建立高效节水抗旱稻花药培养体系的研究

李天菲，韩 静，林 田，夏 辉，周 丽，刘国兰，王加红，罗利军

（上海市农业生物基因中心，上海 201106）

建立高效节水抗旱稻花药培养体系的研究

李天菲，韩 静，林 田，夏 辉，周 丽，刘国兰，王加红，罗利军*

（上海市农业生物基因中心，上海 201106）

以14个节水抗旱稻主要育种亲本/组合为材料，对不同花药愈伤诱导培养基、低温预处理时间、热激处理时间等影响花药培养力的条件进行单因素研究。结果表明：花药愈伤诱导培养基M84（M8为基本培养基，附加2，4-D 2 mg/L、NAA 3 mg/L、KT 1 mg/L、脯氨酸300 mg/L、谷氨酰胺500 mg/L、水解酪蛋白300 mg/L、55 g/L麦芽糖和植物凝胶4 g/L）的愈伤诱导率和花药培养力最高，且与其他4个诱导培养基存在显著差异；花药接种前低温预处理能普遍提高花药愈伤诱导率，8—10℃预处理7 d，花药培养力最高，且与对照差异显著；花药接种后热激处理24 h的愈伤诱导率和花药培养力最高，且与其他处理及对照存在显著差异。

节水抗旱稻；花药培养；高效培养体系

花药培养是指把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术接种到人工配置的培养基上，诱导其花粉（小孢子）形成愈伤组织，进而分化成完整植株的过程［1］。花药培养（简称“花培”）过程中，单倍体植株经染色体自然加倍或人工加倍能够得到纯合二倍体，这种由染色体加倍获得的纯合二倍体在遗传上非常稳定，其后代不发生性状分离，因而在植物育种中的作用很大。例如能够极早稳定分离后代，快速获得纯系，缩短育种年限，提高选择效率等。自1968年日本科学家新关和大野首次获得水稻花培植株后［2］，水稻花培育种得到快速发展，花培作为一种实用有效的技术手段，在创造原始材料，选育新品种、新不育系、新恢复系，提纯不育系和恢复系等方面都起到了作用，并取得了一定的成效。

节水抗旱稻（Water-saving and drought-resistance rice，WDR）是指既具有水稻高产优质特性，又具有旱稻节水抗旱特性的一种新的栽培稻品种类型。它是在水稻高产优质研究的基础上，引进旱稻的节水抗旱特性而育成的新品种［3］。在粮食安全备受关注，水资源匮乏与干旱普遍发生的的大环境下，水资源已成为我国水稻生产发展的瓶颈，节约水稻用水必然成为农业节水的一条主要途径与措施。因此，培育和推广集高产、优质、抗病虫害、肥料高效吸收利用、抗逆等优良性状于一体的节水抗旱稻新品种，稳定和提高中低产田的产量水平，是育种家一项新的任务和挑战，对于建设我国新型节水环保农业具有重大的意义。

为了加快节水抗旱稻改良育种的步伐，将常规育种与花培育种的技术相结合，可解决生产中的实际问题，为种质创新及新品种的选育提供技术支撑，也可实现育种程序的新突破。本研究以主要节水抗旱稻亲本及杂交后代为材料，从花药愈伤诱导培养基优化筛选、低温预处理时间、热激处理等方面进行试验评价，以期建立一套广泛适用于不同节水抗旱稻基因型的花培技术体系。

1 材料与方法

1．1 试验材料

节水抗旱稻改良材料及杂交后代，包括节水抗旱稻改良育种中使用的亲本品种及杂交后代材料。具体材料编号及来源见表1。

表1 供试节水抗旱稻及其亲本材料Table 1 Test materials of water-saving drought-resistant rice and their parents

1．2 外植体的取材及低温预处理

晴天早晨露水未干时或傍晚田间取穗，穗子位于苞内约2/3处，不破口；穗子中段颖壳为淡绿色；花药淡黄色。田间取穗后立即放入装有清水的桶中，以避免穗子失水。在实验室内用70%酒精棉球简单擦拭叶片和叶鞘（不要太湿），保留前1—2张叶片，然后用潮湿的纱布和塑料薄膜依次包好，放在8—10℃冰箱中低温处理3—14 d。

1．3 花药的灭菌及接种

将低温处理后的穗子剥去叶鞘，挑拣出小穗花药处于单核靠边期的枝梗进行灭菌。具体灭菌方法为：先用70%酒精浸泡30—60 s进行表面消毒，再依次用新鲜配制的1%次氯酸钠和3%双氧水分别浸泡振荡20 min和10 min，最后用无菌水冲洗4—5次。穗子灭菌后，在超净台内吹15 min左右，至颖壳表面较干爽，采用剪颖抖花药法将花药接种到诱导培养基上。

