亚致死浓度甲氧虫酰肼对甜菜夜蛾蛋白质和糖类含量的影响

张天澍，常晓丽，滕海媛，袁永达，王冬生

（上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海市设施园艺技术重点实验室，上海东保农业科技有限公司，上海 201106）

亚致死浓度甲氧虫酰肼对甜菜夜蛾蛋白质和糖类含量的影响

张天澍，常晓丽，滕海媛，袁永达*，王冬生*

（上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海市设施园艺技术重点实验室，上海东保农业科技有限公司，上海 201106）

研究了亚致死浓度甲氧虫酰肼对甜菜夜蛾幼虫血淋巴蛋白质和糖类含量的影响，结果表明：甲氧虫酰肼处理甜菜夜蛾幼虫72 h后，能显著提高血淋巴中的蛋白质含量，并且随着处理浓度的增加而升高，LC40处理组蛋白含量最高为6.74 mg/mL。此外亚致死浓度甲氧虫酰肼处理后对甜菜夜蛾还存在一定的后续影响，4龄时，LC10、LC20和LC30处理组的蛋白质浓度显著高于对照组，而LC40处理组的蛋白质浓度在各处理组中最低为7.61 mg/mL。血淋巴SDS-PAGE分析也表明，LC10、LC20和LC30处理组几条主要蛋白条带含量要明显高于对照组。5龄时LC10、LC20处理组的蛋白含量要显著低于LC30、LC40处理组和对照组。SDS-PAGE分析结果表明，5龄血淋巴中最主要蛋白条带（85.1 KD）含量在LC10、LC20处理组中要明显低于对照组和其他处理组。对甜菜夜蛾幼虫血淋巴中总糖含量测定结果表明，亚致死浓度的甲氧虫酰肼对甜菜夜蛾幼虫血淋巴中总糖含量的升高具有促进作用。杀虫剂处理72 h后，各处理组的总糖含量要显著高于对照组。甲氧虫酰肼处理结束后，对甜菜夜蛾幼虫后续不同发育阶段的总糖含量也有一定持续影响，如4龄和5龄各处理组的糖含量都明显高于对照组。

甜菜夜蛾；甲氧虫酰肼；亚致死浓度；蛋白质；糖类

甲氧虫酰肼作为双酰肼类昆虫生长调节剂具有与常规杀虫剂不同的作用方式，可模拟昆虫蜕皮激素的功能，通过与蜕皮激素受体结合，诱导昆虫早熟蜕皮，从而导致昆虫死亡［1］。以往的研究表明甲氧虫酰肼除了对昆虫生长繁殖等方面具有一定的亚致死效应外［2-3］，还能影响昆虫体内一些相关酶系的活性［4-6］。例如张天澍等［2］前期对甲氧虫酰肼亚致死效应的研究发现，一定剂量的甲氧虫酰肼能影响甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）的生长繁殖以及食物利用率和转化率等相关指标。任龙等［5］研究发现亚致死剂量甲氧虫酰肼对棉铃虫Helicoverpa armigera的多功能氧化酶（MFO）、酯酶（EST）和谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）的比活力变化具有一定的影响。然而杀虫剂对昆虫的亚致死作用是多方面多层次的，除了上述亚致死作用外，杀虫剂还能影响昆虫体内一些生物大分子的含量［7-8］。如张洁等［8］研究发现亚致死剂量的烯啶虫胺处理褐飞虱Nilaparvata lugens后，能改变其体内蛋白质、可溶性糖等物质的含量。甲氧虫酰肼作为一种防治甜菜夜蛾的常用药剂，对甜菜夜蛾这方面的影响还未见报道，因此为了进一步全面阐明甲氧虫酰肼对甜菜夜蛾的毒力作用，本研究探讨了亚致死剂量的甲氧虫酰肼对甜菜夜蛾血淋巴中总蛋白、糖类等相关物质含量的影响。

1 材料与方法

1．1 试验昆虫

所用甜菜夜蛾为室内在不接触农药条件下多年饲养的种群，饲养条件为温度27℃±1℃，相对湿度70%±5%，光照L∶D为14∶10。

1．2 药剂处理

根据前期生测结果，以LC10、LC20、LC30和LC40值作为亚致死浓度，取新鲜洗净的甘蓝叶片，在不同的亚致死浓度甲氧虫酰肼药液中浸10 s，室温晾干，分别置于养虫瓶中，接入大小一致的2龄幼虫，每处理共300头幼虫。以未用杀虫剂处理叶碟作对照，共5个处理。处理72 h后将存活幼虫接入装有不含杀虫剂饲料的玻璃试管中单头饲养。

1．3 样品制备

参照Tojo等［9］的方法，于甲氧虫酰肼处理72 h，以及存活幼虫发育至4龄、5龄时分别取样。每处理取幼虫20—30头，重复4次。剪去幼虫腹足，取血淋巴于预冷的放有少许苯基硫脲的1.5 mL离心管中，4℃5 000 g离心10 min，取上清液用磷酸盐缓冲液稀释4倍，储存在－75℃，供试。

