丙酮酸激酶M2在肿瘤及骨关节炎发病中的作用

叶陈毅 陈炜平 赵翔 陈临炜 李万里 吴立东 杨晓波

●综 述

丙酮酸激酶M2在肿瘤及骨关节炎发病中的作用

叶陈毅 陈炜平 赵翔 陈临炜 李万里 吴立东 杨晓波

丙酮酸激酶（PK）是已知的糖酵解途径尤其是肿瘤细胞糖代谢过程中极为关键的限速酶之一，丙酮酸激酶M2（PKM2）是PK的亚型。作为目前肿瘤领域研究最热门的代谢激酶之一，PKM2在包括各种癌症在内的多种疾病的发生和发展中发挥重要作用。软骨细胞糖酵解代谢异常及分子信号通路紊乱是骨关节炎病因机制研究的两个最突出的难点。越来越多的研究表明，PKM2可入核参与组蛋白修饰过程，对软骨细胞代谢及组蛋白修饰有显著调控作用，进而影响骨关节炎的发生和发展。本文将从基因转录调控、氧化应激等方面综述PKM2在肿瘤和骨关节炎发生、发展中的作用及相关机制，为肿瘤及骨关节炎的诊治提供最新的参考依据。

PKM2 丙酣酸激酶 糖酵解 肿瘤 骨关节炎

丙酮酸激酶（PK）又称磷酸丙酮酸激酶，是糖酵解途径尤其是肿瘤细胞糖代谢过程中极为关键的限速酶之一，可催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和二磷酸腺苷（ADP）化学反应生成三磷酸腺苷（ATP）和丙酮酸[1-3]，是目前的研究热点激酶之一。PK共有PKL、PKR、PKM1及PKM2四种亚型，其中 PKL和PKR由相同的基因PKLR编码，而PKMl和PKM2由PKM基因编码。PKM2在大部分核酸合成率高的组织中均有表达，特别是具有增殖功能的细胞，如胚胎细胞及肿瘤细胞[2-3]。大量的研究证实，PKM2在糖酵解的最后一个阶段发挥关键作用，调节乳酸的合成，进而影响细胞内环境pH值及细胞功能[4-5]。PKM2主要有两种存在形式：在正常细胞的细胞质中，PKM2通常以四聚体形式存在，并作为代谢酶发挥作用；在肿瘤细胞中，PKM2主要以二聚体形式存在于细胞核中，并主要以蛋白激酶形式发挥作用。最新研究表明，PKM2是肿瘤细胞“瓦伯格效应”的关键调控因子，多篇报道证实PKM2在多种癌细胞中呈高表达，调控糖酵解代谢，与肿瘤发生、进展有着密切关系[2-4]。此外，作为糖酵解过程的关键调节因子，PKM2对软骨细胞代谢及后续骨关节炎的发生具有重要的潜在调节作用[6-8]。

1 PKM2与肿瘤

1.1 PKM2在肿瘤细胞中表达的调控 在肿瘤细胞中，调控PKM2基因转录水平的因子主要包括Sp1和Sp3。Sp1持续激活PKM2基因的转录，而Sp3作为转录抑制因子在缺氧条件下促进PKM2基因的解离[9]。在缺氧条件下，缺氧诱导因子1（HIF-1）可与PKM2基因特定结合部位——缺氧反应元件（HRE）结合，并进一步引起PKM2的表达量增加[10]。此外，PKM2表达也受MYC调控：通过与位于PKM2的启动子中的MYC响应元件结合直接调控[11]；或通过激活编码核不均一核糖核蛋白I（hnRNPI）、hnRNPA1和hnRNPA2的基因转录，间接调控PKM2的表达[12]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）与细胞生长和增殖密切相关，可调节细胞周期，基因转录、能量代谢和蛋白质合成，并可激活HIF-1和MYC进而刺激PKM2的表达[13]。Panasyuk等[14]的研究发现，mTOR信号通路中AKT2可通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的表达，增加PKM2基因的转录，促进人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）缺陷小鼠肝脏中PKM2的表达，抑制PTEN过表达小鼠成纤维细胞中PKM2的表达。另有研究表明，包括miR-326、miR-133在内的多种MicroRNA对肿瘤细胞中PKM2的表达有潜在抑制作用[15-16]。

1.2 PKM2是肿瘤细胞“瓦伯格效应”的关键调控因子 德国诺贝尔奖得主瓦伯格发现肿瘤组织中以糖酵解方式供能，糖酵解代谢显著增强，耗糖速度明显高于非肿瘤细胞，并产生乳酸，促进肿瘤细胞增殖，称为“瓦伯格效应”。越来越多的研究指出，PKM2是肿瘤细胞“瓦伯格效应”的关键调控因子，PKM2已被发现在多种癌细胞中的表达明显高于周围正常组织，PKM2可调控糖酵解代谢，与肿瘤发生、进展密切相关[17-18]。

