玉米秸秆纤维素降解菌系的筛选及培养基碳氮源优化

张书敏， 徐凤花*， 张蕴琦， 吴 优， 代 欢

(1.东北农业大学资源与环境学院，黑龙江哈尔滨 150010；2.华中师范大学海南附属中学，海南海口 570100)

玉米秸秆纤维素降解菌系的筛选及培养基碳氮源优化

张书敏1， 徐凤花1*， 张蕴琦1， 吴 优1， 代 欢2

(1.东北农业大学资源与环境学院，黑龙江哈尔滨 150010；2.华中师范大学海南附属中学，海南海口 570100)

[目的]为加速玉米秸秆的降解，减轻对环境的压力，筛选玉米秸秆纤维素降解菌系，并使其大量扩繁，为玉米秸秆纤维素降解提供菌种资源。[方法]将富集培养的18组菌系以玉米秸秆为限制性因素，在30 ℃摇床驯化至18代酶活稳定，筛选出4组酶活较高的菌系，对优良菌系进行培养基碳氮源单因素试验，利用响应面法对其进行产酶培养基碳氮源优化。[结果]18代时，菌系3、6、12、16的羧甲基纤维素酶(CMC)酶活力分别为56.35、50.44、49.99、82.40 U/ mL，菌系16的响应面优化培养基碳源、氮源最佳比例为秸秆12.21 g/L、麸皮14.53 g/L、豆粕12.97 g/L时，酶活力最大为229.68 U/ mL，各因素对CMC酶活力的影响作用从大到小依次为豆粕、秸秆、麸皮，且秸秆与麸皮交互项对CMC酶活力的影响最为显著。[结论]筛选出的菌系16能加速玉米秸秆的降解，在优化的产酶培养基中酶活力较高。

纤维素；菌系；酶活；培养基；响应面

我国玉米秸秆资源丰富，2013年全国玉米秸秆总量为2.4亿余t，居全国各类农作物秸秆量之首[1]。黑龙江省是我国重要的商品粮基地，农作物种植面积0.140亿hm2，其中玉米种植面积0.073亿hm2，秸秆达3 600余万t[2]。玉米秸秆纤维素含量高，难降解，大量秸秆资源被废弃或焚烧，造成了严重的资源浪费和环境污染。纤维素可被某些产纤维素酶的微生物水解生成纤维素二糖或葡萄糖[3]。单菌株酶系单一，酶活力不高，因此筛选高效纤维素降解菌系是解决这一问题的有效途径。笔者以羧甲基纤维素酶(CMC)活力为评价指标，筛选出一组高效纤维素降解菌系，确定其最佳碳氮源配比，以期为菌系大量富集提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 秸秆：取自东北农业大学实验实习基地。复合菌系：取自东北农业大学资源与环境学院应用微生物研究室。蛋白胨玉米秸秆纤维素培养基：蛋白胨14.0 g，氯化钠14.0 g，碳酸钙5.6 g，酵母粉2.8 g，蒸馏水2 800 mL。于121 ℃灭菌30 min。将培养基分装18个三角瓶，每瓶装150 mL，每个三角瓶中加入3 g秸秆(秸秆分为粗、中、细3种，先称总重量54 g,之后将粗、中、细各分为18份，加入培养基内),再于121 ℃灭菌30 min。仪器设备：恒温振荡器，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；离心机，上海安亭科学仪器厂；分光光度计，四平电子技术研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 纤维素降解菌系的驯化与筛选。将东北农业大学资源与环境学院应用微生物研究室富集培养的18组菌系采用蛋白胨玉米秸秆纤维素培养基进行定向驯化培养，于第4天测定各代次CMC酶活力，通过比较CMC酶活力确定最优菌系。

1.2.2 菌系产酶培养基碳氮源的优化。

1.2.2.1 诱导碳源的优化。配置玉米秸秆粉含量为4、8、12、16、20 g/L的培养基，接入复合菌系发酵，测定CMC酶活力，优化适宜用量。

1.2.2.2 辅助碳源的优化。在确定玉米秸秆粉用量的基础上，以麸皮为辅助碳源，配置麸皮含量为5、10、15、20、25 g/L的培养基，发酵产酶，测定CMC酶活力，优化适宜用量。

1.2.2.3 氮源的优化。培养基豆粕粉用量为4、8、12、16、20 g/L，测定CMC酶活力，优化适宜用量。

1.2.2.4 培养基响应面的优化。为研究碳氮源最适用量及交互组合的最佳配比，利用Design-Expert 8.0.6软件进行碳氮源响应面优化。在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken design(BBD)模型设计3因素3水平试验，以秸秆(A)、麸皮(B)、豆粕(C)为自变量，以CMC酶活力为唯一响应值，试验设计见表1。

表1 响应面因素水平

1.2.3 CMC酶活力测定。

1.2.3.1 CMC酶活力计算公式。CMC酶活力=葡萄糖用量×稀释倍数×5.56/(酶液量×反应时间)

1.2.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制。取8支试管(20 mL)，编号后加入标准葡萄糖溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液(表2)。