1．4 甜菜夜蛾血淋巴蛋白质SDS-PAGE分析及含量测定

参考李恺等［10］的方法，采用不连续体系，分离胶浓度为7.5%，浓缩胶浓度为3%，在20 mA恒定电流下进行，采用考马斯亮蓝R-250进行染色。血淋巴总蛋白含量测定参照Bradford考马斯亮蓝G-250染色法测定［11］。

1．5 甜菜夜蛾血淋巴总糖含量测定

按照肖猛［12］的方法，制备各样品的无蛋白血清。然后采用蒽酮法［13］，于620 nm处比色检测通过制作葡萄糖标准曲线，计算各处理的总糖含量。

1．6 数据分析

采用SPSS 16.0等软件进行分析，各处理间差异采用Duncan氏新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2．1 甲氧虫酰肼对甜菜夜蛾血淋巴蛋白质含量的影响

亚致死浓度LC10、LC20、LC30和LC40甲氧虫酰肼处理甜菜夜蛾2龄幼虫，对其血淋巴中的蛋白质含量影响从图1中可见，甲氧虫酰肼处理72 h后，除LC10处理组外，其他各组的蛋白质含量都要显著高于对照组。并且随着处理浓度的增加，血淋巴中蛋白质浓度逐渐升高，处理72 h时LC40处理组蛋白含量最高为6.74 mg/mL，显著高于其他各处理组和对照组。由此可见，一定浓度的甲氧虫酰肼处理甜菜夜蛾幼虫能增加其血淋巴中的蛋白质含量。

此外，当甲氧虫酰肼处理结束后对甜菜夜蛾还存在一定的后续影响，并且与甜菜夜蛾龄期和前期的处理剂量相关，从图2中可见，当甜菜夜蛾发育至四龄时，LC10、LC20和LC30处理组的蛋白质浓度显著高于对照组。而LC40处理组的蛋白质浓度在各处理组中最低为7.61 mg/mL。从4龄幼虫血淋巴SDS-PAGE电泳图（图3）也可看出，LC10、LC20和LC30处理组几条主要蛋白条带含量要明显高于对照组，而在4龄幼虫血淋巴中含量最高的蛋白条带（151.7 KD）在LC40处理组（泳道5）其含量要显著低于各处理组和对照组。这与上述蛋白含量测定结果相一致。对5龄甜菜夜蛾幼虫血淋巴中蛋白质含量分析结果表明，LC10、LC20处理组的蛋白含量要显著低于LC30、LC40处理组和对照组，LC30处理组的蛋白含量最高为26.91 mg/mL。从各处理组5龄血淋巴SDS-PAGE电泳图（图4）也可见，5龄幼虫血淋巴中最主要蛋白条带（85.1 KD）含量在LC10、LC20处理组中（泳道2、3）要明显低于对照组和其他处理组。由此可见，前期甲氧虫酰肼处理剂量的不同，对甜菜夜蛾幼虫血淋巴中蛋白含量的后续影响也存在一定差异。

图1 甲氧虫酰肼处理72 h血淋巴中的蛋白质含量Fig．1 The content of protein in hemolymph treated with methoxyfenozide for 72 hours

图2 不同虫龄血淋巴中的蛋白质含量Fig．2 The content of protein in hemolymph at different instars

图3 4龄血淋巴蛋白质SDS-PAGE图Fig．3 SDS-PAGE of hemolymph proteins at 4th instar

图4 5龄血淋巴蛋白质SDS-PAGE图Fig．4 SDS-PAGE of hemolymph proteins at 5th instar

2．2 甲氧虫酰肼对甜菜夜蛾幼虫血淋巴总糖含量的影响

亚致死浓度甲氧虫酰肼对甜菜夜蛾幼虫血淋巴中总糖含量的影响从图5中可见，杀虫剂处理72 h后，各处理组的总糖含量要显著高于对照组。并且高浓度处理组（LC30、LC40处理组）的糖含量要高于低浓度处理组（LC10、LC20处理组）。可见亚致死浓度的甲氧虫酰肼对甜菜夜蛾幼虫血淋巴中总糖含量的升高具有一定的促进作用。此外，从图6中还可发现，甲氧虫酰肼处理结束后，对甜菜夜蛾幼虫后续不同发育阶段的总糖含量也有一定影响。如在甜菜夜蛾幼虫4龄和5龄时，各处理组的糖含量都明显高于对照组，表明即使在甲氧虫酰肼处理结束后，仍能增加甜菜夜蛾幼虫血淋巴总糖含量，具有一定的持续效应。

图5 甲氧虫酰肼处理72 h血淋巴中的糖含量Fig．5 The content of carbohydrate in hemolymph treated with methoxyfenozide for 72 hours

图6 不同虫龄血淋巴中的糖含量Fig．6 The content of carbohydrate in hemolymph at different instars

