去双前肢大鼠腰椎间盘退变模型构造的研究进展

陶其杰 朱杭 潘浩

去双前肢大鼠腰椎间盘退变模型构造的研究进展

陶其杰 朱杭 潘浩

椎间盘退行性变（IVDD）是椎间盘组织在多种原因作用下发生的生物变性，从而引起椎间盘组织结构特性和力学的改变，导致椎间盘突出、椎管狭窄、脊柱不稳等临床常见疾病［1］，是引起下腰痛的主要原因。研究表明，＞50岁的人群中，97%存在椎间盘退变的表现。目前对该疾病的生物学机制尚未明确，因此利用动物模型研究其退变机制，同时也为寻找有效的治疗和预防措施提供一条重要途径。虽然现有的四肢动物模型在某种程度上可以模拟椎间盘退变的病理过程，但仅对诸多影响因素中的一部分进行研究，并不符合人类椎间盘的退变机制［2-7］。根据已有文献报道，大鼠去双前肢诱导直立模型（下文采用“双足鼠”替代）是目前国际上公认的一种经典的实验动物模型，取得一定的研究效果，本文对双足鼠的研究进展及其前景作一综述。

1 背景材料

目前已报道的椎间盘退变动物模型有数十种，主要分为生物力学改变、结构破坏、自发退变型和全身疾病型。但大部分模型均未体现致退变的首要因素—重力作用，而那些通过对动物脊柱进行轴向加压诱导出退变的模型也与人体椎间盘生理性情况不符［2-7］。此外，人体椎间盘一直处于上部位结构的垂直载荷及复合运动时（屈伸、侧屈及旋转）所产生多种应力的作用下，易造成椎间盘挤压和磨损。这种生物力学及运动学特点是人类脊柱区别于爬行动物的关键，也是构建椎间盘退变动物模型的难点。对此，制备与人类脊柱的运动学及生物力学特点相似的动物模型显得尤为重要。Coff等［8］在 1957 年首次报道双足鼠模型的建立，该模型大鼠通过模仿人类直立状态下的生活方式，使其腰椎局部受力情况更接近于人类。此后，Higuch等［9］研究发现双足鼠髓核的改变与人髓核在增龄上的改变相似。Cassidy等［10］则从直立大鼠的椎旁肌形态上进行阐述，发现大鼠的腰肌和多裂肌均发生肌纤维的转变。另外，部分大鼠出现腰椎间盘突出及椎管狭窄等情况。吴靖平等［11］发现双足鼠由于活动行为的改变，腰椎开始承受体重的应力，导致其髓核组织发生严重的退变，脊索细胞、软骨样细胞发生变化，这与人类椎间盘的细胞退变规律相符。王卫明等［12］对双足鼠术后9～12个月进行组织学及放射影像学检查，发现模型大鼠的椎间盘出现退变，且与人类椎间盘退变规律基本一致。也证实力学因素对椎间盘生物学性质的改变起到较明显的作用。

虽然上述实验研究在退变机制上模拟了人体椎间盘，但实验动物均为乳鼠，建模成功率并不高，且存在建模术后饲养难度较大等不足［11］。为获得更为合理的建模时机及相对较高的建模成功率，邱贵兴等［13］分别采用为3d龄组、3周龄组和1个月龄组大鼠进行建模，发现3组双足鼠日均累计动态站立时间无显著性差异；其中1个月龄双足鼠较早出现直立活动，具有较快的适应能力，达到比其他建模时间更好的效果，且1个月龄大鼠无术后死亡、因饥饿死亡等情况发生。

随后，有学者［14-15］通过采用4周龄大鼠进行建模，分别在第5、7、9个月观察直立的姿势对腰椎间盘影响，组织学结果分析表明，椎间盘发生退行性改变，纤维环破碎、软骨终板胶原蛋白结构出现紊乱、椎间盘高度丢失。该研究还指出体重与退变无统计学意义。国内学者［16］在进一步研究中发现直立模型大鼠的腰椎间盘存在病理改变，包括CollagenⅩ上调，CollagenⅡ表达下调，纤维环出现破裂，椎间盘高度降低，椎体软骨终板钙化，基质金属蛋白酶表达增强。

Moravec等［17］提出置疑，其认为不同实验室饲养的双足鼠模拟人类直立姿势的评定标准存在差异。Cassidy等［10］通过对Coff技术的改良，将新生大鼠的前肢用棉线结扎，通过食物诱导直立活动，在术后14～18个月通过影像学检查发现其腰椎出现楔形变化，但仅有20%的双足鼠发生椎间盘退变。Bailey等［18］对双足鼠和正常大鼠进行全天24h的连续行为记录后，指出模型大鼠“直立”时间并不多于正常大鼠。由此可见，双足鼠模型尚未能完全模拟人类脊柱运动机制；其次，漫长的实验周期和较低的成功率等弊端限制了其推广应用。

为提高双足鼠直立姿势持续时间，邱贵兴等［19］对双足鼠术后直立姿势相关事件与相应直立持续时间进行统计学分析，指出双足鼠直立姿势是一个被动过程，食物及饮用水的高度是其尽早站立的主要诱因。另外，通过间断提高食物高度，可以增加双足鼠直立姿势的效能，但这种相关性随增龄逐渐减弱。