表2 葡萄糖溶液的配制

将溶液摇匀后，向各试管加入1 mL NaOH和2 mL 3,5-二硝基水杨酸，摇匀后，沸水浴5 min，取出冷却后用蒸馏水定容，在波长540 nm处，以1号试管溶液调0，测定其他试管溶液的吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3.3 DNS显色法测定CMC酶活力。取20 mL试管，3次重复，做好标记。于5 000 r/min离心25 min，取1 mL到试管中，加入4 mL CMC溶液，于45 ℃水浴保温15 min,然后加入1 mL NaOH和2 mL DNS。取1个试管(不加酶液)作为空白对照，按照上述步骤进行。所有试管沸水浴5 min，冷却后用蒸馏水定容,于540 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 菌系的驯化与选育 经过蛋白胨玉米秸秆纤维素培养基18代继代培养获得菌系3、菌系6、菌系12、菌系16(图1)。从图1可见，4组菌系的CMC酶活力均随着驯化代次的增加而升高，10代以上的CMC酶活力趋于稳定，18代时菌系3、6、12、16的CMC酶活力分别为56.35、50.44、49.99、82.40 U/mL，较第1代分别提高了39%、30%、28%、64%。由此可知，菌系16为最优菌系。

图1 不同代次菌系的CMC酶活力Fig.1 The CMCase activity of strains at different generations

2.2 菌系产酶培养基碳氮源优化

2.2.1 诱导碳源玉米秸秆粉对CMC酶活力的影响。从图2可见，随着玉米秸秆粉用量的增加，CMC酶活力呈先增大后减小趋势。当玉米秸秆粉为12 g/L时，CMC酶活力最高，达到150.89 U/mL；当玉米秸秆粉用量大于12 g/L时，CMC酶活力反而逐渐降低。这可能是由于玉米秸秆粉用量的增加，培养基固形物浓度增大，导致发酵底物黏度提高，影响溶氧浓度、营养物质传递和代谢物的扩散，不利于微生物生长，从而使CMC酶活力降低。还可能是因为玉米秸秆粉用量的增加，导致碳氮比值增大，影响微生物的生长，以致酶活力降低。

图2 玉米秸秆粉对菌系16 CMC酶活力的影响Fig.2 Effects of corn straw powder dosage on the CMCase activity of 16 strains

2.2.2 辅助碳源麸皮对CMC酶活力的影响。从图3可见，随着麸皮用量的增加，CMC酶活力呈先增大后减小的趋势。当麸皮用量为15 g/L时，CMC酶活力最高，达161.91 U/mL；当麸皮用量大于15 g/L时，CMC酶活力反而降低。这与徐海等[4]的研究结果一致。这是由于麸皮主要成分是淀粉，用量增加，水解产生的还原糖量也相应增加，当麸皮用量过大会对纤维素酶的形成产生抑制。

图3 麸皮对菌系16CMC酶活力的影响Fig.3 Effects of bran dosage on the CMCase activity of 16 strains

2.2.3 氮源豆粕对CMC酶活力的影响。从图4可见，随着豆粕用量的增加，CMC酶活力呈先增大后减小的趋势。当豆粕用量为12 g/L时，CMC酶活力最高，达190.96 U/mL；当豆粕用量大于12 g/L时，CMC酶活力反而降低。

图4 豆粕对菌系16 CMC酶活力的影响Fig.4 Effects of soybean meal dosage on the CMCase activity of 16 strains

2.2.4 产酶培养基碳氮源优化。试验包括12个析因试验和3个中心试验，试验结果见表3。

对表3中的试验结果进行多元回归拟合，建立二次多项式回归模型方程：R1=+211.170 3+17.743 8A+9.595 9B+33.091 6C+19.954 8AB-6.671 8AC-4.515 5BC-33.442 7A2-36.479 4B2-16.037 9C2。

表3 Box-Behnken试验设计及结果

回归分析显示，F模型=13.88，P模型=0.004 9；FA=13.85，PA=0.013 7；FB=4.05，PB=0.100 3；FC=48.16，PC=0.001 0；FAB=8.76，PAB=0.031 5；FAC=0.98，PAC=0.367 9;FBC=0.45，PBC=0.532 8;FA2=22.70,PA2=0.005 0;FB2=27.01,PB2=0.003 5;FC2=5.22,PC2=0.071 1;F失定=9.95,P失拟=0.092 7。菌系16 CMC酶活力模型P=0.004 9,F=13.880 0，P失拟=0.092 7,R2=0.961 5，表明该模型与实际情况拟合良好，A、C、AB、A2、B2的P<0.05，说明这些独立项和交互项对菌系16的CMC酶活力的影响显著。在独立项中，A、C的P<0.05，但C的F值最大，P值最小，说明在独立项中C对菌系16CMC酶活力发挥作用最显著。在交互项中，AB组合P值最小，说明AB对菌系16的CMC酶活力发挥作用显著。由此可知，在CMC酶活力响应面分析试验中，各变量对CMC酶活力影响作用由大到小依次为豆粕、秸秆、麸皮。

