肿瘤的液态活检

钟荣斌，王友亮

·述 评·

肿瘤的液态活检

钟荣斌，王友亮

肿瘤的液态活检主要是指对肿瘤患者体液样本中多种肿瘤标志物和细胞的检测，包括肿瘤标志物分子、循环肿瘤细胞、循环肿瘤 DNA 和外泌体。 液态活检是一种新兴的非侵入式分子病理检测方法，对肿瘤的早期诊断、实时监测、预后分析和复发的风险评估等方面具有重大应用价值。 作者主要从分子检测技术和临床应用等方面综合阐述液态活检在肿瘤诊疗领域的应用前景及面临的挑战。

液态活检；循环肿瘤细胞；循环肿瘤 DNA；外泌体

传统的肿瘤诊断方法主要为组织学方法，是将取自患者体内的肿瘤组织制成切片，置于显微镜下观察形态学的变化或者进行免疫组织化学分析实验，由于其结果准确性高，因此被誉为肿瘤诊断的“ 金标准”[1]。 组织学检测是针对手术或者活检取材后的肿瘤组织进行的，取材均应保证足够的肿瘤细胞，尽量剔除非肿瘤组织和细胞。 这存在许多弊端，首先是肿瘤组织的获取是侵入性的有创操作，难以用于常规检查。对于肿瘤晚期不能耐受手术或者腔镜检查的患者来说，无法取得肿瘤组织进行相关基因的检测。其次是肿瘤的异质性，无法保证检测的肿瘤组织具有代表性，会导致检测结果的偏差。再次是基因状态的改变，随着药物的使用，机体融合基因的表达或突变状态可能发生改变，从而导致机体对药物的敏感性发生改变，无法实现肿瘤的早期诊断、疗效评价和实时监测[2]。 液态活检是对体液进行的检测，通过检测肿瘤细胞释放到体液中的标志物信息，从而获得患者体内肿瘤基因或者蛋白表达的全面信息。液态活检的主要检测物包括肿瘤标志物分子[3]、循 环 肿 瘤 细 胞(circulating tumor cells，CTCs)[4]、 循 环 肿 瘤 DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)[5]和外 泌 体[6]。 液 态 活 检 的样 本 主要 是 血液，其他的还有尿液、唾液、乳汁、胸水和脑脊液等体液[7]。 作者主要综合阐述液态活检的主要检测物、常用检测技术和在肿瘤诊治领域的一些应用。

1 液态活检的主要检测物

1.1 典型的肿瘤标志物分子 肿瘤标志物分子是指在恶性肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身癌症相关基因表达产生或机体对抗肿瘤产生反应而异常表达的一类可以反应肿瘤存在和增殖状况的物质[8]。 血液中存在许多肿瘤细胞产生的生物分子，与肿瘤的类别、增殖状况等息息相关。肿瘤抗原(cancer antigen，CA)15-3 最早是在乳腺癌患者体内发现的，确认为乳腺癌细胞表面过表达的 MUC-1 在血液中的分泌形式，因此被看做是乳腺癌标志物[9]。研究发现在肺癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌患者体内均能检测出 CA15-3[10]，表明 CA15-3 的敏感性和特异性不是很高，其诊断价值相对较低。 但是研究表明，转移型乳腺癌患者术前 CA15-3 含量升高预示无病生存率和总体生存率低[11]，所以 CA15-3 可应用于肿瘤早期转移的检测。癌胚抗原是血清中一种广谱的肿瘤标志物明星分子，且常与 CA15-3 联合用于肿瘤的预后分析[12]。 在一项1 681例乳腺癌 患者预后分析研究中发现，单独的癌胚抗原在肿瘤的诊断上并不理想，但是当癌胚抗原与 CA15-3 联合检测时，分析的敏感性和特异性都有大幅度提高，所以认为2种肿瘤标志物的联用将会是一个有效的乳腺癌患者术后随访指标[13]。 血液中 还 存 在许多种类型的肿瘤标志物分子，如细胞角蛋白 19 片段[14]、胃泌素释放肽前体[15]、神经特异性烯醇化酶[16]等，在肿瘤的早期诊断中是一个非常重要的参考指标。

