血管平滑肌细胞与血管钙化相关机制的研究进展

刘海玲，冯景辉

血管平滑肌细胞与血管钙化相关机制的研究进展

刘海玲1，冯景辉1

血管平滑肌细胞（VSMC）既可参与血管内膜钙化也可参与中膜钙化，以点状或斑片状形式存在于动脉粥样硬化斑块部位[1]。现认为血管内膜微钙化来源于凋亡的VSMC或这些细胞释放的基质囊泡[2]，血管中膜钙化主要通过VSMC向成骨样细胞表型转化，转化的VSMC表达骨相关因子、骨相关蛋白等物质而介导的血管钙化。

1 基因遗传因素

MicroRNAs（miRs）是由22个核苷酸组成的非编码小RNAs，现认为是VSMC表型转化的关键调节因子[3]。MiRs通过调控转录因子Runx2和Osterix表达与相关信号通路结合而调节血管钙化。MiR-143/145可调节VSMC分化标志物的表达，VSMC表达MiR-204、MiR-205、MiR-133a或MiR-30b/c减少可增加Runx2表达。MiR-433通过降低Runx2转录水平而抑制BMP-2诱导VSMC表型转化。转录因子Osterix是MiR-125b的一个干预靶点，抑制MiR-125可增加Runx2、Osterix表达和ALP活性。其它MiRs如MiR-135a*、MiR-762、MiR-714和MiR-712*的靶向钙泵蛋白NCX1, PMCA1, NCKX4也参与VSMC钙化的形成[4]。MiR-221和MiR-222通过调节ENPP1和Pit1的表达来调控无机磷酸盐和焦磷酸盐的产生从而促进血管钙化的发展。动物实验表明MicroRNA-34b/c可通过Satb2和Runx2通路抑制VSMC钙化[5]。

2 转录及信号途径

在血管钙化部位，骨相关转录因子包括Msx2、Sox9、Runx2和Osterix等被激活。转录因子通过上调骨和软骨细胞蛋白分子的表达而调节VSMC成骨样分化。Runx2（又称Cbfα1）通过增加OPN、OC、RANKL和ALP等物质表达来促进VSMC表型分化，分化的VSMC又可增加Runx2的表达进一步促进血管钙化[6]。BMP-2/Cbfα1信号通路在诱导VSMC钙化过程中发挥重要作用，BMP和TNF-α通过激活Msx2和Wnt信号上调转录因子Runx2和osterix的表达，反过来Runx2可增加OC和sclerostin的表达并激活核因子κB受体活化因子配体(RANKL)进一步促进血管钙化。Osterix位于Runx2的下游，通过增加骨相关蛋白如BSP及ALP的表达而促进血管钙化[7]。转录因子核因子E2相关因子2（Nrf2）通过激活抗氧化基因而具有抗氧化作用，体外实验研究表明Nrf2抑制Runx2活性而抑制VSMC成骨样分化[8]。

3 线粒体DNA损伤、自噬和细胞凋亡

线粒体DNA损伤与VSMC钙化存在着密切联系。已发现DNA损伤信号刺激VSMC成骨样分化和激活p16基因诱导细胞衰老。α-硫辛酸可能通过促进线粒体功能恢复和激活Gas6/Axl/Akt存活路径而抑制磷酸盐诱导的VSMC凋亡和钙化[9]。自噬被认为是细胞适应应激反应的分解代谢过程，可抑制基质囊泡释放，限制VSMC钙化。高磷情况下（3 mmol/L）可通过抑制细胞自噬而增加VSMC钙化。因此，抑制细胞自噬作用可促进VSMC钙化的形成[10]。早期研究显示VSMC可释放类似于基质囊泡的凋亡小体，其可富集钙离子。反过来钙磷结晶依据其晶体大小及组成成分可引起VSMC凋亡，当晶体≤1 um时，溶酶体可通过溶解钙磷晶体而引起细胞内钙离子迅速增加和细胞凋亡，最终促进VSMC钙化形成[11]。