1．4 花药诱导培养及热激处理

采用对籼稻基因型适应性较好的M8培养基［4］作为基本培养基，并针对节水抗旱稻材料，调整激素和附加营养元素的配比，具体愈伤诱导培养基见表2。愈伤诱导培养条件为25℃黑暗培养。

表2 五种花药愈伤诱导培养基的激素配比Table 2 Hormore combination in 5 anther callus induction mediamg·L－1

热激处理方法：将接种好的花药放入30—32℃暗培养箱，热激处理12—48 h。热激结束后，将花药放置于25℃黑暗条件下继续培养20—30 d，直至长出愈伤。

1．5 花药愈伤的分化培养

将生长至2 mm左右的花药愈伤转入到分化培养基进行光照培养，光照强度为5 000—6 000 lx，光照周期为14 h/d，培养温度为25℃。水稻愈伤分化培养基配方为MS基本培养基+6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L，水解酪蛋白1.0 g/L，麦芽糖30 g/L，植物凝胶phytagel 3.8 g/L，pH为6.0。

1．6 花培苗的生根壮苗及移栽

将长至约5—8 cm的小苗转入生根壮苗培养基，生根培养基为1/2MS+NAA 0.1 mg/L，蔗糖20 g/L，植物凝胶phytagel 3.8 g/L，pH为6.0。生根培养条件为光照强度5 000—6 000 lx，光照周期14 h/d，培养温度25℃。

花培苗长至13 cm左右，3片真叶以上，根系新鲜发达时，可将幼苗移出试管。将根部的培养基完全洗净，剪去老根和过长的叶片，仅保留3 mm左右的根，放置于清水中养根炼苗3—5 d，再移栽土中，移栽后注意遮阴，浅水养苗生根，至叶尖吐水完全成活。

1．7 数据统计

愈伤诱导率＝长出的愈伤组织块数/接种花药枚数×100%

绿苗分化率＝长出的绿苗丛数/分化的愈伤组织块×100%

花药培养力＝愈伤诱导率×绿苗分化率

为符合正态分布、方差齐性等基本的统计检验假设，将每个材料每组处理中数值最高的数据定为1，同样处理条件下的其他数据与之相比得到相应比值。转换后的数据利用Excel 2003和SPSS 13.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2．1 花药愈伤诱导培养基的筛选与优化

从表3可以看出，以M8为基本培养基的5个花药愈伤诱导培养基上，T1-1、T1-2两个粳稻组合的愈伤诱导率大多在20%以上，最高可达46.92%，显著高于T1-3、T1-4、T1-5和T1-6四个籼稻品种/组合。籼稻来源的品种花药愈伤诱导率大多在10%以下。绿苗分化率在粳稻材料和籼稻材料中差异不大，其中T1-4的绿苗得率最高。5种诱导培养基条件下，T1-4的绿苗分化率均在30%以上，其中M85诱导的愈伤绿苗分化率高达50.75%。

表3 节水抗旱稻材料在5种不同愈伤诱导培养基中的花药愈伤诱导率、绿苗分化率和花药培养力Table 3 Anther callus induction rate，green seedling differentiation rate and anther culture ability of water-saving drought-resistant rice in 5 different callus induction media

从图1可以看出，5种花药愈伤诱导培养基中，M84的愈伤诱导率最高，与其他4个诱导培养基存在显著差异。M85诱导的愈伤分化时绿苗分化率最高，M83绿苗分化率最低，其他3个诱导培养基的愈伤绿苗分化率水平居中，且无显著差异。在花药培养力方面，M84最高，与其他4种诱导培养基存在显著差异。因此，在以上试验材料的花药培养过程中，M84培养基是最合适的花药愈伤诱导培养基。

图1 不同花药愈伤诱导培养基条件下平均愈伤诱导率、绿苗分化率和花药培养力比较Fig．1 Comparison of average callus induction rate，green seedling differentiation rate and anther culture ability among different callus induction media

2．2 低温预处理时间对节水抗旱稻花药愈伤诱导率的影响

为了比较低温处理效果及筛选合适的低温处理时间，将田间取回的穗子立即放入8—10℃冰箱中低温处理3—14 d，并与对照（不进行低温处理）比较，通过比较诱导率、绿苗分化率和花药培养力的差异，来确定最佳的低温预处理时间。

