两株芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长和血清非特异性免疫指标的影响研究*

王 苓， 田相利， 董双林， 汪 多

(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东 青岛 266003)

两株芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长和血清非特异性免疫指标的影响研究*

王 苓， 田相利**， 董双林， 汪 多

(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东 青岛 266003)

为研究芽孢杆菌对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)生长指标和血清非特异性免疫指标的影响。以初始体重 (4.00±0.03) g的凡纳滨对虾为对象，在对虾饲料中分别添加浓度为1×107、1×109和1×1011cfu/kg的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，以对虾商品饲料为对照组，养殖42 d。实验结束后，测定凡纳滨对虾的生长情况和血清非特异性免疫指标。研究表明：各组对虾的成活率均在90%以上，且组间差异不显著(P>0.05)；除了枯草芽孢杆菌1×107cfu/kg添加组，其余添加组中凡纳滨对虾的体重、特定生长率、饲料效率和消化率(P<0.05)显著提高，在添加浓度为1×109cfu/kg时各指标取得最大值。饲料中添加益生菌可提高凡纳滨对虾的超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、总一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合酶活性和血清蛋白浓度等血清非特异性免疫指标，且均在添加浓度为1×109cfu/kg时各指标取得最大值。研究结果表明，饲料中添加适当浓度的益生菌可有效促进凡纳滨对虾的生长，提高其血清非特异性免疫水平。当益生菌的添加浓度为1×109cfu/kg时，效果最显著。

凡纳滨对虾；芽孢杆菌；生长；免疫

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)俗称南美白对虾，原产于太平洋沿岸水域，以南美洲居多[1]。它于1988年由张伟权教授引进中国，因其具有抗逆性强、生长速度快、耐高密度等特点，迅速成为我国对虾养殖业中养殖范围最广的品种。但随着对虾集约化养殖模式的迅猛发展，残饵粪便等有机污染物的积存致使大量有害菌群滋生繁殖，养殖水体的生态环境持续恶化，严重降低了对虾的抗病力，使得对虾疾病频发，大量抗生素及违禁药品被用于病害防治，导致细菌耐药性增强及对虾体内药物残留等问题，严重制约着对虾养殖业的健康可持续发展[2-5]。因此，在对虾养殖中，寻找绿色环保的抗生素等药物的替代品，解决养殖病害和食品安全等问题，成为目前大量研究工作的焦点[6-7]。

益生菌是可以对宿主产生有益作用的活性微生物的统称，因其具有调节生物菌群平衡，抑制有害菌株的繁殖，减少毒性物质的释放[4,8]；改善水质，降低氨氮[8-9]；提高养殖对象的适应能力，增强免疫力[10-11]；提高生物体内的消化酶活性，促进其对营养物质的消化吸收[12-13]等作用，越来越多的益生菌被应用于养殖生产中，并取得了良好的效果。本研究比较了潜在益生菌蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)对凡纳滨对虾生长性能及血清非特异性免疫指标的影响，以期为这2株益生菌在凡纳滨对虾中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 益生菌

蜡样芽孢杆菌(B.cereus，编号：CD)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis，编号：BL)均来源于中国海洋大学水产养殖生态实验室筛选、保存的菌种。

1.2 实验饲料

1.2.1 益生菌活化、培养 CD株和BL株活化后分别接种于2216E液体培养基中，140 r/min、28 ℃培养24 h至对数期，经检测活菌含量为1×109cfu/mL。将培养液转移到无菌离心管中以5 000 r/min离心10 min，弃上清液，收集菌体，用无菌生理盐水重悬备用。

1.2.2 实验饲料制作

对照组饲料 由凡纳滨对虾商品饲料(购于南通正大有限公司，南美白对虾2号饲料)表面直接包裹一层褐藻酸钠(3.15 g/500g)和鱼油(4.2 mL/500g)制成[14](记为Control)。

实验组饲料 按一定比例将菌液均匀喷洒在凡纳滨对虾商品化饲料的表面，揉搓阴干，再在其表面直接包裹一层褐藻酸钠和鱼油(比例同对照组饲料)，制成蜡样芽孢杆菌的活菌添加量为1×107、1×109和1×1011cfu/kg(分别记为CD7、CD9和CD11)和枯草芽孢杆菌的活菌添加量为1×107、1×109和1×1011cfu/kg(分别记为BL7、BL9和BL11)的6种实验饲料。待饲料阴干后，4℃冰箱保存备用。

