联合用药靶向胶质母细胞瘤样干细胞的治疗进展

李浩诣，汪 云，黄 科

(第三军医大学基础部组织学与胚胎学教研室，重庆 400038)

联合用药靶向胶质母细胞瘤样干细胞的治疗进展

李浩诣，汪 云，黄 科

(第三军医大学基础部组织学与胚胎学教研室，重庆 400038)

肿瘤干细胞；胶质母细胞瘤；联合用药；恶性胶质瘤；肿瘤靶向治疗

胶质母细胞瘤作为常见的恶性胶质瘤，其等级系数高，致死性强。随着肿瘤干细胞理论的提出，为肿瘤靶向治疗提供了新的途径。通过联合用药抑制生长机制，阻止胶质母细胞瘤样干细胞的增殖，从而为靶向治疗恶性胶质瘤提供了可能。本文就联合用药靶向胶质母细胞瘤样干细胞进行简要综述。

1 介绍

肿瘤的发生是一群失控的同质性的肿瘤细胞所组成，每个肿瘤细胞都具有独立无限增殖的能力，并且通过转移侵入其他机体组织造成肿瘤细胞的扩散[1]。近年来，由于有些肿瘤细胞与干细胞具有相似的特性包括信号传导通路、转录因子、细胞表面受体等，并提出了肿瘤干细胞的假说。该学说认为，肿瘤的发生与肿瘤干细胞有关，为肿瘤靶向治疗提供了新的突破点。传统意义上的肿瘤治疗包括手术切除、化疗和放疗，针对性并不强，恶性肿瘤的预后较差，术后生存率不高，复发的可能性也较大[2-4]。并且肿瘤细胞伴有较强的耐药性机制，对传统疗法并不敏感[5]。因此，联合靶向疗法为肿瘤治疗提供了新的途径。

2 干细胞与肿瘤干细胞

2.1 干细胞 干细胞具有持续自我更新并能够促使同类细胞的成熟以及暂时扩增细胞子代数量的潜能和相应机体细胞的增殖能力。另外，这类干细胞拥有分化潜能，可以分化成体内的各类组织，主要负责组织的再生和修复[6-8]。总之，干细胞是一类高等动物体内未充分分化、具有自我更新和多向分化潜能的细胞。

2.2 肿瘤干细胞 在CD34+/CD38-表型的人急性髓性白血病、乳腺癌以及各细胞层次间都发现了一类具有自我更新、增殖能力，并与肿瘤细胞有相似特性的异质性细胞[8-10]。在恶性肿瘤初期的生长发育中，由一群在形态和表型方面具有致瘤性潜能的细胞亚群所构成[11-15]，在一定程度上具由自我更新、不定向分化潜能[16-17]、异位再生性及高度耐药性。肿瘤干细胞通过不对称分裂方式进行增殖，在不同的环境内具有成瘤特性，其细胞膜表面的ABC转运体异常的发达，抗药性较强[18]。同样，肿瘤干细胞是一群具有异质性的细胞群体，其细胞膜表面抗原、细胞浆内的蛋白、生物效应、增殖速率、代谢程度以及系统抗药性各不相同[8,19-20]。多数信号级联因子和能够介导正常生理干细胞行为的基质原件间相互作用及其正常发展过程都已被认为在肿瘤生长初期和发展过程中扮演了不可缺少的角色[21]。目前对于胶质瘤干细胞的研究表明，胶质瘤干细胞常用的标志物是CD133+和CD15+,而CD15+是胶质母细胞瘤具有胶质母细胞瘤样干细胞的特征且具有更高的致瘤性[22-24]。根据目前已达成的共识定论，肿瘤干细胞是一类在肿瘤组织内拥有自我更新、不对称分化并具有致瘤潜能的异质性干细胞[25],其结果是维持肿瘤干细胞数目稳定并产生肿瘤。

2.3 干细胞与肿瘤干细胞的异同 肿瘤干细胞与干细胞之间的相似点：1)干细胞与肿瘤干细胞之间具有相似的表面抗原；2)两者生长发育都具有较高的端粒酶活性；3)干细胞与肿瘤干细胞都具有自我更新、无限增殖和不对称分化的能力；4)具有相似的信号转导通路，其代表性的通路包括Wnt、Notch、Sonic Hedgehog、EGFR等通路，这些都是目前认为在干细胞生长发育及分化中其重要作用的信号转导途径；5)两者具有多数相同的转录因子，包括Sox2、Oct4、Nanog等，对维持干细胞的干性，调节干细胞的生长发育具有重要的意义[26-27]；6)干细胞与肿瘤干细胞有相似的重力密度。但两者之间依然存在不同的特点：1)肿瘤干细胞通过不对称分化，增殖产生异质性的肿瘤细胞；2)肿瘤干细胞在肿瘤中含量非常低，但其致瘤性强[28-29]；而在机体各个组织中，都存在干细胞，其作用一般是对机体损伤进行一定的修复作用；3)肿瘤干细胞的细胞膜表面ABCG2异常活跃，其耐药机制较强[18]。