在以PKM1基因取代PKM2后，糖酵解途径异常的代谢指标可完全逆转，提示PKM2可增强“瓦伯格效应”，而PKM1没有这一能力。研究证实，表达PKM2的癌细胞无论在组织培养还是小鼠移植性实体瘤中生长速度都显著高于表达PKM1的癌细胞[19]。当PKM2以二聚体形式存在于癌细胞中时，PKM2的高表达导致用于大分子生物合成的葡萄糖合成代谢增强而用于产生能量的氧化代谢减弱，从而促进癌细胞增殖和肿瘤生长。

最新研究表明，PKM2可能通过以下分子机制介导癌细胞中的瓦伯格效应[10，20]：Luo 等[10]发现，在肝癌Hep3B等细胞系中，PKM2可与细胞核中HIF-1α相互作用，刺激HIF-1靶基因LDHA、编码葡萄糖转运蛋白1（SLC2A1）和PDK1的表达，进而导致糖酵解代谢异常增强。与之对比的是，PKM1在癌细胞中不能激活HIF-1的靶基因，这可能解释了为什么PKM1不能调节瓦伯格效应。此外，PKM2还可结合HIF-2α并促进HIF-2介导的癌细胞反式激活[10]。除了其对代谢基因转录的作用外，PKM2还刺激HIF-1和HIF-2介导的VEGFA基因（编码血管内皮生长因子）的表达，从而促进肿瘤血管生成[10]。因此，PKM2在促进癌症进展中起到至关重要的作用。

1.3 PKM2对肿瘤细胞基因转录的作用 PKM2以二聚体形式入核后，其代谢酶活性减弱，并通过来自PEP的高能磷酸作为磷酸盐供体发挥蛋白激酶的作用。实验表明，在IL-3和凋亡信号刺激后，细胞核中可检测到PKM2表达[21-22]。在细胞核中，PKM2通过其C-末端（残基307-531）结合Oct-4，并增强Oct-4介导的基因转录[23-24]。核PKM2通过磷酸化Stat3，增强Stat3的转录活性，并导致MEK5的反式激活;MEK5的上调可进一步促进PKM2介导的细胞增殖[24]。但是，由于细胞质中PKM2二聚体对PEP底物亲和力低下，核内PKM2二聚体如何使用PEP发挥蛋白激酶作用的机制尚不清楚。目前的研究显示，四聚体和二聚体PKM2的Km分别为0.03mM和0.46mM或0.17mM和2.2mM，阻止胞质PKM2二聚体结合PEP。此外，与胞质PKM2二聚体不同的是，核二聚体PKM2具有不同的性质，可抵抗FBP诱导的四聚化[23]。上述性质可增强核PKM2二聚体对PEP的亲和力，从而发挥蛋白激酶作用。

核PKM2可调节Src介导的β-catenin磷酸化的过程并与β-catenin相互作用。β-catenin磷酸化后通过K433与PKM2结合;导致细胞周期蛋白D1（CCND1）和MYC启动子两种蛋白质的募集，以及上述两种基因的反式激活[25]。Yang等[25]的研究指出：PKM2介导的表观遗传学变化对于EGF诱导的细胞周期蛋白D1和c-Myc的表达以及EGF诱导的脑肿瘤发生至关重要。病理生理学研究显示，组蛋白H3磷酸化修饰在肿瘤尤其是胶质瘤发生中发挥重要作用，并与肿瘤预后密切相关；PKM2可与组蛋白H3结合增加其磷酸化修饰；也可抑制组蛋白脱乙酰基酶3（HDAC3）活性进而导致组蛋白H3乙酰化水平改变[17,25-28]。

2 PKM2与骨关节炎（OA）

2.1 OA与糖代谢 关节软骨的主要成分为细胞外基质（ECM）及软骨细胞。ECM作为软骨细胞周围独特的环境为软骨细胞提供结构和营养等支持，并维持软骨细胞的功能。现有研究表明，机械磨损等一系列有害因素可破坏ECM的动态平衡，阻碍其合成，增加其降解，抑制软骨细胞功能，进而导致OA等关节疾患的发生。低氧微环境是软骨细胞生存的一个显著特点，尤其在OA的发生、发展中，低氧微环境发挥重要作用。一方面，大量研究提示局部缺氧微环境可有效提高骨髓间充质干细胞（BMSCs）的定向成软骨分化能力[29-30]。Kanichai等[31]的研究结果显示，在低氧微环境下诱导大鼠BMSCs成软骨分化过程中，低氧组与正常氧分压组相比，Ⅱ型胶原（Col-Ⅱ）及蛋白多糖的表达水平显著上升。其进一步的研究提示，低氧微环境可通过上调p-Akt及p-p38进而增加SOX9基因的表达，促进BMSCs定向成软骨分化。Malladi等[32]敲除HIF-α基因后发现，缺氧微环境对小鼠干细胞定向成软骨分化作用消失，提示HIF-α是缺氧微环境刺激干细胞成软骨分化过程中的关键调控基因。另一方面，在缺氧微环境中，糖酵解代谢的紊乱将导致软骨细胞功能障碍，影响细胞活性及分泌胶原能力。