1.3 实验对虾及饲养管理

凡纳滨对虾购于青岛市宝荣水产科技发展有限公司对虾养殖场，养殖用水盐度为21，运回后于实验室玻璃钢水箱中暂养10 d。暂养期间，投喂凡纳滨对虾商品化饲料，养殖用水盐度由21每2天升高2度，逐渐驯化至盐度30后，稳定2天用于养殖实验。

暂养结束后饥饿1天，选取健康无病、规格相近、体重在4 g左右的凡纳滨对虾，随机分为7组，每组5个重复，每个重复10尾虾，在50 L的玻璃水族箱中进行42天的养殖实验。实验期间，每日分别于8：00和17：00两次投喂，日投喂量为虾体质量的4%～5%之间，每次投喂前吸出残饵和粪便，60 ℃下烘干保存；每天换水1次，日换水量为1/3～2/3，水温在23 ℃左右，盐度30，pH=8.0±0.1，连续微量充气，保持溶氧在5 mg/L以上，每日检查并记录对虾的摄食和死亡情况。

1.4 样品采集与处理

实验结束后，饥饿24 h，称量并记录虾的末体重。用1 mL无菌注射器从凡纳滨对虾腹部血窦中抽取血淋巴置于1.5 mL离心管中，然后置于4 ℃冰箱中静置一夜，之后3 000 r/min离心10 min，取上层血清置于-80 ℃冰箱中保存。

1.5 指标测定

1.5.1 生长指标 实验开始和结束时，分别对各处理组对虾进行计数和称重，并记录实验过程中各处理组的投饵量、残饵量及排泄量，计算各生长指标。

成活率 =(实验后对虾数量/实验前放养数量)×100%；

特定生长率(SGR)= [(lnW末- lnW初)/t]×100%；

饲料效率(FER)=(W末-W初)/W饵×100%；

消化率(ADR)=(Cw-Fw)/Cw×100%。

式中：W初、W末分别为初体重(g)和末体重(g)；t为养殖时间(d)；W饵为实验期间投入的饲料量；Cw为以重量表示的对虾的摄食量；Fw为粪便质量。

1.5.2 血清非特异性免疫指标 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutse, SOD)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)、总一氧化氮合酶(Total Nitric Oxide Synthase, TNOS)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS)、溶菌酶(Lysozyme, LSZ)及血清蛋白浓度的测定均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，并参照试剂盒说明书进行操作。

1.6 数据统计分析

实验数据采用SPSS Statistics 21软件进行单因素方差分析和Duncan's多重比较进行差异显著性检验，统计结果用平均值±标准误(Mean±SE)表示。

2 结果

2.1 生长指标

2.1.1 生长与成活率 由表1可知，饲料中添加的2种芽孢杆菌均可促进凡纳滨对虾的生长。除BL7组外,其它各实验组的末体重均显著高于对照组(P<0.05)；2种芽孢杆菌处理组的末体重均在中浓度(CD9和BL9)取得最大值，且CD9显著高于BL9(P<0.05)；各处理组对虾成活率均在90.0%～97.5%之间，且与对照组差异不显著(P>0.05)。

2.1.2 特定生长率 由图1可知，饲料中添加2种芽孢杆菌均可以提高凡纳滨对虾的特定生长率。除BL7组外，其它各实验组的特定生长率均显著高于对照组(P<0.05)；BL7与BL11差异不显著(P>0.05)，CD7、CD11、BL9、BL11差异不显著(P>0.05)；CD9的特定生长率最高且显著高于BL9(P<0.05)。

2.1.3 饲料效率 由表1可知，饲料中添加的2种芽孢杆菌对凡纳滨对虾饲料效率的影响与对其特定生长率的影响变化规律基本一致。除BL7组与对照组之间差异不显著以外(P>0.05)，其余各实验组饲料效率均显著高于对照组(P<0.05)，且2种芽孢杆菌的中浓度实验组(CD9和BL9)均显著高于低浓度(CD7和BL7)和高浓度实验组(CD11和BL11)(P<0.05)，而低浓度和高浓度实验组之间差异不显著(P>0.05)； CD9的饲料效率显著高于BL9(P<0.05)。