2.4 胶质母细胞瘤 胶质母细胞瘤被WHO组织认定为第4级星形胶质瘤，即使通过外科手术切除，放疗和化疗的方式来抑制胶质母细胞瘤的增殖，然而其治疗效果并不明显[5,30]。早期研究[31-32]证明胶质母细胞瘤样干细胞对传统化疗及放疗都有一定的抵抗特性。由于胶质母细胞瘤样干细胞可能与胶质母细胞瘤复发有一定的内在联系[33-36]。因此，传统疗法已经不能满足治疗的需求。

3 联合靶向治疗胶质母细胞瘤样干细胞

3.1 阿司匹林联合替莫唑胺靶向治疗胶质母细胞瘤样干细胞 目前，在临床胶质母细胞瘤治疗中，广泛使用且能够抑制胶质母细胞瘤增殖的药物是替莫唑胺。替莫唑胺的用药标准是每周期28 d以内，每次持续用药5 d，每天使用150～200 mg·m-2[37]。然而恶性胶质瘤的多抗药性较强，替莫唑胺半寿期短，不良反应较明显，对肿瘤的杀伤力较弱，靶向治疗并不明显。在胶质瘤样干细胞中，Wnt、STAT3通路活性较为明显。因此,Shi等[38]提出利用阿司匹林联合替莫唑胺用药通过抑制Wnt通路治疗胶质母细胞瘤。有研究[39-40]通过poly诱导合成微球，利用喷雾干燥技术，将胶质母细胞瘤细胞毒性分别注入含有阿司匹林、替莫唑胺以及阿司匹林联合替莫唑胺的微球中，结果发现：利用阿司匹林微球治疗通过抑制Wnt通路的转录活性，可诱导体外具有活性的Ln229和U87细胞轻微的凋亡，并抑制其轻微的增殖。然而，与替莫唑胺单独治疗胶质母细胞瘤相比，阿司匹林与替莫唑胺的联合用药对于胶质母细胞瘤的抑制更加明显。其可诱导Ln229和U87细胞较明显的凋亡并抑制其增殖，对β-catenin信号、β-catenin/TCF4转录活性的抑制应答、STAT3荧光素酶都具有较强的抑制作用以及下游的靶基因在一定程度上具有下调的趋势，在肿瘤干细胞中β-catenin/tcf4转录活性较高。

3.1.1 阿司匹林与替莫唑胺用药与信号转导通路

3.1.1.1 Wnt信号转导通路 Wnt信号通路在多数器官组织中具有高度的保守性，对胚胎学的发展具有重要的意义，并且在控制细胞自我更新、调节干细胞以及肿瘤干细胞的生长发育中维持相对稳定的平衡[41-43]。Wnt信号通路通常被Wnt信号配体激活，Wnt蛋白可与细胞表面Frizzled家族特殊受体及LRP家族相关的低密度脂蛋白受体复合物结合。促使细胞质中的松散蛋白聚集至细胞膜下，松散蛋白可诱导GSK-3β发生磷酸化，使其与Axin脱离，拮抗Axin/GSK-3β复合物的形成，进而阻断β-catenin的磷酸化、泛素化降解，使得大量游离的β-catenin在细胞质聚集并进入细胞核内。在细胞核内，β-catenin将会与TCF/LEF家族的转录因子相结合，并启动激活下游的靶基因[43]。转录相关蛋白，调节细胞的增殖及分化。在阿司匹林与替莫唑胺联合用药的治疗中，阿司匹林可抑制Wnt通路中β-catenin/tcf4的转导活性，同时能够提高替莫唑胺对β-catenin转录活性的抑制效应。通过测定Ln229和U87细胞，不难发现，阿司匹林通过抑制β-catenin转录活性，从而抑制胶质瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡[38]。