从表4可以看出，花药接种前进行低温预处理，相比对照能普遍提高花药愈伤诱导率和花药培养力，但低温处理最适时长因试验材料不同而有所不同。T2-2、T2-3、T2-4、T2-5低温处理3 d后，愈伤诱导率比对照提高，处理7 d后愈伤诱导率达到最高，随后继续处理至14 d时，愈伤诱导率又表现出降低的趋势。T2-6的愈伤诱导率随着低温处理天数的增加而逐渐提高，处理14 d愈伤诱导率最高。T2-1低温处理3 d诱导率比对照提高，但处理7 d和14 d后诱导率都比对照低。

表4 不同低温预处理时间下节水抗旱稻材料花药愈伤诱导率、绿苗分化率和花药培养力Table 4 Anther callus induction rate，green seedling differentiation rate and anther culture ability of water-saving drought-resistant rice of different low temperature pre-treatment

通过表4与图2可以看出，8—10℃低温处理3 d后愈伤诱导率与对照无显著差异，处理7 d和14 d的愈伤诱导率无显著差异，但比对照有显著提高，其中处理7 d条件下花药愈伤诱导率最高。低温处理时间7 d时绿苗分化率最高，但不同处理间差异并不显著。低温处理7 d的花药培养力最高，且与对照差异显著。

2．3 不同热激时间对节水抗旱稻花药愈伤诱导率的影响

从表5可以看出，热激处理24 h和36 h条件下，5个节水抗旱稻组合的愈伤诱导率均比对照（未处理）有所提高；热激48 h，仅T3-5的愈伤诱导率比对照降低，其他材料都比对照高。说明热激处理对提高花药愈伤诱导率的作用比较明显。在试验中还观察到，热激后花药出愈时间明显比对照有所提前，一般可提前3 d左右。但不同热激时间下，出愈时间比对照提前的时间长短差异不显著（数据未列出）。

图2 不同低温处理时间下平均愈伤诱导率、绿苗分化率和花药培养力的比较Fig．2 Comparison of callus induction rate，green seedling differentiation rate and anther culture ability among different low temperature pre-treatments

表5 不同热激处理对节水抗旱稻愈伤诱导率、绿苗分化率和花药培养力的影响Table 5 Anther callus induction rate，green seedling differentiation rate and anther culture ability of water-saving drought-resistant rice of different heat shock time

从图3可以看出，花药接种后热激处理24 h的愈伤诱导率最高，且与热激36 h、热激48 h及对照的愈伤诱导率差异显著。所有热激处理和对照条件下愈伤的绿苗分化率无显著差异。热激24 h处理条件下的花药培养力最高，且与其他处理及对照有显著差异。从图3还可以看出，花药接种后进行30℃热激处理至48 h，随着处理时间的延长，愈伤诱导率和花药培养力呈现先上升再下降的趋势，其中处理24 h达到最高值，继续热激至36 h，愈伤诱导率和花药培养力有所下降，处理至48 h后与对照相当。

图3 不同热激处理时间下平均愈伤诱导率、绿苗分化率和花药培养力的比较Fig．3 Comparison of callus induction rate，green seedling differentiation rate and anther culture ability among different heat shock time

3 结论与讨论

水稻花药培养中，愈伤诱导率是花药培养力的一个主要限制因子。特别是籼稻品种花药培养能力低，愈伤诱导率一般不到1%，平均培养力只有0.5%左右［5］。虽然不同基因型的籼稻品种愈伤诱导率及成苗率有差异，但总体花培效果仍远不及粳稻。本试验针对如何提高愈伤诱导率，优化了激素及营养元素配比，得到改良的水稻花药诱导培养基M84。目前已成功诱导300余份节水抗旱稻品种/组合的花药愈伤，其中籼型节水抗旱稻的花药愈伤诱导率平均为5%—8%，最高可达20%，籼粳杂交型节水抗旱稻的花药愈伤诱导率在10%以上，粳型节水抗旱稻的花药愈伤诱导率平均可达20%—30%。

在小孢子发育的单核靠边期进行低温预处理是有效提高花培效率的手段。GENOVESI等［6］认为低温预处理能显著提高花药的诱导率。姚炎等［7］研究也表明，水稻花药培养过程中，药壁组织容易发生褐变，影响花药愈伤组织的形成。在花药培养前期低温预处理可有效缓解药室内壁结构的降解速度，减缓褐变发生，有利于花粉脱分化。季彪俊等［8］认为籼稻原产热带对低温较敏感，处理时间不宜过长，在8—10℃下处理7—10 d为宜。本研究也印证了此观点，籼型节水抗旱的花药培养，8—10℃低温预处理7 d愈伤诱导率最高。