2.1.4 消化率 由表1可知，饲料中添加的2种芽孢杆菌均可以提高凡纳滨对虾的消化率。其中， CD7、CD9、CD11组的消化率均显著高于对照组(P<0.05)，CD9显著性高于CD7和CD11(P<0.05)，CD7组略高于CD11组，但差异不显著(P>0.05)； BL7、BL9、BL11的消化率均显著高于对照组(P<0.05)，BL9与BL11组差异不显著(P>0.05)而与BL7组差异显著(P<0.05)；CD9组的消化率显著高于BL9组。

注：同一列数据标有不同字母的表示相互之间差异显著(P<0.05)。

Note: Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).

(图中柱上不同字母的表示相互之间差异显著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

图1 饲料中添加芽孢杆菌对凡纳滨对虾特定生长率(SGR)的影响

Fig.1 Effects ofBacilluson the specific growth rate(SGR) ofL.vannamei

2.2 血清非特异性免疫指标

2.2.1 超氧化物歧化酶 由图2可知，饲料中添加2种不同浓度的芽孢杆菌对凡纳滨对虾血清超氧化物歧化酶(SOD)活性影响不同。其中，CD7、CD9、CD11组的活性均显著高于对照组(P<0.05)，CD9组达到最大值，且显著高于CD7和CD11(P<0.05)，CD7组活性高于CD11，但差异不显著(P>0.05)； BL7、BL9、BL11的SOD活性也均显著高于对照组(P<0.05)，BL9组显著高于BL7和BL11，BL7组活性略低于BL11组，差异不显著(P>0.05)。

(图中柱上不同字母的表示相互之间差异显著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

图2 饲料中添加芽孢杆菌对凡纳滨对虾超氧化物歧化酶(SOD)的影响

Fig.2 Effects of Bacillus on superoxide dismutse(SOD) in serum ofL.vannamei

2.2.2 碱性磷酸酶 由图3可知，饲料中添加2种不同浓度的芽孢杆菌均可以提高凡纳滨对虾的血清碱性磷酸酶(AKP)活性。其中， CD7、CD9、CD11组的AKP活性均显著性高于对照组(P<0.05)，且CD9组又显著高于CD7和CD11组(P<0.05)，CD7组AKP活性高于CD11组，但差异不显著(P>0.05)；投喂枯草芽孢杆菌的实验组除了BL7组外，均显著性高于对照组(P<0.05)，BL9组显著高于BL11(P<0.05)，BL11组又显著高于BL7(P<0.05)，BL7略高于对照组，但差异不显著(P>0.05)。

(图中柱上不同字母的表示相互之间差异显著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

图3 饲料中添加芽孢杆菌对凡纳滨对虾碱性磷酸酶(AKP)的影响

Fig.3 Effects of Bacillus on alkaline phosphatase(AKP) in serum ofL.vannamei

2.2.3 酸性磷酸酶 由图4可知，饲料中添加2种不同浓度的芽孢杆菌对凡纳滨对虾的血清酸性磷酸酶(ACP)活性影响不同。CD7和CD9组的ACP活性均显著高于CD11和对照组(P<0.05)，CD9组又显著高于CD7组(P<0.05)，CD11和对照组差异不显著(P>0.05)； BL9组的活性显著性高于BL7、BL11和对照组(P<0.05)，其中，BL7组高于对照组，低于BL11组，但三者之间差异不显著(P>0.05)。

(图中柱上不同字母的表示相互之间差异显著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

图4 饲料中添加芽孢杆菌对凡纳滨对虾酸性磷酸酶(ACP)的影响

Fig.4 Effects of Bacillus on acid phosphatase(ACP) in serum ofL.vannamei

2.2.4 总一氧化氮合酶 由图5可知，饲料中添加2种不同浓度的芽孢杆菌均可以提高凡纳滨对虾的血清总一氧化氮合酶(TNOS)活性。投喂蜡样芽孢杆菌的实验组中，CD9组活性最高，且显著性高于对照组(P<0.05)，CD7组活性低于CD9组，高于CD11组，但三者之间差异不显著(P>0.05)，CD7和CD11组活性都高于对照组，但同样未达到显著性差异水平(P>0.05)；投喂枯草芽孢杆菌的实验组中，BL9组的活性显著高于其它各实验组和对照组(P<0.05)，BL11组活性高于BL7组，差异不显著(P>0.05)，BL7组高于对照组，同样未达到显著性差异水平(P>0.05)。