4 钙化相关蛋白

4.1 促进血管钙化蛋白 骨形态发生蛋白（BMPs）是转化生长因子β（TGF-β）超家族的成员，作为高效骨诱导因子现已发现30余种。BMP-2是唯一能够独自诱导骨相关物质形成的局部生长因子，可激活转录途径增加Cbfαl的表达，并通过与BMP-1A型受体结合诱导Smad1和Smad4的表达。在缺氧条件下，通过上调PTEN的表达而促进VSMC凋亡和促进VSMC成骨样分化及矿化[12]。骨钙素（OC）是含三个α-羧谷氨酸残基（Gla残基）的骨依赖性维生素K蛋白，又称α-羧基谷氨酸蛋白（BGP）。血清OC水平并不等同于血管壁局部OC水平，它反映的是未与羟磷灰石结合的、新合成的OC以及矿化部位扩散出的OC碎片。VSMC表达的OC在维生素K作用下，促使Gla残基羧化并与Ca2+结合而增加羟磷灰石的沉积。骨唾液酸蛋白（BSP）是成骨细胞分泌的一种酸性糖蛋白，也是基质小泡的重要组成部分，BSP通过水解磷酸酯键来提高局部组织磷酸根浓度，促进羟磷灰石聚集于血管壁而加重血管钙化形成。体外实验研究表明VSMC可通过Runx2途径增加BSP的表达[13]。基质金属蛋白酶（MMPs）是巨噬细胞和平滑肌细胞等产生的肽链内切酶，水解弹性蛋白、胶原蛋白以及粘多糖等多种蛋白物质。MMPs相对/绝对表达增多可促使VSMC发生增殖和迁移。动物试验研究表明钙化的VSMC可明显增加MMP-2的表达[14]。碱性磷酸酶（ALP）是成骨细胞活跃和增值的一个标志，可激活Wnt信号和Msx2促进VSMC表型分化。另外，ALP可通过水解磷酸酯而提高磷酸盐浓度，水解焦磷酸盐而增加磷酸钙的生成最终加速血管钙化发展。补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白3（CRTP3）是15种CTRP成员中的一个，由246个氨基酸组成。可由软骨细胞、成纤维细胞和单核细胞等分泌，通过激活ERK1/2途径上调OPN、BMP-2和Cbfαl等成骨细胞标志物的表达、降低收缩表型标记物sm22a、SM-α-actin的表达而增加VSMC成骨样分化[15]。

4.2 抑制血管钙化蛋白 基质谷氨酸蛋白（MGP）是维生素K依赖性蛋白，其γ-羧化依赖维生素K作为辅酶，通过抑制BMP-2，BMP-4和TGF-β而抑制VSMC钙化，当VSMC发现MGP匮乏时便可产生基质囊泡而加重血管钙化。维生素K缺乏或给予高剂量维生素K拮抗剂华法林与血管钙化形成密切相关[16]。胎球蛋白A是肝脏合成的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，与循环中磷酸盐结合成复合物而抑制钙盐沉积。此外，还可减少TGF-β和BMP-2的表达，抑制胞内Ca2+增高及磷酸钙导致的VSMC凋亡，常被视为循环中的钙化抑制剂[17]。骨保护素（OPG）是肿瘤坏死因子α超家族的一个成员，通过抑制破骨细胞分化进而抑制骨重塑和钙磷释放入循环中。OPG是核因子κB受体活化因子（RANK）配体的诱饵受体，通过降低RANK信号活性而抑制VSMC钙化的发生[18]。OPG治疗可通过下调Notch1-RBP-Jkappa通路、Msx2和ALP的表达来抑制VSMC钙化。Apelin是一种主要由内皮细胞分泌的孤独G蛋白偶联受体APJ的内源性配体，又被称为AT1相关蛋白，其可通过APJ/PI3-K/Akt和APJ/ERK信号通路调控VSMC成骨样分化而抑制VSMC表型转化及血管钙化[19]。Klotho蛋白是由肾脏和血管表达的一种年龄相关性蛋白，作为FGF23的共受体共同维持循环中钙磷水平的平衡。激活维生素D受体可增加klotho表达水平，从而下调磷酸钠转运体Slc34A1/NaPi-2a和Slc34A3/NaPi-2c而促进磷的排泄。异位钙化的高磷状态时klotho可防止VSMC分化而抑制血管钙化[20]。体外实验研究表明，Klotho基因敲除通过增强Runx2和心肌素血清反应因子依赖途径促进VSMC钙化发展[21]。

5 基质囊泡

去分化或钙化的VSMC可产生为钙磷沉积提供微环境的基质囊泡。当细胞内钙处于高水平时可促进膜联蛋白6移位到质膜，触发囊泡释放并将其转化成具有矿化能力的基质囊泡，即与Ca2+-P磷酯酰丝氨酸结合。质谱分析显示VSMC产生的基质囊泡含有79种蛋白质，包括钙化相关蛋白、细胞外基质、钙通道蛋白、细胞骨架蛋白、氧化和内质网应激蛋白等。基质囊泡富含外泌体标记CD63、CD9、CD81和MHCI，在致钙化因素作用下血管钙化部位可检测到外泌体含有无定型的钙磷结晶[11]。