花药接种后进行热激处理的主要作用是加快启动小孢子分裂，加快愈伤形成，提高愈伤诱导率［9］。本试验将花药接种到诱导培养基后进行24 h、36 h和48 h的热激处理（30℃），热激24 h的愈伤诱导率和花药培养力最高，并与其他处理有显著差异。而且热激处理能明显提早愈伤形成，但热激过长（48 h）会影响愈伤的质量，降低绿苗分化率，从而使得花药培养力下降。

本研究建立的高效花药培养体系，对节水抗旱稻特别是籼型节水抗旱稻有广泛的适应性，在节水抗旱稻育种中已发挥了一定作用，但仍然存在花培受体特异性的问题。例如试验中发现，含有籼稻‘沪旱3号’系列的组合普遍易诱导，花药培养力比较高，而含有籼稻‘沪旱1B’血缘的材料都较难诱导。同时也观察到恢复系材料比保持系材料花药培养力高的现象。这个现象是否具有普遍性，其中的生物学机理又是怎样，还需要进一步研究。而且高效的花药培养体系不仅仅依赖于培养基的改良，或低温、热激等处理手段，还应从包括取材、灭菌、前处理、接种和炼苗移栽等各方面进行重视和规范。今后花药培养技术的发展必须同分子生物学、细胞生物学、细胞遗传学等学科更紧密结合，从分子机制上深入了解小孢子发育基因调控，才有可能真正克服诸如受体特异性、白化苗等问题，使这项技术应用到更广泛的植物品种中，并在育种发挥更重要的作用。

［1］罗琼，曾千春，周开达，等.水稻花药培养及其在育种中的应用［J］.杂交水稻，2000，15（3）：1-2.

［2］姜健，金成海，候春香，等.水稻花药培养研究与应用进展［J］.中国农学通报，2001，17（4）：49-52.

［3］罗利军，梅捍卫，余新桥，等.节水抗旱稻及其发展策略［J］.科学画报，2011，56（11）：804-811.

［4］梅传生，张金渝，吴光南.籼稻花培绿苗率的提高［J］.江苏农业学报，1988，4（2）：45-48.

［5］葛胜娟.水稻花药培养及其在遗传育种上的应用［J］.种子，2013，32（8）：45-50.

［6］GENOVESI A D，MAGILL C W.Improved rate of callus and green plant production from rice anther culture following cold shock［J］.Crop sci，1979，19：662-664.

［7］姚炎，刘向东，汪珍春，等.低温预处理对水稻花药培养中药壁褐变的结构影响［J］.热带亚热带植物学报，2006，14（4）：307-311.

［8］季彪俊，陈启锋，黄群策，等.水稻花药培养技术的总结与探讨［J］.福建农业大学学报，2001，30（1）：22-28.

［9］朱永生，陈葆棠，张端品.提高水稻籼粳杂交后代花药培养力的研究［J］.华中农业大学学报，2001，20（4）：314-317.

（责任编辑：闫其涛）

Establishment of efficient anther culture system for water-saving and drought-resistance rice

LI Tian-fei，HAN Jing，LIN Tian，XIA Hui，ZHOU Li，LIU Guo-lan，WANG Jia-hong，LUO Li-jun*
（Shanghai Agrobiological Gene Center，Shanghai 201106，China）

Effects of different callus induction media，low temperature pretreatment and heat shock treatment on anther culture ability were studied taking 14 breeding parents and hybridized combination of water-saving and drought-resistance rice（WDR）as materials.The results indicated that the callus induction rate and anther culture ability of anther callus induction medium M84 were the highest，and there were significant differences between the other 4 induction medium treatments.The induction rate of anther callus could be improved by low temperature pretreatment before anther inoculation，the anther culture ability was the highest with 8—10℃low temperature pre-treatment for 7 d，and there was significant difference between CK.The callus induction rate and anther culture ability of heat shock treatment 24 h after anther inoculation were the highest，and there were significant differences between the other treatments and CK.

Water-saving drought-resistant rice；Anther culture；Efficient culture system

S511.035

A

1000-3924（2016）06-037-06

2015-07-13

科技部国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2014AA10A603）；国家转基因生物新品种培育科技重大专项（2014ZX08001003-004）

李天菲（1976—），女，硕士，副研究员，主要从事水稻遗传改良研究

*通信作者，E-mail：lijun＠sagc.org.cn