(图中柱上不同字母的表示相互之间差异显著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

图5 饲料中添加芽孢杆菌对凡纳滨对虾

总一氧化氮合酶(TNOS)的影响

Fig.5 Effects of Bacillus on total nitric oxide synthase(TNOS)

in serum ofL.vannamei

2.2.5 诱导型一氧化氮合酶 由图6可知，饲料中添加2种不同浓度的芽孢杆菌均可以提高凡纳滨对虾的血清诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性。投喂蜡样芽孢杆菌的实验组中，CD9组活性最高，并显著性高于CD11和对照组(P<0.05)，与CD7组差异不显著(P>0.05)，CD7组活性高于CD11，但未达到显著性差异水平(P>0.05)，CD11活性与对照组相比较高，但差异不显著(P>0.05)；投喂枯草芽孢杆菌的实验组中，BL9组活性显著高于其它实验组和对照组(P<0.05)，BL11组活性又显著性高于BL7和对照组(P<0.05)，BL7组活性虽高于对照组，但差异不显著(P>0.05)。

(图中柱上不同字母的表示相互之间差异显著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

图6 饲料中添加芽孢杆菌对凡纳滨对虾

诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的影响

Fig.6 Effects of Bacillus on inducible nitric oxide

synthase(iNOS) in serum ofL.vannamei

2.2.6 溶菌酶 由图7可知，饲料中添加2种不同浓度的芽孢杆菌均可以提高凡纳滨对虾的血清溶菌酶(LSZ)活性。投喂蜡样芽孢杆菌的实验组中，CD9组活性显著高于CD7、CD11和对照组(P<0.05)，CD7组活性高于CD11组，差异不显著(P>0.05)，CD11组活性高于对照组，但也无显著性差异(P>0.05)；投喂枯草芽孢杆菌的各实验组活性均显著性高于对照组(P<0.05)，其中，BL9组又显著性高于BL7和BL11组(P<0.05)，BL11组活性虽高于BL7组，但差异不显著(P>0.05)。

(图中柱上不同字母的表示相互之间差异显著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

图7 饲料中添加芽孢杆菌对凡纳滨对虾溶菌酶(LSZ)的影响

Fig.7 Effects of Bacillus on lysozyme(LSZ ) in

serum ofL.vannamei

2.2.7 血清蛋白浓度 由图8可知，饲料中添加2种不同浓度的芽孢杆菌对凡纳滨对虾的血清蛋白浓度也有不同影响。CD7、CD9、CD11组的浓度均显著高于对照组(P<0.05)，其中，CD9组显著性高于CD7组(P<0.05)，CD7组又显著性高于CD11组的浓度(P<0.05)；投喂枯草芽孢杆菌的实验组中，BL9和BL11组的浓度均显著性高于BL7和对照组，BL9组浓度最高，且又显著性高于BL11组(P<0.05)，BL7组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。

(图中柱上不同字母的表示相互之间差异显著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

图8 饲料中添加芽孢杆菌对凡纳滨对虾血清蛋白的影响

Fig.8 Effects of Bacillus on the protein in serum ofL.vannamei

3 讨论

3.1 饲料中添加芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长的影响

迄今，关于益生菌在水产养殖中的应用已有较多研究，主要种类包括弧菌属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、假单胞杆菌属[15-16]。本研究中，选用2种芽孢杆菌属细菌做为添加菌。从结果中可以看出2种芽孢杆菌均能显著提高对虾的末体重和特定生长率，这与石广举[17]、丁贤[13]等的研究结果相类似。益生菌可以调节养殖动物肠道的菌群平衡，促进有益菌株优势种的形成，提高机体的消化酶活性，从而提高了饲料效率和消化率[18]，本结果也证实了这一观点，2种芽孢杆菌均可以提高饲料效率和消化率，且最佳实验浓度组均与对照组有显著差异(P<0.05)。