6 炎症因子、氧化应激和内质网应激

Shao JS等体内外实验研究表明暴露于TNF-α的主动脉VSMC通过增加Msx2表达和上调Wnt3a、Wnt7a及ALP从而向成骨样细胞分化，分化的VSMC表达骨转录因子和骨基质相关蛋白最终促进血管钙化[22]。此外，白细胞介素（如IL-1、IL-6、IL-8）、C-反应蛋白、血小板因子等炎性物质可通过上调ALP、BMP-2和Cbfα1等促钙化因子的表达而参与VSMC钙化。各种因素引起的氧化应激也与VSMC钙化形成密切相关。增加NADPH氧化酶活性和H2O2水平可上调Runx2的表达而诱导RANKL促进VSMC的分化。RAGE炎性受体通过增加NADPH氧化酶活性和VSMC氧化应激，进一步增加Runx2、ALP的表达及VSMC成骨样分化。此外，饱和脂肪酸可通过参与氧化应激促进血管钙化[23]。氧化应激还可激活内质网（ER）应激，BMP-2可增加NADPH氧化酶活性和ROS的产生而激活ER应激，氧化型胆固醇也可促进ER应激。ER应激通过增加转录因子XBP-1表达并与Runx2基因启动子结合而触发VSMC成骨样分化。TNF-α可激活ER应激和PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路而诱导血管钙化[24]。

7 钙磷及代谢相关物质

甲状旁腺激素（PTH）对VSMC钙化的作用目前仍存在争议。早期对大鼠慢性肾病手术切除后PTH替代治疗的研究发现，PTH具有直接促进VSMC钙化的作用。然而，其他研究发现在钙化的VSMC的PTH1受体表达增加，与PTH结合后可抑制ALP的活性而抑制内源性VSMC钙化作用[11]。VSMC内雌激素通过其受体α信号而抑制RANKL信号通路。去卵巢ApoE敲除小鼠的雌激素替代治疗研究发现，雌激素可抑制BMPS的表达和Smad1/5/8信号通路，并增加MGP的表达来抑制血管钙化[25]。维生素D在血管钙化过程中具有双重作用，维生素D过量主要表现为血管钙化，其机制是维生素D可显著促进骨的重吸收引起高钙血症和MMP增加从而导致血管钙化。近年发现，VSMC表达的维生素D受体（VDR）具有重要的心血管保护作用，其可能是通过负性调节肾素-血管紧张素系统，改善内皮细胞功能，增加利钠肽水平而抑制VSMC增殖及钙化[26]。VDR基因敲除小鼠研究表明，维生素D信号受损与VSMC分化及血管钙化有关。FGF-23、klotho、PTH和1,25-(OH)2D调节磷代谢。胃肠道通过磷酸钠转运蛋白、NaPi-2b(SLC34A2)和PiT-1(SLC20A1)或旁路吸收磷。在近端肾小管FGF23和PTH通过下调NaPi-2a(SLC34A1)和NaPi-2c(SLC34A3)通道增加肾脏对磷的排泄。Klotho蛋白是FGF-23重要辅因子，通过激活NaPi-2a而促进磷排泄。1,25-(OH)2D通过增加NaPi-2b和调节PTH及FGF23而增加肠道对磷的吸收。过量的无机磷可促进OC的表达加重血管钙化，也可增加钙磷矿物质沉积于血管壁[27]。

8 血管活性因子

AngⅡ除具有强大血管收缩作用，还可促进VSMC增殖、肥大及钙化，近年Jia等研究发现在高磷基础上加入107mol/L的AngⅡ会显著加重VSMC钙化程度，其机制为AngⅡ激活Runx2和NF-κB使VSMC内BMP2表达增加和MGP水平下降，而体外单独加入AngⅡ不会引起VSMC发生钙化[28]。然而，也有实验研究表明AngⅡ通过增加镁进入VSMC，激活AT1R诱导ERK1/2蛋白和抑制经典Wnt/β-catenin信号通路从而抑制高磷诱导的VSMC钙化[29]。血管活性多肽内皮素是具有3个异构体，即ET-1、ET-2、ET-3，其中ET-1可促进VSMC增殖及表型转化。大内皮素（big ET-1）是ET-1的前体，认为是内皮系统激活程度比较准确的指标，临床试验表明其水平升高与冠状动脉钙化呈正相关[30]。醛固酮属于肾上腺盐皮质激素，可以引起组织胶原沉积和纤维化，促进心脏和血管重构，在血管钙化过程中起着重要作用。近来研究发现，醛固酮可显著增加人主动脉VSMC钠依赖性磷酸转运体PIT1、TNFα、MSX2、Cbfa1/Runx2和ALP表达以及ALP活性[31]。