3.1.1.2 STAT3信号转导通路 STAT3在神经干细胞、星形胶质细胞的生长发育中具有重要的作用[44]，其依据肿瘤的基因型，在胶质母细胞瘤致瘤和抑瘤方面扮演着重要的角色[45]。在神经细胞中，STAT3能够被睫状节神经细胞营养因子家族细胞活素受体激活，目的是STAT3能够激活与络氨酸激酶相关的JAK细胞活素受体。随后，STAT3被募集到细胞活素受体上，当第705号Tyr残基被磷酸化后，STAT3被激活[44]。STAT3也可以被具有络氨酸激酶活性的生长因子受体直接激活，例如EGFR。在胶质母细胞瘤中STAT3的mRNA的水平与患者无进展生存期以及总存活数有关[46]。STAT3也可与诱导的一氧化氮合成酶和EGFR相互作用提高胶质瘤的形成[47]。在胶质母细胞瘤样干细胞中，STAT3信号通路是非常活跃的，其能够保持细胞的存活，增殖能力以及多功能干性，并对胶质母细胞瘤的生长有着重要的作用[48-50]。在胶质母细胞瘤样干细胞中通过诱导G1期阻滞并造成Cyclin D1下调和p21WAF1/CIP1上调来抑制STAT3通路，从而调节细胞周期。STAT3的抑制也可造成在胶质母细胞瘤样干细胞中CD133+和c-Myc表达下调，并造成细胞凋亡[51]。

3.1.2 阿司匹林与替莫唑胺联合用药对肿瘤干细胞内信号转导通路的影响 恶性胶质瘤的表型源于与细胞生长发育调节通路有内在关系的多能机制障碍[52]，其中对胶质瘤干细胞生长最具影响的通路之一是Wnt/β-catenin信号通路，其通过β-catenin/TCF4转录复合体激活并作为下游相关效应物激活的中心信号转导通路，包括AKT1[53]、AKT2[54]、和STAT3[55]。β-catenin的过度表达，不仅能维持恶性胶质瘤细胞的表型，也能通过抑制恶性胶质细胞的凋亡从而提高细胞的活性并提升细胞的多抗药性能力[56-57]。

阿司匹林不仅对β-catenin信号有较明显的抑制，而且也是作为临床上广泛使用的抗炎类药物。服用阿司匹林能够减少某些长期腺癌的发病率，并且在药理学方面能证明，阿司匹林对肿瘤细胞远端转移有一定的阻碍作用[58]。因此选用阿司匹林治疗恶性胶质瘤，目的是为了提高替莫唑胺的药效，对β-catenin通路的靶向抑制，从而提高恶性胶质瘤的治疗效果。

通过研究胶质瘤干细胞的表型发现，AKT信号的过度表达，能抵抗替莫唑胺的药性[59-60]，在胶质母细胞瘤和恶性黑素瘤中，敲除PI3K/AKT信号因子能够提高替莫唑胺的治疗效果[61-62]。STAT3在胶质母细胞瘤中存在一定程度的表达，其是致瘤的关键转录因子，能够提高恶性胶质瘤细胞的增殖和侵入力，亦能提高血管的再生能力，为恶性肿瘤的生长提供丰富的血供[63]。Bcl-2是调节细胞凋亡的关键因子，其表达与恶性肿瘤的发展与多抗药性有关[64]， AKT与STAT3的表达下调，同样可抑制Bcl-2的表达[57,65]。因此通过阿司匹林和替莫唑胺微球实验后，发现AKT的表达在Ln229和U87胶质细胞中表达都有下调，STAT3对替莫唑胺烷基化能力下降，说明STAT3在一定程度上减少。阿司匹林和替莫唑胺微球实验证明，通过敲除β-catenin信号转导通路，从而介导减少Bcl-2的表达、降低胶质母细胞瘤样干细胞的多抗药性、抑制其增殖并促进凋亡，提高替莫唑胺的治疗效果。

3.2 Anti- galectin-1 siRNA与Anti-EGFR siRNA联合降低胶质母细胞瘤样干细胞对替莫唑胺的抗药性 EGFR在肿瘤的发展中起到了关键的因素，能够提高肿瘤干细胞的生长及对药物的抗性，galectin-1是一种细胞表面的糖蛋白，在肝肿瘤干细胞中的表达可能较活跃[66-67]。因此，Danhier等[68]提出利用Anti-galectin-1 siRNA和Anti-EGFR siRNA联合，以壳聚糖接枝脂质纳米胶囊为载体，通过CED方式将药物注入到小鼠体内以及U87细胞培养基中，再将替莫唑胺注入，结果发现，肿瘤生长明显被抑制，从肿瘤干细胞学说角度说明，此联合用药对肿瘤干细胞的增殖起到了明显的抑制。