在水产养殖领域，由于养殖对象、养殖环境和益生菌添加的种类不同，益生菌的适宜添加浓度也不相同，一般添加浓度在1×106～1×109cfu/kg之间[19]；本研究得到的2种芽孢杆菌的最佳添加浓度均为1×109cfu/kg，这与刘泓宇等人关于枯草芽孢杆菌在凡纳滨对虾饲料中适宜的浓度为5×1010cfu/kg[18]的研究结果略有不同，这可能是因为养殖水体温度、盐度、酸碱度以及养殖密度等不同造成的。所以即使同一种菌添加到同一种养殖对象的饲料中，也会因为各种因素的影响，造成适宜添加益生菌的浓度有所差别。因此，在益生菌的实际应用过程中，为了保证应用效果，应当根据实际情况适当调整益生菌的用量。

3.2 饲料中添加芽孢杆菌对凡纳滨对虾非特异性免疫的影响

已有研究表明，超氧化物歧化酶、磷酸酶、溶菌酶、血清蛋白浓度和一氧化氮合酶等均在对虾免疫防御中起着重要作用，并可以反映对虾的免疫能力[20]。SOD可以清除虾体内多余的自由基，使机体维持正常的平衡[21-22]；溶菌酶在最前沿防御机制中有重要作用，并且主要针对革兰氏阳性菌发挥作用[23]；对虾机体启动免疫反应后，体内的一氧化氮合酶会被激活，并会受体内免疫物质的诱导激发释放出大量的NO，而NO会参与一系列的免疫反应，对病原生物产生杀灭作用[24]。李桂英等人的研究表明添加益生菌可以显著提高凡纳滨对虾的溶菌酶和一氧化氮合酶的活性[12]，本研究中添加的两种芽孢杆菌也均可以显著提高对虾的溶菌酶和一氧化氮合酶的活性，且均与对照组差异显著(P<0.05)。饲料中添加的不同浓度的2种芽孢杆菌均可以不同程度的提高对虾的超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、一氧化氮合酶活性及血清蛋白浓度等血清非特异性免疫指标；从实验结果中可以看出，当2种芽孢杆菌添加浓度为1×109cfu/kg时，各免疫指标均取得最大值，显著高于其他实验组，且与对照组差异显著(P<0.05)。

关于益生菌的作用，目前已有较多研究[12-14]。当益生菌添加到养殖水体中后，可通过营养竞争、位点争夺、分泌抑菌物质等抑制有害细菌的繁殖[4,8]，保持养殖水体微生态的稳定，维持有益菌群的优势地位，刺激养殖动物免疫系统，增强其抗病力[10,25]，同时，也进一步保证了养殖动物处于较佳的生理状态，有助于提高其摄食、消化以及对营养物质的吸收利用，从而达到促进养殖动物生长的效果。本研究中，凡纳滨对虾在2种芽孢杆菌的不同添加浓度下的生长指标和免疫指标变化规律基本上是一致的，印证了上述推想。本研究中的枯草芽孢杆菌的最佳添加浓度为1×109cfu/kg时，各项非特异性免疫指标均达到最大值，而这一结果与陆家昌等人的研究结果不同，其研究结果显示枯草芽孢杆菌的最佳添加浓度为1.25×104cfu/kg[26]，这可能是因为除对虾养殖条件、水体温度以及盐度等因素不同以外，还可能是由枯草芽孢杆菌的菌种以及其活性的不同所造成。因此，即使同属于一个菌属的细菌对同一个水产养殖对象的非特异性免疫指标的影响也存在差异，应该根据具体的养殖情况和菌种活性进行适当的用量调整，这样才能更好的提高对虾的非特异性免疫能力。

4 结语

本研究结果表明，芽孢杆菌作为一类益生菌制剂，以适宜的添加量添加到对虾饲料中，可有效促进凡纳滨对虾的生长，提高其血清非特异性免疫能力。实验中，2种芽孢杆菌饲料添加浓度为1×109cfu/kg时，对凡纳滨对虾生长和免疫的促进效果最显著，可以作为其在凡纳滨对虾饲料添加中的参考剂量。

[1] 王兴强, 马甡, 董双林. 凡纳滨对虾生物学及养殖生态学研究进展[J]. 海洋湖沼通报, 2004(4): 94-100. Wang X Q, Ma S, Dong S L. Studies on the biology and cultural ecology ofLitopenaeusvannamei: A review[J]. Transactions of Oceanology and Limnology, 2004(4): 94-100.