2.2 OA与氧化应激 氧化应激反应是指机体在各种有害刺激作用下，机体抗氧化体系破坏，导致活性氧自由基（ROS）相对增多的过程。ROS可通过类脂、蛋白质、糖和DNA等大分子反应从而引起基因突变、受体敏感性改变、酶活性降低和细胞膜损害，最终损伤细胞和组织。氧化应激反应通过ROS给机体造成负面影响，被认为是癌症、炎症等多种疾病及病理状态发生的重要因素。此外与0A等慢性退行性变的发生有直接联系[33]。Regan等[34]的研究结果提示，STR/ort小鼠关节软骨以及OA患者关节软骨标本中，其胞外超氧化物歧化酶3（SOD3）的表达水平较正常软骨组织显著下降，而OA组标本中 ROS的生成显著增多。此外，Surapaneni等[35]的研究结果显示，OA患者血液中脂质过氧化反应的产物丙醛（MDA）含量较健康对照组标本明显增加，而作为机体调节的结果，OA患者关节液中SOD的活性明显增高[35－36]。以上结果提示，氧化应激反应与OA的发生、发展密切相关。

2.3 PKM2与OA的潜在关联 PKM2与氧化应激反应密切相关。研究显示，在过氧化氢、二酰胺和缺氧等引起的氧化应激反应中，肺癌细胞中PKM2被氧化[37]。在A549细胞中，半胱氨酸氧化可导致PKM2亚基关联，引起PKM2活性降低，进而通过磷酸戊糖途径（PPP）导致葡萄糖-6-磷酸的积累[37]。PPP是引起NADPH减少的关键来源。PKM2氧化可进一步通过激活PPP抑制ROS的合成，进而促进肿瘤生长[38]。在酵母中，活性较低的PKM2引起PEP积累，反过来又提供一个负反馈循环，抑制上游磷酸丙糖异构酶（TPI）从而激活PPP。PKM2-PEP-TPI负反馈循环可有效阻止酵母及人类细胞中的ROS 积聚[39]。

软骨细胞的功能维持以及ECM的合成主要依赖于软骨细胞的ATP代谢平衡及能量储备，糖酵解代谢异常将导致细胞功能失调，甚至软骨细胞肥大化改变。PKM2作为糖酵解代谢的关键酶，在软骨细胞能量代谢紊乱这一过程中扮演重要角色，并由此参与骨关节炎的发病[40]。Calamia等[41]的研究发现，将正常人源软骨细胞培养后分别给予硫酸软骨素和硫酸氨基葡萄糖后，PKM2的蛋白水平均显著降低。此外，组蛋白乙酰化修饰水平与OA的发生密切相关。越来越多细胞实验及动物实验结果提示，去乙酰化酶抑制剂（HDACIs）可有效防止OA的发生和发展，将来有可能应用于OA的临床治疗。Yang等[25,42]发表在Cell期刊上的文章提示，细胞核中的PKM2可以在组蛋白 H3的特殊位点T11处标记其磷酸基团，进而调控基因转录及乙酰化修饰水平。目前对于PKM2入核后的组蛋白修饰功能研究已变得越来越热门。SOX-9在软骨以及髓核组织中高表达，对软骨细胞增殖分化有重要调控作用[25,43-45]。Kim、Fujita等[46－47]多位学者报道，OA患者的软骨细胞SOX-9激活子区域乙酰化修饰水平显著异常，提示SOX-9启动子区域乙酰化水平与OA发生相关。以上研究提示，PKM2作为氧化应激及组蛋白修饰的重要调控因子，可能在OA的发生中发挥重要调控作用。

综上所述，PKM2可通过对肿瘤细胞糖代谢以及基因转录的调控影响肿瘤的发生、发展及预后。此外，PKM2作为一个关键性糖酵解代谢激酶可影响软骨细胞胶原分泌能力及细胞活性，在OA的发生中发挥重要调控作用。研究PKM2与肿瘤及OA的关系可能会从新的角度揭示肿瘤和OA的发病机制并为其治疗提供新的药物作用靶点。

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10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.22.2017-2144

浙江省自然科学基金一般项目（LY15H060009）

310009 杭州，浙江大学医学院附属第二医院骨科

杨晓波，E-mail:978239643@qq.com

2016-10-22）

马雯娜）