3 讨论

杀虫剂对昆虫的亚致死效应研究是昆虫毒理学研究的一个热点。杀虫剂施用后，随着时间推移或昆虫个体之间接触农药剂量的不同，导致亚致死剂量杀虫剂对昆虫生长繁殖、生理生化以及行为等方面产生一系列的亚致死效应［14］。对杀虫剂亚致死效应的研究有助于全面掌握杀虫剂对昆虫的毒力作用，从而指导杀虫剂田间的合理使用。昆虫体内血淋巴中含有与其生殖、变态等重要功能密切相关的蛋白质、糖类等生物大分子。这些物质含量的改变必然会对昆虫的生长繁殖等性能产生一系列影响。

本试验结果表明，亚致死浓度甲氧虫酰肼处理甜菜夜蛾2龄幼虫72 h后，除了LC10处理组外，其他各组的幼虫血淋巴中可溶性蛋白质较对照有显著增加。以往的研究中也有相似的研究结果，如王红等［15］用吡虫啉致死中浓度处理大豆蚜成虫，可明显升高体成虫体内可溶性蛋白含量。廖月枝等［16］用甲氧虫酰肼处理舞毒蛾4龄幼虫12 h后能明显增加血淋巴中的某些蛋白质的表达量，这些均与本研究结果一致。此外本研究还探讨了甲氧虫酰肼对甜菜夜蛾总蛋白含量的后续影响，发现在不同幼虫生长发育时期受影响的蛋白条带不同，如4龄主要是影响分子量为151.7 KD的蛋白含量。而在5龄时则影响分子量为85.1 KD的蛋白含量。甲氧虫酰肼导致幼虫血淋巴中蛋白含量的增加，这一方面与其能诱导甜菜夜蛾早熟蜕皮的相关蛋白质表达有关，同时可能为与抗药性相关酶系以及同工酶的表达所致［1，5］。而甲氧虫酰肼影响蛋白质条带的种类、性质以及作用机理有待今后深入研究。

本研究还发现，亚致死浓度甲氧虫酰肼处理甜菜夜蛾2龄幼虫能增加其血淋巴中总糖的含量。印建莉等［7］在褐飞虱上也有相似研究结果。由于昆虫血淋巴中的血糖主要为海藻糖，因此血淋巴中总糖含量的增加，可能是甲氧虫酰肼抑制甜菜夜蛾体内海藻糖酶的活性，阻碍了海藻糖的分解代谢，从而导致血淋巴中糖含量的升高。然而也有研究表明杀虫剂处理后能降低昆虫血淋巴中的糖含量，如赵克非等［17］研究发现亚致死剂量的吡虫啉能增强褐飞虱体内海藻糖酶活性，从而导致海藻糖含量下降。两者之间的差异可能与杀虫剂作用机理和昆虫种类不同有关。

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（责任编辑：张睿）

Profile of protein and carbohydrate in Spodoptera exigua treated with sublethal concentration of methoxyfenozide

ZHANG Tian-shu，CHANG Xiao-li，TENG Hai-yuan，YUAN Yong-da*，WANG Dong-sheng*
（Institute of Eco-Environment and Plant Protection，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology，Shanghai Dongbao Agricultural Science and Technology Co.，Ltd.，Shanghai 201106，China）

After treated with sublethal concentration of methoxyfenozide，the total protein and carbohydrate contents in Spodoptera exigua larval haemolymph were analyzed.Treated with methoxyfenozide for 72 hours the total protein content was raised with the increase of treatment concentration.And the protein concentration of LC40treatment 6.74 mg/mL was the highest.Moreover，the sublethal concentration methoxyfenozide had the obvious subsequent effects for the beet armyworm.At 4 th instar，the protein concentrations of LC10，LC20and LC30treatment groups were higher than that of control group significantly，and the protein concentration of LC40treatment，7.61 mg/mL，was the lowest among the treatment groups.Furthermore，the SDS-PAGE results also showed that contents of several major protein bands of LC10，LC10and LC30treatment groups were higher than that of control group remarkably.At 5 th instar，the protein concentrations of LC10，LC20treatment groups were lower than that of control and other treatment groups significantly，and the SDS-PAGE analysis indicated that the main protein band（85.1 KD）content of LC10，LC20treatment groups was the lowest.As to the total carbohydrate content in haemolymph，the results showed that sublethal concentration methoxyfenozide had the positive effects on the increase of total carbohydrate in larva haemolymph.After being treated with methoxyfenozide for 72 hours，the total carbohydrate contents of all treatment groups were higher than that of control.And the subsequent effects were the same，at 4 th and 5 th instar，the total carbohydrate concentrations of all treatment groups were higher than that of control remarkably.

Spodoptera exigua；Methoxyfenozide；Sublethal concentration；Protein；Carbohydrate

S433

A

1000-3924（2016）06-087-05

2016-04-28

上海市自然科学基金（13ZR1418000）；上海市农业科学院科学技术发展基金［农科发2013（18）］

张天澍（1977—），男，博士，副研究员，主要从事昆虫毒理及生理生化研究。E-mail：zhangtianshu2000＠sohu.com

*通信作者，E-mail：yuanyongda＠saas.sh.cn，zb3＠saas.sh.cn