[2] Kesarcodi Watson A, Kaspar H, Lategan M J, et al. Probiotics in aquaculture: The need, principles and mechanisms of action and screening processes[J]. Aquaculture, 2008, 274: 1-14.

[3] 蒋甲印, 周振峰, 孙成波. 对虾养殖业的四个安全问题[J]. 当代水产, 2011(6): 52-55. Jiang J Y, Zhou Z F, Sun C B. Four safety issues of shrimp culture industry[J]. Contemporary Fisheries, 2011(6): 52-55.

[4] 胡毅, 谭北平, 麦康森, 等. 饲料中益生菌对凡纳滨对虾生长、肠道菌群及部分免疫指标的影响[J]. 中国水产科学, 2008, 15(2): 244-251. Hu Y, Tan B P, Mai K S,et al. Effects of dietary probiotic on growth, immunity and intestinal bacteria of juvenileLitopenaeusvannamei[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2008, 15(2): 244-251.

[5] 潘鲁青. 我国对虾养殖业面临的问题与发展对策[J]. 齐鲁渔业, 2001, 18(3): 22-25. Pan L Q. The problem confronted and development strategy of shrimp culture industry in China[J]. Shandong Fisheries, 2001, 18(3): 22-25.

[6] Wang Y B, Li J R, Lin J D. Probiotics in aquaculture: Challenge and outlook[J]. Aquaculture, 2008, 281: 1-4.

[7] 王熙涛, 卢燕丹, 王丽丽, 等. 新型抗生素替代品防治水产动物细菌性疾病的研究进展[J]. 饲料与畜牧, 2015(4): 18-22. Wang X T, Lu Y D, Wang L L, et al. Research progress on the control of bacterial diseases of aquatic animals with new type of antibiotic substitute[J]. Aquaculture Nutrition and Feeds Science Technology, 2015(4): 18-22.

[8] 夏磊, 唐夏, 张洪玉. 微生态制剂在对虾养殖中的研究与应用综述[J]. 江苏农业科学, 2014, 42(11): 259-262. Xia L, Tang X, Zhang H Y. Overview of the research and application of micro ecological agents in shrimp culture[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2014, 42(11): 259-262.

[9] 高权新, 施兆鸿, 彭士明. 益生菌在水产养殖中的研究进展[J]. 海洋渔业, 2013, 35(3): 364-372. Gao Q X, Shi Z H, Peng S M. Probiotics in aquaculture: Recent progress and outlook[J]. Marine Fisheries, 2013, 35(3): 364-372.

[10] 徐琴, 李健, 刘淇, 等.微生态制剂对中国对虾幼体长生长和非特异性免疫的影响[J].饲料工业, 2006, 27(12): 26-29. Xu Q, Li J, Liu Q, et al. Effects of probiotics on growth and nonspecific immunity of Chinese shrimp larvae[J]. Feed Industry, 2006, 27(12): 26-29.

[11] 侯树宇, 张清敏, 多淼, 等. 微生态复合菌制剂在对虾养殖中的应用研究[J]. 农业环境科学学报, 2004, 23(5): 904-907. Hou S Y, Zhang Q M, Duo M, et al. Application of a preparation of micro-ecological probiotics in cultivation of prawns[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2004, 23(5): 904-907.

[12] 李桂英, 孙艳, 宋晓玲, 等. 饲料中添加潜在益生菌对凡纳滨对虾肠道消化酶活性和菌群组成的影响[J]. 渔业科学进展, 2013, 34(4): 84-90. Li G Y, Sun Y, Song X L, et al. Potential probiotics supplement may impact intestinal digestive enzyme and bacteria composition ofLitopenaeusvannamei[J]. Progress in Fishery Sciences, 2013, 34(4): 84-90.

[13] 丁贤, 李卓佳, 陈永青, 等. 芽孢杆菌对凡纳对虾生长和消化酶活性的影响[J]. 中国水产科学, 2014, 11(6): 580-584. Ding X, Li Z J, Chen Y Q, et al. Effects of probiotics on growth and activities of digestive enzymes ofPennausvannamei[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2014, 11(6): 580-584.

