基于肌红蛋白构筑新型生物催化剂*

张芳芳， 徐甲坤， 王 芳， 郭 辉， 梁兴国

(1. 中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东 青岛 266071)

基于肌红蛋白构筑新型生物催化剂*

张芳芳1，2， 徐甲坤2**， 王 芳2， 郭 辉1， 梁兴国1

(1. 中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东 青岛 266071)

利用计算机模拟与基因工程相结合的方法，对抹香鲸肌红蛋白活性中心疏水空穴进行设计，重点研究了肌红蛋白活性部位68、107位置的氨基酸(大小、疏水性)对肌红蛋白催化性能的影响。设计、制备、表达并纯化了H64D/I107V、H64D/I107A和H64D/I107G三种变体，测试了不同变体对吲哚羟基化反应的催化性能，并通过计算机模拟阐明肌红蛋白活性部位构筑与其催化性能之间的联系。研究表明：H64D/I107V、H64D/I107A和H64D/I107G三种变体均能催化吲哚的羟基化反应，kcat分别为10.6、9.2和25.2 min-1；证明了107位置氨基酸的空间位阻效应和68位置氨基酸的疏水性能够显著影响底物在蛋白活性部位的空间构象，进而影响肌红蛋白的催化性能。研究结果为基于肌红蛋白新型生物催化剂的开发提供了新的实验依据与理论基础。

生物催化剂；肌红蛋白；基因突变；催化性能；计算机模拟

肌红蛋白(Myoglobin，见图1)由一条153个氨基酸组成的肽链(珠蛋白)和一个血红素(Heme)辅基组成[1]，其生理功能为氧气的储存和运输[2]，其本身并不具有催化功能。肌红蛋白是第一个被X射线阐明三维结构的蛋白质(1962年诺贝尔化学奖)[3-4]，与其他血红素蛋白相比，肌红蛋白具有表达量高、稳定性优异、易于纯化等优点，常被研究者们作为模型蛋白来阐明其它血红素蛋白结构与功能的关系[5-9]，并作为优异的框架材料开发具有新颖功能的蛋白[10-14]。

Yoshihito Watanabe研究小组利用基因定点突变(Site-directed Mutagenesis)技术，模拟其它血红素蛋白活性部位的氨基酸排布，对抹香鲸肌红蛋白(Sperm Whale Myoglobin，swMb)活性部位进行理性设计，成功地赋予了肌红蛋白过氧化物酶、过氧化氢酶和过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶等性能，实现了不同类型血红素蛋白的结构及功能间的相互转化[15-18]。谭相石研究小组和林英武研究小组联合开发的L29E/F43H swMb突变体成功模拟了细胞珠蛋白和神经珠蛋白活性部位的构筑，而他们开发的F43Y swMb突变体则展现了血红素翻译后修饰的多样性[19-21]。这些研究阐明了不同血红素蛋白特定功能的结构要求，诠释了血红素辅基如何被不同的蛋白分子所利用，来执行不同的生理功能。Xu等综合利用计算机模拟与定点基因突变技术模拟细胞色素P450酶活性部位的构筑，改变抹香鲸肌红蛋白活性部位的氨基酸排布，成功赋予其羟基化反应催化能力，能够催化吲哚制备靛蓝，建立了催化效率最高的以过氧化氢为氧化剂制备靛蓝的生物系统[22]。但对于如何通过调控重组蛋白活性部位构筑来优化其催化性能尚缺乏系统性和规律性的认识，仍需要大量丰富而翔实的实验数据来总结完善。

本研究将在前期研究的基础上，综合利用计算机模拟与基因定点突变相结合的方法，以吲哚的羟基化反应为模型反应，研究肌红蛋白活性部位64、107位置的氨基酸(大小、疏水性等)对肌红蛋白催化性能的影响，通过系统分析不同突变体活性部位构筑与其催化性能之间的联系，深入揭示血红素蛋白的构效关系，为新型生物催化剂的开发提供实验及理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器设备 Nanodrop 2000(美国Thermo)、摇床(上海知楚)、CR21GⅢ高速冷冻离心机(日本日立)、TProfessional PCR仪(德国Biometra)、蛋白纯化仪AaktaP900(德国GE Health Care)、Shimadzu 1800紫外-可见光光谱仪(日本岛津)、VCF-1500超声破碎仪(美国SONICS)、DYY-8C电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

