简述基因诊断技术

2017-01-12张荣郭彦萍王丁丁

考试周刊 2016年10期

张荣　郭彦萍　王丁丁

摘要：基因诊断是利用分子遗传学技术在DNA或RNA水平上对某一基因进行突变分析，从而对特定疾病进行诊断。基因诊断具有直接诊断性、高效特异性和灵敏性等特点，弥补了表型诊断的不足。本文主要综述基因诊断技术的应用及研究进展，提出对基因诊断研究的展望，相信分子生物学、遗传学的快速发展必将极大促进基因诊断技术的进步。

关键词：基因诊断方法应用

基因诊断是在重组DNA技术基础上发展起来的一项应用技术，是对受检者的某一特定基因（DNA）或RNA进行检测和分析，从而诊断出相应疾病，也就是从基因水平阐明疾病的病因。该技术的出现对诊断学来说是一次革命，标志人们对疾病的认识由传统的表现性诊断转为基因诊断或“逆向诊断”，成为分子生物学、分子遗传学与医学在理论、技术上相结合的典范[4]。本文主要介绍基因诊断技术的方法及应用，以进一步了解基因诊断技术。

1.基因诊断的概述

基因诊断是利用现代分子生物学、分子遗传学技术，直接检测患者体内基因结构的表达水平，从而对疾病作出诊断或辅助诊断。

基因诊断与传统诊断比较，特点如下[7]：（1）病因诊断：直接瞄准病理基因，不仅能诊断出表型疾病，而且可发现隐形致病因素；（2）特异性强、灵敏度高、稳定性强；（3）诊断范围广，适应性强：可检测正在生长的病原体或潜在病原体。

2.基因诊断的基本类型[2]

2.1临症基因诊断

医生根据患者的病史和症状，为明确或排除某一疾病而进行的检查。

2.2症状前基因诊断

主要用于有遗传病或遗传病倾向的家族，至今未发病但有高度发病风险人群的诊断，尤其适用于早期诊断后进行预防性干预，避免严重后果出现的疾病。

2.3产前基因诊断

此又称出生前诊断，主要针对一些有可能生育患儿夫妇的胎儿进行诊断。可对诊断为某种疾病的胎儿进行干预，对患无治愈可能疾病的胎儿实施选择性流产。近年来，孕妇外周血中胎儿有核细胞或游离的胎儿DNA已被用于进行产前基因诊断。

3.基因诊断方法

其常用方法有以下几种[1][3][4][8]：

3.1限制性片段长度多态性分析（RFLPs）与印迹杂交（Southern blot）

RFLP可用于对致病基因一无所知、未搞清基因突变位点，依靠基因外紧密连锁的RFLP为遗传标志进行间接分析。由于基因外或基因内的中性突变可引起限制酶切位点丢失或新位点出现，根据有无酶切位点，结合DNA探针杂交，可直接分析。

印迹杂交法由英国人Southern创建于1975年，是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，电泳分离、变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，再与同位素标记的DNA探针进行反应，从而显示出待检的片段及其大小。

3.2聚合酶链反应（PCR）及相关技术

PCR技术（Kary Mullis，1983）是一种灵敏的分子诊断技术，主要用于基因序列已知的检测，目前广泛应用于临床研究。近年来，多种改良PCR不断涌现，如：热启动PCR、巢式PCR，与其他技术的结合才会真正推动PCR的进步。

3.2.1PCR结合特异性寡核苷酸探针杂交（ASO）

这是目前广为采用的基因直接检测方法。大多数疾病只是单纯碱基突变引起，根据常见的突变体类型，合成一系列具有正常序列和突变序列的等位基因和相应引物，PCR产物能同时与正常和突变探针杂交者为杂合子，而正常人只能与正常探针杂交。

3.2.2PCR结合单链DNA构象多态性（SSCP）

这是较为流行的检测DNA突变方法。单个核苷酸改变可造成DNA片段单链构象改变，呈空间折叠构象，当一个碱基发生改变，DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻改变。因此，PCR产物变性后通过PAGE，可敏锐分开构象差异分子，借以检测突变位点。

3.2.3PCR结合变性梯度凝胶电泳（DGGE）

DGCE可以检出几乎所有突变。当双链DNA在梯度变性的聚丙烯酰胺凝胶中行进到与DNA变性温度一致的凝胶浓度时，发生变性，电泳速度迅速降低。解旋DNA链中有1个碱基突变，就会影响电泳速度变化的程度。

3.3DNA测序技术（DS）

当各种筛选方法在敏感性和特异性上受限时，DS无疑是突变分析的最重要方法。1977年Sanger创立链终止反应测序方法，放射性同位素标记引物，双脱氧核苷酸终止DNA链延伸，产生长度不等DNA片段，再由聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影读取结果。DS方法有很大优势：四色荧光标记替代放射性同位素，测序自动化程度高，但是费用高限制了其应用。

4.基因诊断的应用

基因诊断技术目前已广泛用于临床疾病的体外诊断及疗效评价。

4.1病原微生物感染的检测[2][6]

目前可对病毒、细菌等多种病原微生物感染进行基因诊断，如母婴垂直传播感染HIV的患儿，幽门螺杆菌感染，培养结果阴性的感染性心内膜炎病原体等。

4.2肿瘤的检测[2]

肿瘤是体内基因突变结果，已发现与多种肿瘤发生有关的癌基因和抑癌基因突变。用RT-PCR检测胃癌的腹膜转移，微阵列技术分析内分泌肿瘤的基因表达谱，都取得了很好的成果。

4.3遗传病的检测[2]

基因诊断适用于各种单基因疾病。例如对血友病携带者的基因诊断，有助于对这部分家系进行遗传咨询。多基因遗传病的发病率更高，与人群健康有密切联系，但其发生受遗传和环境双重作用，而遗传因素受多个基因位点控制，因此多基因遗传病的基因诊断刚刚起步。

4.4耐药性的检测

由于环境变化和滥用抗生素，许多病原体具有抗药性，甚至出现“超级致病菌”。浙江省基因诊断中心引用荧光定量核酸检测方法，至今已建立10余项病原体的基因诊断[5]，可在极短时间内同时鉴定、分析抗药性，及时筛选最敏感药物应用于治疗。

5.结语

通过以上对基因诊断技术的方法、应用等各个方面的介绍，结合当今科学的发展，相信更加能够促进基因诊断技术的进步。以基因诊断为基础的基因治疗必将成为人类治疗自身疾病的主流技术，并极大地促进人类医疗卫生事业的进步。