1.2 CTCs 血液中 CTCs 的发现最早可以追溯到1869 年，Ashworth[17]发现转移肿瘤患者血液中可能存在一些与原发灶肿瘤组织同源的细胞。受当时检测手段的限制，这一发现并未引起人们的关注。 如今普遍认为 CTCs是由肿瘤原发灶或转移灶脱落进入血液循环中含量非常低的肿瘤细胞[18]。 在大部分恶性肿瘤患者血液中均能检测出 CTCs，CTCs 的数量常与患者的预后密切相关[19]。 CTCs 在血液中的半衰期通常是 1.0 ～ 2.4 h[20]，这一特点使得 CTCs能够为肿瘤的个体化治疗过程提供即时的肿瘤病理进程信息，实时监测疗效。 随着研究的深入，发现许多恶性肿瘤患者外周血循环中的 CTCs不仅能以单细胞形式存在，也能呈簇状聚集形成循环肿瘤微栓[21]。 循环肿瘤微栓出现的机制可能有多种，包括保持 CTCs细胞间的信息交流、产生自分泌促转移因子及 逃 逸 机 体 的 免 疫 应 答[22]。 临 床 试 验 表 明，CTCs 是肿瘤血路转移的重要途径[23]。

1.3 ctDNA 1948 年，Mandel 和 Metais[24]首次 注意到外周血循环中存在一些裸露的游离 DNA 片段(cell-free DNA， cfDNA) 。 1977 年， Leon 等[25]注 意到 cfDNA 含量会随着肿瘤治疗的进程发展而出现波动，因此推测其中一部分 cfDNA 源自于肿瘤细胞，称其为 ctDNA。 研究发现，ctDNA 片段普遍短于cfDNA[26]。 但是 ctDNA 的入血机制尚不明确，目前存在3种不同的观点:一是来自于凋亡或者坏死的肿瘤细胞；二是来自于增殖中的肿瘤细胞；三是来自于血液 中 的 CTCs[27]。 研 究 发 现， ctDNA 的 半 衰 期大约为 2 h， 这 使 得 以 ctDNA 为 标 志 物 实 时 监 测 肿瘤疗效成为可能[28]。

1.4 外泌体 胞外囊泡最早发现于网织红细胞的成熟过程[29]，随后发现几乎所有类型的细胞都能正常分泌这些在细胞间起信息交流作用的胞外囊泡，并且广泛存在于血液、尿液、胆汁、唾液和脑脊液等多种体液中[30]。 随着研究的深入，科学家发现这些胞外囊泡大致可以分成微囊泡、凋亡小体和外泌体3大类，其中外泌体参与多种生理病理过程逐渐成为热门研究领域。 外泌体中携带有多种蛋白质、活性脂质、细胞表面受体以及信使 RNA 和微小 RNA (microRNAs，miRNAs)等，来源于肿瘤细胞的外泌体可以反应肿瘤的蛋白质表达谱变化和基因变异信息，外泌体能在 4 ℃ 保存 7 d 或是在-80 ℃ 保存更长时间[31]，这些特点使得外泌体可应用于肿瘤的早期诊断和预后判断，在临床肿瘤学领域表现出了强大的应用前景[32]。

2 液态活检常用检测技术

2.1 肿瘤标志物分子的检测技术 由于肿瘤标志物分子大多为蛋白质分子，所以基本原理都是利用了蛋白质间的相互作用这一特点。标志免疫分析法是最常用的肿瘤标志物检测方法，通过检测特异标志物与待测肿瘤标志物分子的结合信号来达到检测目的，包括放射免疫分析法、酶联免疫分析法和化学发光免疫分析法等。此类方法敏感性与特异性均较好，且操作简单、成本低。 另一类是肿瘤蛋白质芯片技术，此方法具有连续化、高通量、高敏感性和高特异性的优点。