试剂 H64D/V68I/I107A、H64D/V68I/I107V质粒由日本名古屋大学Yoshihito Watanabe教授惠赠，Quick site-directed mutant kit 购自于安捷伦，Pst I酶、JM109感受态细胞购自于Takara，DNaseⅠ、溶菌酶、氨苄青霉素购自于索莱宝，DTT、吲哚、吡啶、连二亚硫酸钠购自于阿拉丁试剂有限公司，酵母粉、胰蛋白胨购自OXOID；氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸氢二钾、氢氧化钠、硫酸铵、乙二胺四乙酸二钠、铁氰化钾等常规试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，配置试剂所用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 定点突变 将质粒溶解，用Nanodrop测定质粒浓度，经Pst I酶切，1%琼脂糖电泳检测质粒纯度。用Site-Directed Mutagenesis Kit突变试剂盒进行定点基因突变，引物为I68V F：TGGTGTTACCgtgTTAACTGCCCTAG，R: GAAGACTTCTAGACTTTT TTCT, A107G F: TAGGACCTTAAGccgAGACTTCG，R:GATCATCCATGTTCTGCATTC。PCR(95 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s变性， 60 ℃ 10 s退火， 68 ℃ 1.5 min延伸，68 ℃ 5 min)反应。在I68V引物的作用下，将H64D/V68I/I107A和H64D/V68I/I107V突变为H64D/I107A和H64D/I107V。加入适量限制性内切酶Dpn I酶降解掉不含突变序列的甲基化模板，结束后，4 ℃储存突变质粒。

1.2.2 细胞转化 将突变质粒转化到JM109感受态细胞中。转化完成后取少量菌液涂平板，37 ℃过夜培养。1.2.3 细菌培养 从平板上挑取光滑单菌落，置于3～5 mL LB培养液中，37 ℃，200 r/min，培养6 h，取部分菌液测序，剩下菌液转移至100 mL LB培养基，最后扩大至10 L LB培养液中振荡培养，在对数生长末期离心菌液(4 ℃，8 000 r/min，10 min)，-80 ℃冷冻备用[23]。1.2.4 蛋白纯化 取适量菌体溶于50 mmol/L pH=8.0 Tris-HCl (含1 mmol/L EDTA-2Na，0.6 mmol/L DTT，1 g/L溶菌酶)中，加入2 000 U DNase I并搅拌30 min，超声破碎(60 Hz，4～6次，每次30 s)，4 ℃，15 000 r/min离心30 min，上清液用50%、90%硫酸铵分级沉淀(4 ℃，15 000 r/min，30 min)，离心将沉淀复溶于适量10 mmol/L pH=6.0 KPi，彻夜透析，先后用阳离子交换柱(HiprepTMCM FF 16/60)(流速：5 mL/min，10 mmol/L pH=6.0 KPi与40 mmol/L pH=9.0 KPi梯度洗脱)与分子凝胶排阻层析柱(流速：1 mL/min，50 mmol/L pH=7.0 Kpi，HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 HR)对样品进行纯化，用SDS-PAGE(12%分离胶，5%浓缩胶)检测蛋白纯度，利用吡啶血色原光吸收测定法[24-25]测定蛋白浓度。所获样品-80 ℃储存备用。

1.2.5 催化性能测定 催化反应体系为1 mL 50 mmol/L pH=7.0 KPi(含0.5 μmol/L Mb，0.5～3 mmol/L吲哚)，反应体系37 ℃预热10 min，加入H2O2(终浓度0.1 mmol/L)启动反应，670 nm下检测产物靛蓝的生成。根据Michaelis-Menten方程计算催化反应动力学参数kcat和Km。

1.2.6 计算机模拟 利用分子模拟软件PYMOL基于F43W/H64D/V68I Mb(PDB code：2E2Y)预测肌红蛋白H64D/I107V、H64D/I107A和H64D/I107G等变体的结构，利用分子对接软件AutoDockVina[26]对肌红蛋白与底物吲哚开展仿真对接实验，将蛋白活性部位的Leu29、Leu32、Phe33、Phe43、Phe46、Asp64、Val68、Leu69、Ile111设为柔性氨基酸。小分子的吲哚的结构由Dundee Prodrg Server生成。利用AutoDockVina的自由能打分函数对计算模拟结果进行排序，通过PYMOL对AutoDockVina对接得到的复合物结构进行可视化分析，探讨蛋白活性部位空间构筑变化对底物结合的影响，进而为肌红蛋白活性部位空间构筑与催化性能之间的联系提供理论依据。