[14] 孙艳, 刘飞, 宋晓玲, 等. 饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)非特异免疫基因表达量和抗病力的影响[J]. 海洋与湖沼, 2012, 43(4): 845-851. Sun Y, Liu F, Song X L, et al. Effects of addition probiotics in the feed on the non-specific immune gene expression and disease resistance ofLitopenaeusvannamei[J]. Oceanologia Et Limnologia Sinica, 2012, 43(4): 845-851.

[15] 楼丹, 杨季芳, 谢和. 益生菌在水产养殖中的作用[J]. 浙江万里学院学报, 2009, 22(2): 78-83. Lou D, Yang J F, Xie H. The effect of probiotics in aquaculture[J]. Journal of Zhejiang Wanli University, 2009, 22(2): 78-83.

[16] 王军, 孙瑞健. 益生菌在水产养殖中的应用研究[J]. 生物技术世界, 2015(4): 30-33. Wang J, Sun R J. Research on the application of probiotics in aquaculture[J]. Bio Tech World, 2015(4): 30-33.

[17] 石广举, 孙力军, 王雅玲, 等. 纳豆芽孢杆菌NT-6抗菌脂肽对凡纳滨对虾生长性能及非特异性免疫指标的影响[J]. 广东农业科学, 2014(22): 99-103. Shi G J, Sun L J, Wang Y L, et al. Effects of antibacterial lipopeptides produced byBacillussubtilisNT-6 in solid-state fermentation on growth performance and non-specific immunity ofLitopenaeusvannamei[J]. Guangdong Agricultural Sciences, 2014(22): 99-103.

[18] 刘泓宇, 李正, 孙武卫, 等. 饲料中添加益生菌或植物提取物对凡纳滨对虾生长、免疫力及抗病力的影响[J]. 饲料工业, 2014, 35(12): 21-26. Liu H Y, Li Z, Sun W W, et al. Effect of dietary plant extracts and probiotics on growth，non-specific immunity and disease resistance of the Pacific white shrimp(Litopenaeusvannamei) [J]. Feed Industry, 2014, 35(12): 21-26.

[19] Nikoskelainen S, Ouwehand A, Salminen S, et al. Protection of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) from furunculosis byLactobacillusrhamnosus[J]. Aquaculture, 2001, 198: 229-236.

[20] 王国霞, 黄燕华, 周晔, 等. 乳酸菌对凡纳滨对虾幼虾生长性能、消化酶活性和非特异性免疫的影响[J]. 动物营养学报, 2010, 22(1): 228-234. Wang G X, Huang Y H， Zhou H， et al. Effects ofLactobacilluson growth performance, digestive enzyme activities and non-specific immunity ofLitopenaeusvannamei[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2010, 22(1): 228-234.

[21] 丁美丽, 林林, 李光友, 等. 有机污染对中国对虾体内外环境影响的研究[J]. 海洋与湖沼, 1997, 28(1): 7-12. Ding M l, Lin l, Li G Y, et al. Effects of organic pollution onPenaeusChinensisbody’s intraenvironment and externalenvironment[J]. Oceanologia Et Limnologia Sinica, 1997, 28(1): 7-12.

[22] 刘恒, 李光友. 免疫多糖对养殖南美白对虾作用的研究[J]. 海洋与湖沼, 1998, 29(2): 113-118. Liu H, Li G Y. The effect of immunopolysaccharide as a food additive on the Penaeid Shrimp,Penaeusvannamei[J]. Oceanologia Et Limnologia Sinica, 1998, 29(2): 113-118.

[23] Christopher J B, Lena G. The acute phase response and innate immunity of fish [J]. Developmental and Comparative Immunology, 2001, 25: 725-743.

[24] 常杰. 对虾和刺参敏感免疫学指标的筛选和评价[D]. 青岛：中国海洋大学,2010. Chang J. Studies on Sensitive Immunology Parameters Scrcening and Evaluation in White ShrimpLitopenaeusVannameiand Sea CucumberApostichopusJaponicusSelenka[D]. Qingdao： Ocean University of China,2010.

[25] Saeed Z N, Mehran H R, Ghobad A T, et al. The effect ofBacillusspp. bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus[J]. Aquaculture, 2006, 252: 516-524.