2.2 CTCs 的检测技术 基于免疫吸附的 CellSearch技术，是唯一获得美国食品药品管理局批准应用于临床 CTCs 检测 的技 术。 但 是 此 方 法主 要 依赖 于CTCs上表达的上皮细胞黏附分子，受肿瘤的异质性和 CTCs上皮间质转化影响较大。 另一种是膜过滤肿瘤细胞分离法，此方法是基于 CTCs体积来实现细胞分离，因此较适用一些异质性明显的恶性肿瘤，对于一些体积小的 CTCs来说则容易得到假阴性的结果。 目前开发出了多种新一代的 CTCs检测技术如 DEPArray 和 GILUPI CellColector 技术，在 获 取单个 CTC 进行后续分析实验方面具有较大优势[33]。

2.3 ctDNA 的检测技术 ctDNA 在血液中的含量很低，约占 cfDNA 总量的 1%，因此对检测技术敏感性和特异性要求高。目前常用检测技术有数字聚合酶链反应、BEAMing 和新一代高通量基因测序等方法[34]。

2.4 外泌体的检测技术 外泌体含量较为丰富，易于富集，常用的提取方法有超速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、免疫磁珠法、酶联免疫吸附法和聚合法等。 Yoshioka 等[35]开发了一种快速高敏感性的外泌体检测分析新技术，相比于传统检测技术，该技术具有步骤少、耗时低、通量大等优点。

3 液态活检在肿瘤中的应用

3.1 肿瘤的筛查和早期诊断 目前肿瘤的筛查多通过影像学检查，然而影像学检查往往难以发现早期肿瘤；肿瘤的确诊需依据组织病理学检验，但获取病变组织会给患者带来创伤甚至造成医源性肿瘤扩散。液态活检的出现在一定程度弥补了临床常规检查的不足。 研究表明，在影像学检查无肺癌的慢性阻塞性肺病患者中，CTCs检测阳性的患者在 1～4年后均相继由 CT 检查确诊为肺癌，并且发现 CTCs异常表达上皮和间质标志物[36]。 肿瘤早期 ctDNA检测难度大，敏感性较低[37]。 肿瘤外泌体的分子表型可以反应肿瘤细胞的部分表型和基因型，已有多种肿瘤特异性抗原和 miRNAs 被验证可以作为肿瘤标志物分子，用于辅助诊断肿瘤的发生[38]。 胰腺癌血清中外泌体携带胰腺癌干细胞标志物，外泌体中磷脂酰肌醇蛋白聚糖 1(glypican 1，GPC1) 的检测能区分慢性胰腺炎患者与早期和晚期胰腺癌患者，相比胰腺癌最常用的诊断血清标志物 CA19-9，GPC1＋crExos 似乎是一种更可靠的筛查工具。 在胰腺癌小鼠模型中，MRI还未检测到胰腺疾病迹象时，GPC1＋crExos 就检测到了胰腺癌的干细胞标志物[39]。

3.2 肿瘤治疗的耐药性检测及实时疗效监测 乳腺癌细胞上的雌激素受体(estrogen receptor，ER) 是激素治疗的一个重要靶点，但是 ER 阳性的乳腺癌细胞也可以隐藏有 ER 阴性的 CTCs从而产生耐药性。 最近 Paoletti 等[40]设立了一个 CTCs 内分泌治疗指数，用于预测转移型乳腺癌对内分泌治疗的耐药性。 该指数综合考虑了 CTCs 数量及其表达的ER、B 细胞淋巴瘤/白血病-2、人类表皮生长因子受体-2 和 Ki-67 的 4 种标志物对治疗的影响，在指导治疗用药方面具有重大意义。检测前列腺癌中CTCs上的特异性前列腺抗原与雄激素受体，有助于预测雄 激 素 受 体 靶 向 疗 法 的 临 床 结 果[41]。 检 测ctDNA 基因突变信息可以反应某些靶向药物的疗效，如监测肺癌细胞表皮生长因子受体基因突变、结直肠癌细胞鼠类肉瘤病毒癌基因突变、乳腺癌细胞TP53 与 PIK3CA 基因突变以及前列腺癌雄激素受体基因突变等对疗效的影响，实时监测治疗效果[20]。