2 生物力学

椎间盘退变是一种由细胞生物学和生物力学互相作用产生的病理过程。现有研究表明载荷在生理或病理状态下调控椎间盘细胞的生物学行为和基质代谢方面起着重要作用［20-21］。Stokes等［22］发现高频率静态和动态的压力可以产生细胞凋亡、增加代谢基因的表达、增加酶活性、改变结构性质。Gilbert等［23］研究指出椎间盘在周期性高应力作用下，会引起椎间盘基质分解增加、合成减少，进而导致椎间盘退变。Sowa等［24］对体外椎间盘纤维环细胞牵拉实验表明：椎间盘组织基质代谢的调节与载荷的方式、频率、幅度、时间及组织退变有关。张德宏等［25］采用 Flexcell4000 牵张系统对体外培养的髓核组织分别予以施加牵张应变为 2%和 10%、频率为1.0Hz，时间为 2 h 和 12 h 的周期性牵张，发现：（1）2%牵拉力对肌动蛋白骨架形成的应力纤维影响不是很明显，10%牵拉可以促进肌动蛋白骨架明显解聚。（2）2%牵拉促进合成代谢，使Aggrecan mRNA表达上调，使基质金属蛋白酶 2（MMP-2）mRNA和组织基质金属蛋白酶抑制剂2（TIMP-2）mRNA表达下调，从而达到二者动态平衡。（3）10%牵拉对 Aggrecan 无影响。MMP-2 上调、TIMP-2下调与牵拉时间无明显相关性。最后得出周期性牵张可以在基因水平上对纤维环细胞 Aggrecan、MMP-2和TIMP-2基因进行调节，通过调节肌动蛋白骨架从而对力学刺激产生响应。

Wuerta等［26］分别将人和牛髓核细胞培养在渗透压为300mOsm/kg，400 mOsm/kg 和500mOsm/kg 的培养基中，通过改变培养基的渗透压，发现随着渗透压的升高髓核细胞聚蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达量逐渐上升，而Ⅰ型胶原的表达量则受到抑制。Neidlinger-Wilke 等［27］从髓核细胞中的基质金属蛋白酶-3（MMP-3）mRNA 、聚蛋白聚糖两方面进行研究，结果显示随着培养基渗透压的增加，聚蛋白聚糖表达上升，MMP-3mRNA表达量出现下降。MMP-3是髓核细胞外基质降解的主要酶类，与椎间盘退变有着密切联系，能够降解层黏连蛋白、蛋白多糖、纤维连接蛋白等多种细胞外基质成分［28］。

3 操作方法

根据已报道的造模案例，目前大致可以分为2种：（1）传统的截肢造模：①乳鼠：置4℃冰箱低温处理12～15min后，用丝线结扎对肱骨近段及尾部进行结扎，然后截去双前肢。3周龄后移走母鼠开始固体饲料喂养。在此后的饲养过程中，每周对大鼠麻醉后测量身长来调整食物及饮水源的高度，诱导大鼠双后肢站立，以此训练大鼠的直立活动。②4周龄大鼠：盐酸氯氨酮 0.1g/kg行腹腔注射麻醉，将大鼠腋下备皮、碘伏消毒，取上臂中上1/3处横向切开皮肤，逐层剥离，暴露三角肌下血管神经束，予以丝线结扎，再用组织剪剪断肌肉、血管和神经，用咬骨钳咬断肱骨，碘伏擦拭后逐层缝合，最后大腿内侧予以青霉素肌注。术后饲养同乳鼠。（2）臂丛神经离断造模：采用双前肢离断容易遭实验动物伦理学挑战，肖军等［29］打破伦理困境，对肩胛间区行后正中切口，沿肩胛骨内侧缘逐层剥离菱形肌和斜方肌部分肌束，保留肩胛提肌。然后向外牵开肩胛骨，离断前锯肌止点，显露臂丛神经主干及其分支，腋动静脉，并用神经剥离子钝性分离，将桡神经、正中神经、尺神经、腋神经及胸前神经分支离断。碘伏消毒后，逐层缝合。该方法可实现大鼠双前肢废用、肩关节功能运动丧失，使上肢扶持、爬行等功能缺失，达到与传统经典的截肢手术相似的效果。

4 优势及不足

双足鼠诱导腰椎间盘退行性变是目前国际上公认的一种经典的方案，其显著优点是：（1）双足鼠可以模仿人类直立行走过程中腰椎局部受力情况，更接近人腰椎间盘退变的发病机制，符合缓慢退变的特点。（2）大鼠具有廉价、易饲养、抗病能力强等优点。（3）大鼠椎间盘在解剖结构上与人类椎间盘极为类似［30］。（4）具有较强的可操作性［31］。顾韬等［31］认为双足鼠的造模需要注意以下问题：（1）双足鼠模拟人类直立姿势的评定标准存在差异。（2）受到伦理学约束。（3）动物模型重复性中等，可调控性差，损伤大、投入大、干扰因素多。（4）漫长的实验周期和较低的成功率等弊端限制了其推广应用［17-18］。

5 前景展望

双足鼠相比于传统的四肢动物模型，更贴近人类脊柱活动的生物形态，更符合人类退变性脊柱疾病的发展规律，是一种可行性较高的造模方法。但漫长的实验周期及在此期间产生的巨大投入，较其他造模方案并无明显优势，这也在一定程度上限制其推广应用。另外，双足鼠直立姿势的评定标准还存在差异。因此，探索能够延长双足鼠的站立时间的新方法，缩短实验周期以及制定统一的直立姿势评定标准，这将是脊柱外科动物实验研究的新方向。

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310053 浙江中医药大学第三临床医学院（陶其杰）

310007 杭州市中医院（朱杭 潘浩）