9 钙化相关其他物质

细胞内的硬脂酰CoA脱氢酶（SCD）可降低饱和脂肪酸（SFA）的脂毒性，外源补充SFA或者抑制SCD活性可诱导VSMC矿化[32]。不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸（EPA）通过长链酰基辅酶A合成酶3和核因子κB抑制脂质过氧化从而抑制VSMC钙化形成[33]。高尿酸血症可损伤血管内皮细胞而诱发炎症反应，从而通过氧化应激损伤VSMC和尿酸盐沉积而参与血管钙化。平滑肌细胞和内皮细胞分泌的C-型利钠利尿多肽（CNP）可通过cGMP/PKG途径，减轻β-磷酸甘油导致的VSMC钙化[34]。也有动物实验研究表明高镁离子可抑制高磷诱导的VSMC钙化，可能是通过降低Cbfα1的表达，上调钙化相关抑制因子MGP和OPN的表达来实现的。

结语：VSMC在血管钙化过程中发挥着不可或缺的作用，多种基因、信号通路、细胞因子等调节VSMC向成骨样细胞表型转化，发生表型转化的VSMC又可上调骨转录因子和骨相关蛋白的表达进一步促进血管钙化，在此过程中基质囊泡和外泌体触发血管矿化过程。然而，目前血管钙化机制仍不完善，了解VSMC与血管钙化的相关机制对未来临床预防及逆转血管钙化具有重要意义。

[1]Otsuka F,Sakakura K,Yahagi K,et al. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed?[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2014,34(4):724-36.

[2]Bostrom KI,Rajamannan NM,Towler DA. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens[J]. Circ Res,2011,109(4):564-77.

[3]Leopold JA. MicroRNAs regulate vascular medial calcification[J].Cells,2014,3(4):963-80.

[4]Goettsch C,Hutcheson JD,Aikawa E. MicroRNA in cardiovascular calcification: focus on targets and extracellular vesicle delivery mechanisms[J]. Circ Res,2013,112(7):1073-84.

[5]Hao J,Zhang L,Cong G,et al. MicroRNA-34b/c inhibits aldosterone-induced vascular smooth muscle cell calcification via a SATB2/Runx2 pathway[J]. Cell Tissue Res,2016.[Epub ahead of print]

[6]Kobayashi Y,Uehara S,Koide M,et al. The regulation of osteoclast differentiation by Wnt signals[J]. Bone Key reports,2015,4:713.

[7]Zhu F,Friedman MS,Luo W,et al. The transcription factor osterix (SP7)regulates BMP6-induced human osteoblast differentiation. J Cell Physiol,2012,227(6):2677-85.

[8]Hinoi E,Fujimori S,Wang L,et al. Nrf2 negatively regulates osteoblast differentiation via interfering with Runx2-dependent transcriptional activation[J]. J Biol Chem,2006,281(26):18015-24.

[9]Kim H,Kim HJ,Lee K,et al. alpha-Lipoic acid attenuates vascular calcification via re-versal of mitochondrial function and restoration of Gas6/Axl/Akt survival pathway[J]. J Cell Mol Med , 2012,16(2):273-86.

[10]Dai XY,Zhao MM,Cai Y,et al. Phosphate-induced autophagy counteracts vascular calcification by reducing matrix vesicle release[J]. Kid Int,2013,83(6):1042-51.

[11]Jane A. Leopold, M.D .Vascular Calcification: Mechanisms of Vascular Smooth Muscle Cell Calcification[J]. Trends Cardiovasc Med,2015,25(4):267-74.

[12]Derwall M,Malhotra R,Lai CS,et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012,32(3):613-22

[13]Farrokhi E,Samani KG,Chaleshtori MH. Oxidized low-density lipoprotein increases bone sialoprotein expression in vascular smooth muscle cells via runt-related transcription factor 2[J]. Am J Med Sci,2015,349(3):240-3.