2 结果

菌液测序结果表明，H64D/V68I/I107A与H64D/V68I/I107V在I68V的引物下，64位氨基酸密码子由ATC(I)变为GTG(V)，69位氨基酸密码子由CTA(L)变为TTA(L)，表明其成功地被突变成了H64D/I107A和H64D/I107V。H64D/I107A在A107G引物的作用下，107位氨基酸密码子由GCG(A)突变为了GGC(G)，表明突变成了H64D/I107G。上述数据表明基因突变成功，获得H64D/I107A、H64D/I107V和H64D/I107G 3个突变体。

纯化后蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳结果如图2所示，3种突变体在17 kDa附近均呈现清晰的单一条带，而目的蛋白分子量为16.7 kDa，表明3种蛋白均纯化成功。利用朗博-比尔定律计算蛋白浓度，得出H64D/I107A为8.34 μmol/L，H64D/I107G为9.59 μmol/L，H64D/I107V为21.05 μmol/L。

(Marker为蛋白质分子量标准，H64D/I107V，H64D/I107G和H64D/I107A为3种肌红蛋白突变体。Marker is the protein molecular weight marker, H64D/I107V, H64D/I107G and H64D/I107A are three Mb mutants.)

图2 肌红蛋白电泳图

Fig.2 The electrophorogram of Mb

在670 nm(靛蓝的最大吸收波长)监测靛蓝的生成。图3为肌红蛋白H64D/I107G突变体在过氧化氢存在下催化吲哚形成靛蓝的催化曲线，由图3可知，随着时间的推移，靛蓝的生成量逐渐增多，且随着吲哚浓度的增加，生成靛蓝的量也随之增多。

肌红蛋白催化吲哚的催化速率曲线如图4所示，由图4可知，3种肌红蛋白突变体的表观速率常数值的大小次序为H64D/I107G > H64D/I107A > H64D/I107V。相应的催化动力学参数如表1所示，H64D/I107V、H64D/I107A和H64D/I107G 三种突变体对吲哚羟基化反应的kcat分别为10.6、9.2和25.2 min-1。

注：nd：未检测到Not detected。

吲哚在肌红蛋白活性部位的模拟构象如图5所示，底物吲哚均能进入H64D/I107V、H64D/I107A及H64D/I107G三种变体的活性部位。由于甘氨酸的空间位阻最小，相对于H64D/I107V与H64D/I107A变体，底物分子能够更深入的进入H64D/I107G变体的活性部位。底物吲哚在H64D/I107V与H64D/I107A变体活性部位中的位置基本类似，为苯环在内，五元环在外构象，吲哚C3环Fe与距离分别为7.4 Å和7.6 Å。而底物吲哚在H64D/I107G变体中的构象与其他2种变体显著不同，为苯环在外，五元环在内的构象，吲哚C3显Fe距离为4.9 Å。

3 讨论

野生型肌红蛋白并无催化功能，H64D变体对吲哚羟基化反应具有一定的催化性能(kcat=4.8 min-1)，表明将64位置的氨基酸由组氨酸突变为天冬氨酸后，能够有效产生反应中间体，从而提升其羟基化反应催化能力[22]。H64D/I107V与H64D/I107A突变体对吲哚羟基化反应的kcat分别为10.6和9.2 min-1，分别为H64D变体的2.2与1.91倍，表明将活性部位107位置的异亮氨酸突变为体积较小的丙氨酸与缬氨酸能够有效提升蛋白的催化性能。当将107位置的异亮氨酸突变为体积更小的甘氨酸时，H64D/107G变体对吲哚羟基化反应的kcat为25.2 min-1，为H64D变体催化性能的5.25倍，表明107位置的氨基酸体积能够显著影响蛋白的催化性能，随着107位置氨基酸体积的减少，肌红蛋白的催化性能提升，原因为蛋白活性部位口袋内部空间的释放能够使底物更易接近活性中心，有利于催化反应的进行。但H64D/I107V与H64D/I107A突变体对吲哚羟基化反应的催化性能仍低于H64D/V68I/I107V及H64D/V68I/I107A变体，表明68位置氨基的疏水性大小能够显著影响蛋白的催化性能，68位置的氨基酸由异亮氨酸突变为缬氨酸降低了蛋白的催化性能。

((A)H64D/I107V，(B)H64D/I107A，(C)H64D/I107G；(a)侧视图，(b)俯视图；吲哚(青色)，血红素(红色)及关键氨基酸(绿色)以棍棒模型展示。(A) H64D/I107V, (B) H64D/I107A, (C) H64D/I107G; (a) side view, (b) top view; Indole (cyan), heme (red), and the key amino acid residues (green) are shown as stick models.)

