelet and urinary 8-Iso-PGF2alpha levels in subjects with different degrees ofNOX2 regulation[J].J Am Heart Assoc,2013,2(3):e000198.doi:10.1161/JAHA.113.000198.

[21]Loffredo L,Martino F,Carnevale R,et al.Obesity and hypercholesterolemia are associated with NOX2 generated oxidative stress and arterial dysfunction[J].J Pediatr,2012,161(6):1004-1009.doi:10.1016/j.jpeds.2012.05.042.

[22]Del Ben M,Polimeni L,Baratta F,et al.Serum cytokeratin-18 is associated with NOX2-generated oxidative stress in patients with nonalcoholic fatty liver[J].Int J Hepatol,2014,2014:784985.doi:10.1155/2014/784985.

[23]Pastori D,Esposito A,Carnevale R,et,al.Short-term in vivo modifications of platelet NADPH oxidase 2(NOX2)and prostaglandin F2α in HIV-1 patients on abacavir-based therapies.HIVMed.2016,17(10):774-777.doi:10.1111/hiv.12383.

[24]Pignatelli P,Carnevale R,Pastori D,et al.Immediate antioxidant and antiplatelet effect of atorvastatin via inhibition of Nox2[J].Circulation,2012,126(1):92-103.doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.112.095554.

[25]Faggio C,Sureda A,Morabito S,et al.Flavonoids and platelet aggregation:A brief review.Eur J Pharmacol,2017,807:91-101.doi:10.1016/j.ejphar.2017.04.009.

[26]Qin F,Simeone M,PatelR.Inhibition of NADPH oxidase reduces myocardial oxidative stress and apoptosis and improves cardiac function in heart failure after myocardial infarction[J].Free Radic BiolMed,2007,43(2):271-281.

[27]Wang S B,Jang J Y,Chae Y H,et al.Kaempferol suppresses collagen-induced platelet activation by inhibiting NADPH oxidase and protecting SHP-2 from oxidative inactivation[J].Free Radic BiolMed,2015,83:41-53.doi:10.1016/j.freeradbiomed.2015.01.018.

[28]Violi F,Pignatelli P,Pignata C,et al.Reduced atherosclerotic burden in subjects with genetically determined low oxidative stress[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2013,33(2):406-412.doi:10.1161/ATVBAHA.112.300438.

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2016-1798

浙江省自然科学基金项目（LY13H080006）

310036 杭州，杭州师范大学钱江学院基础医学教研室（罗冬娇、傅圆圆）；温岭市大溪中心卫生院（黄灵芳）

罗冬娇，E-mail:luoding9553@sina.com

2016-11-03）

沈昱平）