[14]Chen NX,O'Neill KD,Chen X,et al. Activation of arterial matrix metalloproteinases leads to vascular calcification in chronic kidney disease[J]. Am J Nephrol,2011,34(3):211-9．

[15]刘珠慧,陆林,沈卫峰. CTRP蛋白家族与动脉粥样硬化[J]. 国际心血管病杂志,2013,40(2):85-7.

[16]Kapustin AN,Shanahan CM. Calcium regulation of vascular smooth muscle cell-derived matrix vesicles[J]. Trends CV Med,2012,22(5):133-7.

[17]Yana D,Diana K,Jeremy N.S,et al. Fetuin-A and Albumin Alter Cytotoxic Effects of Calcium Phosphate Nanoparticles on Human Vascular Smooth Muscle Cells[J]. PLoS One. 2014,9(5): e97565.

[18]Callegari A,Coons ML,Ricks JL,et al. Increased calcification in osteoprotegerin-deficient smooth muscle cells: Dependence on receptor activator of NF-kappaB ligand and interleukin 6[J]. J Vasc Res,2014,51(2):118-31.

[19]Shan PF,Lu Y,Cui RR,et al. Apelin attenuates the osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells[J]. PLoS One,2011,6(3):e17938．

[20]Norman PE,Powell JT. Vitamin D and cardiovascular disease[J]. Circ Res,2014,114(2):379-93.

[21]Lim K,Lu TS,Molostvov G,et al. Vascular Klotho deficiency potentiates the development of human artery calcification and mediates resistance to fibroblast growth factor 23[J]. Circulation,2012, 125(18):2243-55.

[22]Shao JS,Cheng SL,Pingsterhaus JM,et al. Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals. J Clin Invest,2005,115(5):1210-20.

[23]Brodeur MR,Bouvet C,Barrette M,et al. Palmitic acid increases medial calcification by inducing oxidative stress[J]. J Vasc Res.,2013,50(5):430-41.

[24]Miyazaki-Anzai S,Masuda M,Demos-Davies KM,et al. Endoplasmic reticulum stress effector CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) regulates chronic kidney diseaseinduced vascular calcification[J]. JAHA,2014,3(3):e000949.

[25]Osako MK,Nakagami H,Koibuchi N,et al. Estrogen inhibits vascular calcification via vascular RANKL system: common mechanism of osteoporosis and vascular calcification[J]. Circ Res,2010,107(4):466-75.

[26]Bozic M,Alvarez A,de Pablo C,et al. Impaired vitamin d signaling in endothelial cell leads to an enhanced leukocyte-endothelium interplay: implications for atherosclerosis development[J]. PLoS One,2015,10(8): e0136863.

[27]Lomashvili KA,Narisawa S,Millan JL,et al. Vascular calcification is dependent on plasma levels of pyrophosphate[J]. Kid Int,2014,85(6):1351-6.

[28]Jia G,Stormont RM,Gangahar DM,et al. Role of matrix Gla protein in angiotensin II-induced exacerbation of vascular calcification[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2012,303(5):H523-H532.

[29]Herencia C,Rodríguez-Ortiz ME,Muñoz-Castañeda JR,et al.Angiotensin II prevents calcification in vascular smooth muscle cells by enhancing magnesium influx[J]. Eur J Clin Invest,2015,45(11):1129-44.

[30]Qing P,Li-XL,Zhang Y,et al. Association of Big Endothelin -1 with Coronary Artery Calcification[J]. PLoS One,2015,10(11):e0142458.

[31]Lang F,Ritz E,Voelkl J,et al. Vascular calcification is aldosterone a culprit?[J]. Nephrol Dial Transplant,2013,28(5):1080-4.

[32]Kageyama A,Matsui H,Ohta M,et al. Palmitic acid induces osteoblastic differentiation in vascular smooth muscle cells through ACSL3 and NF-kappaB, novel targets of eicosapentaenoic acid[J]. PLoS One.2013,8(6):e68197.

[33]Duan XH,Chang JR,Zhang J,et al. Activating transcription factor4 is involved in endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis contributing to vascular calcification[J]. Apoptosis,2013,18(9):1132-44.

[34]吴胜英,任永生,汪雄,等. C -型利钠利尿多肽对平滑肌细胞钙化的影响[J]. 郧阳医学院学报(JYMC),2003,22(3):133-7.

R543

A

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1150001 哈尔滨,哈尔滨医科大学附属第一医院老年病科

冯景辉,E-mail:irene123feng@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.11.33

田洪榛，田国祥