3.2.1 siRNA与壳聚糖接枝脂质纳米胶囊靶向肿瘤干细胞的特点 siRNA是由21～23个核苷酸组成的双链RNA，其能够激发与之互补的目标mRNA的沉默。单独使用siRNA治疗是有几个不利的条件：1)siRNA带负电荷，无法穿过细胞膜与胞浆内的靶分子结合[69-71]；2)siRNA被注入到血液中后，呈现在血液和细胞浆中的核酸酶会使siRNA快速变性失活；3)血液中的免疫作用可能也会使siRNA变性失活[72]。壳聚糖接枝脂质纳米胶囊作为EGFR抗体和galectin-1抗体siRNA的载体，其有利条件：1)移接的几丁聚糖具有正电性；2)无毒性并具有生物学适应性[73]。目前，siRNA治疗成为现今医学抑制肿瘤增殖的热点，利用siRNA靶向治疗肿瘤干细胞，干扰其细胞浆内具有分裂，增殖表达的mRNA,从而达到对肿瘤治疗的目的。

3.2.2 Anti-galectin-1 siRNA与Anti-EGFR siRNA联合替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤 在肿瘤细胞中，过表达的EGFR和galectin-1能够导致对替莫唑胺明显的抗药性[74]。在40%～70%的肿瘤患者中，肿瘤细胞内的EGFR都存在过表达和较活跃的特性。这说明特异性的突变EGFR形成和表达将提高肿瘤的增殖能力[75-76]。同样，EGFR在胶质瘤干细胞中也起到了关键性的因素，其在胶质瘤干细胞中的mRNA分子水平较高[75]。利用siRNA治疗后，将肿瘤中EGFR和galactin-1敲除,我们发现，siRNA的活性效应持续近1周，这说明了siRNA活性的短暂特性[66]。因此，依据肿瘤是否被治疗，肿瘤细胞内的组成成分不尽相同[77]。

利用Anti-galactin-1 siRNA与Anti-EGFR siRNA联合治疗胶质母细胞瘤，发现胶质母细胞瘤的增殖抑制较明显，通过上述研究得知，胶质母细胞瘤细胞中galactin-1与EGFR的mRNA表达水平明显降低[68]。总之，Anti-galectin-1 siRNA与Anti-EGFR siRNA联合能够降低胶质瘤干细胞对替莫唑胺的抗药性，从而达到抑制胶质母细胞瘤增殖的目的。

4 联合用药靶向胶质母细胞瘤样干细胞的治疗意义

联合用药治疗胶质母细胞瘤样干细胞是当今的肿瘤医学热点。Zhao等[78]通过盐酸厄洛替尼与紫草醌联合降低EGFR的磷酸化，从而有可能降低胶质母细胞瘤对盐酸厄洛替尼的抗药性，达到治疗胶质母细胞瘤的疗效。EGFR在肿瘤干细胞中表达较高，很可能是降低肿瘤干细胞表面的EGFR，来抑制肿瘤干细胞的增殖,导致肿瘤生长停滞。联合用药靶向治疗恶性肿瘤的意义：1)从根源上抑制肿瘤的增殖;2)对肿瘤干细胞细胞表面的标志物靶向性更强;3)通过联合用药能够增加肿瘤干细胞及肿瘤细胞表面的通透性，降低其抗药能力，利于药物的吸收;4)联合用药能够提高药物的药效特性，对恶性胶质瘤干细胞的杀伤力更强。目前，联合用药治疗针对胶质母细胞瘤样干细胞治疗依然处于基础医学研究中，尚未在临床中施行。

5 问题与展望

随着目前肿瘤干细胞学说的兴起，对于胶质母细胞瘤的治疗也不仅局限于单一的药物。虽然如此，但仍有许多关键问题尚未解决，如联合用药是否对血脑屏障起到一定的损伤作用，对机体的毒副反应是否更强，以及靶点是否有效等问题，目前还尚未研究清楚，因此，联合用药治疗肿瘤干细胞可以说打破了传统的治疗方式，但是更多的机制需要进一步的研究才有可能从根本上找到治疗肿瘤的方法。

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李浩诣(1995-)，男，学士在读，参与胶质瘤干细胞增殖分化相关研究。E-mail:627269051@qq.com

汪云(1980-)，女，博士，讲师，主要从事胶质瘤干细胞增殖分化相关研究。E-mail：yunwang30@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.01.029

R739.4；R730.54

A

1673-5412(2017)01-0088-06

2015-07-23)