不同交互项对菌系16 CMC酶活力影响的响应面见图5～7。图5、6是秸秆、麸皮保持固定时，麸皮和豆粕及秸秆和豆粕交互作用对CMC酶活力的影响，曲面坡度都较缓，且在回归分析中交互项的P>0.05，因此豆粕和麸皮及豆粕和秸秆的交互组合CMC对酶活力的影响不显著。从图7可见，豆粕保持固定的情况下，CMC酶活力随着秸秆与麸皮用量的增加而不断提高，当到达极值之后随着秸秆与麸皮含量的增加而下降，在回归分析中，交互项的P<0.05，表明秸秆与麸皮交互组合对CMC酶活力的影响显著。

图5 豆粕与麸皮交互作用的响应面Fig.5 Response surface of interaction between soybean meal and wheat bran

图6 豆粕和秸秆相互作用的响应面Fig.6 Response surface of interaction between soybean meal and straw

利用Design-Expert 8.0.6软件计算得到最佳培养基的参数：秸秆12.21 g/L、麸皮14.53 g/L、豆粕12.97 g/L，CMC

图7 秸秆和麸皮交互作用的响应面Fig.7 Response surface of interaction between straw and bran

酶活力的预测值为229.68 U/mL。验证试验表明，CMC酶活为229.14 U/mL，相对误差为2.364%，表明利用该优化方法得到的产纤维素酶培养基配方可靠。

3 结论与讨论

(1)该试验富集培养的18组菌系以玉米秸秆为限制性

因素驯化至18代，筛选出4组CMC酶活力较高的菌系。结果表明，CMC酶活力随着驯化代次的增加而逐渐提高，10代以上趋于稳定，18代时菌系16的CMC酶活力最高，达82.40 U/mL。

(2)采用响应面优化结果确定最佳碳源、氮源配比为秸秆12.21 g/L、麸皮14.53 g/L、豆粕12.97 g/L，酶活验证值为229.14 U/mL，与预测值的相对误差为2.364%，表明试验可靠。各因素对CMC酶活力的影响从大到小依次为豆粕、秸秆、麸皮，且秸秆与麸皮交互项对CMC酶活力的影响最为显著。

[1] 左旭,王红彦,王亚静，等.中国玉米秸秆资源量估算及其自然适宜性评价[J].中国农业资源与区划,2015，36(6):5-10，29.

[2] 迟德龙,刘波.谈黑龙江玉米秸秆综合利用[J].农机使用与维修,2015(7):27-28.

[3] 周俊强,邱忠平,韩云平,等.纤维素降解菌的筛选及其产酶特性[J].环境工程学报,2010，4(3):705-708.

[4] 徐海,钱卫,朱明田,等.酸水解麸皮对斜卧青霉产纤维素酶的影响[J].食品与发酵工业,1997(1):15-17.

Screening of Corn Straw Cellulose Degradation Strains and Optimization of Medium Carbon and Nitrogen Source

ZHANG Shu-min, XU Feng-hua*, ZHANG Yun-qi et al

(College of Resources and Environment, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150010)

[Objective] To accelerate the degradation of corn straw, to reduce the pressure on the environment, to screen the corn straw cellulose degradation strains, to provide the strain resources for corn straw cellulose degradation.[Method] The 18 groups of strains cultured in the laboratory were used as the restrictive factors of corn straw.They were domesticated to 18 generation at 30 ℃until the CMCase was reach stable.Four groups with relatively high CMCase activity were screened.Single factor test on medium carbon and nitrogen source was carried out for fine strains.Response surface method was used to optimize the carbon and nitrogen source.[Result] At 18 generation, the CMCase of strains 3, 6, 12 and 16 were 56.35, 50.44, 49.99 and 82.4 U/ mL, respectively.The response surface optimization of strains 16 confirmed carbon and nitrogen optimum ratio of medium were 12.21 g/L straw, 14.53 g/L bran, 12.97 g/L soybean meal, and the maximum of CMCase was 229.678 U/ mL.Factors influencing the CMCase activity was in the order of soybean meal, straw, bran.And bran and straw interaction had the most significant impact on the CMCase.[Conclusion] The strains 16 screened can accelerate the degradation of corn straw, and enhance the CMCase activity in optimized culture medium.

Cellulose; Strains; CMCase activity; Culture medium; Response surface

“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD14B06)；哈尔滨市科技成果转化项目(2014DBD3BN307)。

张书敏(1992- )，女，河南商丘人，硕士研究生，研究方向：农业废弃物无害化处理与肥料化利用。*通讯作者，教授，硕士，硕士生导师，从事农业微生物研究。

2016-09-15

S 182

A

0517-6611(2016)34-0082-03