[26] 陆家昌, 李活, 黄翔鹄.枯草芽孢杆菌对水质及凡纳滨对虾幼体免疫指标影响的研究[J]. 南方水产, 2010, 6(1): 19-24. Lu J C, Li H, Huang X H. Effects ofBacillussubstilison water quality and immunization indicators of larvalPenaeusvannamei[J]. South China Fisheries Science, 2010, 6(1): 19-24.

责任编辑 朱宝象

Effects of TwoBacilluson Growth Performance and Serum Non-specific Immunity ofLitopenaeusvannamei

WANG Ling, TIAN Xiang-Li, DONG Shuang-Lin, WANG Duo

(The Key Laboratory Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The experiment was conducted to investigate the effects ofBacilluscereusandB.subtilison the growth performance and serum non-specific immunity ofLitopenaeusvannamei. Three concentrations, 1×107cfu/kg, 1×109cfu/kg and 1×1011cfu/kg, were formulated into six experimental diets CD7, CD9, CD11 and BL7, BL9, BL11. The control was basic diet without probiotic. ShrimpL. vannamei with an average initial weight of (4.00±0.03)g were divided into seven groups，five replications each group, and ten shrimps each replication, and cultured for 42 days. During the experiment, the initial body weight, the quantity and surplus we fed the shrimps, the quantity of their excretion, the number of deaths and the final body weight and calculate survival rate, the specific growth rate, feed efficiency, apparent digestibility were recorded. When the experiment was finished, we weighed the shrimps and collected the hemolymph from the pericardial cavity. Then we determined superoxide dismutse, alkaline phosphatase, acid phosphatase, total nitric oxide synthase, inducible nitric oxide synthase, lysozyme and the protein in serum ofL.Vannameiin different groups with enzyme reagent kits. The enzyme reagent kits were provided by Nanjing Jiancheng Biology Engineering Institute. The experimental data was processed with one-way ANOVA and Duncan multiple range test with SPSS Statistics 21. We analyzed and compared the results of growth performance and serum non-specific immunity of different groups. The results showed that the survival rate of each groups was above 90% with no significant difference (P>0.05) except BL7. Feed supplemented with Bacillus could significantly (P<0.05) increase the final weight, specific growth rate, feed efficiency ratio and apparent digestibility when the concentration of Bacillus was 1×109cfu/kg, at which the growth index got the maximum value and was significantly higher than that at 1×107cfu/kg and 1×1011cfu/kg. Feed supplemented with Bacillus could increase the activities of superoxide dismutse, alkaline phosphatase, acid phosphatase, total nitric oxide synthase, inducible nitric oxide synthase, lysozyme and the concentration of serum protein in varying degrees. Compared with the control group and other addictive concentration of Bacillus, the concentration of 1×109cfu/kg got the maximum value and the differences were significant (P<0.05). The experiment compared also the effects of twoBacilluson growth performance and serum non-specific immunity ofL.Vannamei. It was concluded that feed supplemented with proper concentrations of Bacillus can effectively promote the growth and improve the serum non-specific immunity ofL. vannamei and the concentration of 1×109cfu/kg can produce the most obvious effect.

Litopenaeusvannamei;Bacillus; growth; immunity

国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAD13B03); 山东省杰出青年基金项目( JQ201009)；广东省海洋经济创新发展区域示范专项(GDHY2013-B03-005)； 青岛市民生科技计划项目(15-9-2-96-NSH)资助

2016-01-27；

2016-04-28

王苓(1990-),女, 硕士生, 主要从事水产微生物学研究。E-mail:wl1220862521@126.com

** 通讯作者：E-mail: xianglitian@ouc.edu.cn

S917

A

1672-5174(2017)04-014-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160022

王苓， 田相利， 董双林， 等. 两株芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长和血清非特异性免疫指标的影响研究[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2017, 47(4): 14-21.

WANG Ling, TIAN Xiang-Li, DONG Shuang-Lin, et al. Effects of twoBacilluson growth performance and serum non-specific immunity ofLitopenaeusvannamei[J].Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(4): 14-21.

Supported by National Great Project of Scientific and Technical Supporting Programs (2011BAD13B03), the Program for Excellent Youth Foundation of Shandong Province (JQ201009), the Specialized Project of Regional Demonstration for the Innovation and Development of Marine Economy of Guangdong Province (GDHY 2013-B03-005), and the Scientific and Technical Programs for People's Livelihood of Qingdao (15-9-2-96-NSH).