3.3 肿瘤的分期及预后评估与复发风险评价 血液系统是肿瘤转移的重要途径，是否发生远处转移是判断临床分期的标准之一。在美国癌症联合委员会 2010 年制定的肿瘤淋巴结转移 (tumor node metastasis，TNM)分期指南中，已将缺乏影像学证据但在外周血、淋巴结和骨髓中能检测到 CTCs 的远处转移时期定位为 cM0(i＋) 期，出现在 M0 和 M1 之间，作为 TNM 传统分期系统的有效补充。 此外CTCs的数量与肿瘤的预后密切相关，临床上将每7.5 mL 外周血中 CTCs 含量作为一项独立的预后分析因素。 在一项乳腺癌晚期患者 CTCs计数研究中发现:CTCs≥5 个的患者肿瘤发生转移的比例高，CTCs＜5 个的患者肿瘤转移的可能性低；并且术前CTCs≥5 个的患者肿瘤的复发率也较高[42]。 还有实验表明，CTCs数量与肿瘤患者无病生存率和总体生存率关系密切[43]。 研究表明，外周血 ctDNA 中出现多拷贝的肿瘤相关基因突变如 BRF1、MTA1、DUB3 和 JAG2 都预示着肿瘤治疗的临床疗效不理想[44]。 另外，有研究发现外泌体中特异 miRNA 的水平与肿瘤状态、分期、侵袭性及对治疗的敏感性高度相关[45]。

液态活检作为一种新兴的非侵入式检测方法，因其样本是体液，特别是血液，取材途径简便，可做到随时取样、随时分析、具有无滞后性并且重复性好的特点。 在肿瘤的早期诊断、病程分析、疗效监测、预后判断及复发风险评价上展露出了强大的应用前景，弥补了组织病理学检查的一些短板。 尽管液态活检的检测技术在不断地改进，敏感性和特异性不断提高，然而始终未能达到理想状态。 目前液态活检还处于起步阶段，研究分析的结果还需通过大量大规模的临床试验来验证，进而推广应用。 随着后基因组时代的高速发展，液态活检将会挖掘更多的肿瘤相关的生物信息，提供更丰富、可靠的诊疗手段，为肿瘤患者带来新的福音。

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Liquid biopsy for cancers

ZHONG Rongbin， WANG Youliang
(Laboratory of Cell Engineering， Institute of Biotechnology， Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071， China)

The detection of tumor-derived molecular biomarkers and cells that mainly exist in the bloodstream and other body fluids from patients with cancer， known as the liquid biopsy， which involves identified tumor markers， circulating tumor cells， circulating tumor DNA and exosomes.As an emerging kind of non-invasive molecular pathological technique， it can be used for a variety of clinical applications， including the early diagnostic of cancer， real-time monitoring of tumor progression， risk assessment of relapse and prediction of prognosis in patients with cancer.In this article，advances in the novel techniques and clinical applications as well as the challenge for liquid biopsy will be reviewed.

Liquid biopsy； Circulating tumor cells(CTCs) ； Circulating tumor DNA(ct-DNA)； Exosomes

R730.4

A

2095-3097(2017)01-0001-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.01.001

2016-12-18 本文编辑:张在文)

国家科技重大专项(2016ZX08006002-004)；北京市自然科学基金(7172160)

100071 北京，军事医学科学院生物工程研究所细胞工程研究室(钟荣斌，王友亮)