图5 吲哚在肌红蛋白突变体活性活性部位的模拟构象

Fig.5 The docking simulation of indole into the active sites of Mb mutants

P450cam中底物d-camphor与血红素中心Fe的距离为4.2 Å[27]，相对于H64D/I107V(7.4 Å)与H64D/I107A(7.6 Å)变体而言，H64D/I107G变体中C3中Fe距离(4.9 Å)更适宜于羟基化反应的进行，因此H64D/I107G表现出相对优异的羟基化反应催化能力。在H64D/V68I/I107V与H64D/V68I/I107A变体中，吲哚C3中Fe与距离分别为4.1 Å和4.2 Å，因此这2种变体具有更为优异的羟基化反应催化能力。表明活性部位68位置的氨基酸能够有效调控底物在活性部位的空间构象，而疏水性对蛋白的催化性能具有显著影响。

4 结语

本研究通过基因定点突变技术，重点研究了抹香鲸肌红蛋白68、107位置的氨基酸对其羟基化反应催化性能的影响。研究结果表明，H64D/I107V、H64D/I107A和H64D/I107G对于吲哚羟基化反应均有较好的催化能力。计算机模拟结果表明，肌红蛋白活性部位107位置氨基酸的空间位阻效应及68位置氨基酸的疏水性能够显著影响底物在蛋白活性部位的空间构象，进而影响其催化性能。本研究为探讨肌红蛋白活性部位氨基酸排布对其催化性能的影响，阐明肌红蛋白变体结构与功能之间的关系，进一步揭示血红素蛋白的构效关系提供了实验依据与理论基础。

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责任编辑 朱宝象

Constructing Novel Biocatalysts Basing on Myoglobin

ZHANG Fang-Fang1,2, XU Jia-Kun2, WANG Fang2, GUO Hui1, LIANG Xing-Guo1

(1.College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.The Key Laboratory of Sustainable Development, Marine Fisheries of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

Comprehensively utilizing the methods of computer simulation and genetic engineering, we designed the active site of the sperm whale Mb. The influence of the amino acids at 68 and 107 positions on the catalytic ability was studied in detail. Three Mb mutants H64D/I107V, H64D/I107A and H64D/I107G were designed, prepared, expressed and purified. The hydroxylation catalytic ability of these three mutants was measured using indole as a substrate. Thekcatvalue of these three mutants against hydroxylation reaction was 10.6 min-1, 9.2 min-1, and 25.2 min-1, respectively. The computer simulation results indicated that the stereo-hindrance effect of the amino acid at 107 position and the hydrophobic property of the amino acid at 68 position can influence the location of indole in the active site, and thus affect the catalytic performance of the protein.

biocatalyst; myoglobin；site-directed mutagenesis；catalytic performance；computer simulation

国家自然科学基金项目(31200642)；山东省科技发展计划项目(2014GHY115029)；青岛市应用基础研究计划项目(14-2-4-91-jch)；青岛海洋科学与技术国家实验室鳌山科技创新计划项目(2015ASKJ02)；黄海水产研究所级基本科研业务费项目(20603022016011)资助

2016-03-08；

2016-05-03

张芳芳 (1990-)，女，硕士生。E-mail: fangfang_zhang1990@163.com

** 通讯作者：E-mail: xujk@ysfri.ac.cn

Q814.9； S917

A

1672-5174(2017)04-046-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20160059

张芳芳， 徐甲坤， 王芳， 等. 基于肌红蛋白构筑新型生物催化剂[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2017, 47(4): 46-51.

ZHANG Fang-Fang, XU Jia-Kun, WANG Fang, et al. Constructing novel biocatalysts basing on myoglobin [J].Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(4): 46-51.

Supported by the National Natural Science Foundation of China (31200642); Science and Technology Development Plan of Shandong Province (2014GHY115029); Qingdao Scientific and Technological Achievements Transformation Program (14-2-4-91-jch); The Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02); Special Scientific Research Funds for Central Non-profit Institutes, Yellow Sea Fisheries Research Institute(20603022016011)