桃色顶孢霉粗蛋白对大豆镰刀菌菌体电导率及抗氧化酶活性的影响

张雨竹，张明会，刘景辉，肖亚静，张新，孙冬梅

（黑龙江八一农垦大学，大庆 163319）

桃色顶孢霉粗蛋白对大豆镰刀菌菌体电导率及抗氧化酶活性的影响

张雨竹，张明会，刘景辉，肖亚静，张新，孙冬梅

（黑龙江八一农垦大学，大庆 163319）

为了探明桃色顶孢霉粗蛋白对大豆茄病镰刀菌的抑菌机理，测定了该粗蛋白对大豆镰刀菌菌体抗氧化酶活性及电导率的影响。结果显示，经粗蛋白处理过的菌体中过氧化物酶（POD）、过氧化氢（CAT）酶、超氧化物歧化酶（SOD）0～24 h内均为上升状态，在24 h时达到最高，分别是对照的1.95倍、2.16倍、1.67倍，随着处理时间的延长，三种酶活性均下降，在96 h时降至最低；电导率则呈现先上升后保持平稳的趋势，当处理时间为24 h时，电导率变化率达到最高，为对照组的2.1倍。上述结果表明被粗蛋白处理过的菌体膜系统遭到破坏，细胞膜通透性变大，导致电解质大量外渗，并破坏菌体细胞内原有的抗氧化酶动态平衡状态，对镰刀菌造成伤害。

桃色顶孢霉；粗蛋白；抗氧化酶；电导率；大豆镰刀菌

大豆根腐病是世界性土传真菌病害之一，广泛存在于中国各个区域。随着大豆种植面积，特别是连作面积的扩大，大豆根腐病的危害越来越大[1]。该病害在中国各地都十分严重，其中以东北地区发病最重，一般会造成减产10%～30%，严重时可达60%[2]。大豆根腐病主要发生在大豆根部，初期茎部或胚根表皮出现淡褐色小斑，后期变红褐色坏死斑，地下部分根瘤少，地上部分矮小瘦弱，植株叶片由下而上逐渐变黄，病株矮化，严重时，导致病株死亡[3]。顶孢霉属于半知菌亚门，丝孢纲，丛梗纲目，淡色菌科，全世界共105种，分布广泛。对于顶孢霉杀虫有一些报道，樊美珍自林间的青杨天牛幼虫虫尸上分离出枝顶孢霉[5]，对该菌的形态、生物学特性和对青杨天牛毒力进行了生物测定和田间防治试验，引起死亡率为48.72%，但是对于顶孢霉杀菌方面的研究还未见报道。实验室前期工作已经证实桃色顶孢霉粗蛋白对大豆镰刀菌菌丝及孢子有较强的抑制作用[2]，为了探讨桃色顶孢霉对大豆镰刀菌生长的抑菌机理，试验测定了桃色顶孢霉粗蛋白对该病原菌菌体电导率及抗逆酶活性的影响。在通常情况下，细胞膜作为分隔细胞质和胞外环境的屏障，当细胞膜受到外界环境破坏时，会使电解质大量外渗，导致电导率升高[6-8]。POD，CAT，SOD酶广泛存在于动植物体中，在植物生长发育过程中它们的活性不断发生变化，随着细胞衰老越来越高。这是因为这三种抗氧化酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标[9-10]。而大量报道显示，在外界胁迫条件下动植物体内的保护酶会发生变化[11-13]，但是对于微生物在此条件下保护酶的应激反应却鲜有报道。研究旨在通过研究桃色顶孢霉粗蛋白对病原菌体内保护酶的影响，探讨其粗蛋白抑制病原菌生长的抑菌机理，为下一步抑菌活性物质——粗蛋白的分离纯化提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

拮抗菌：桃色顶孢霉（A.percisinum）；病原菌：大豆根腐病茄病镰刀菌（F.solanae）（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院微生物实验室提供）。

1.2 供试培养基

查氏培养基：NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.02 g，蔗糖30 g，蒸馏水1 000 mL；马铃薯液体培养基（PD）：马铃薯200 g，蔗糖20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.3 粗蛋白的制备

刮取一环已经活化的桃色顶孢霉接入已灭菌的液体查氏培养基中，28℃120 r·min-1培养8～10 d后，用四层无菌纱布滤掉菌体，用两层滤纸抽滤掉孢子后，再用0.22 μm的细菌过滤器除菌后收集滤液4℃保存备用。将2 L的无菌滤液用冷冻干燥机浓缩至1 000 mL，用20%～70%饱和度的硫酸铵过夜沉淀[14]，透析除盐后用0.05 mol·L-1pH6.0的磷酸缓冲液稀释为1 000 mL，即为桃色顶孢霉粗蛋白。

1.4 病原菌的处理

用直径5 mm的打孔器在生长5 d的镰刀菌菌落同心圆环处制取菌碟，用接种针接种到PD中，27℃培养5 d。

1.5 试验设计

将PD平板上培养5 d的直径为8 cm的茄病镰刀菌菌片2个用无菌水冲洗干净后，分别置于盛有10 mL粗蛋白和不加菌的查氏培养基的烧杯中，分别处理2、4、6、8、10、12、24、48、72、96 h，将两个烧杯均放置于4℃条件下，每个处理4次重复，以不加菌的查氏培养基为对照，将测定烧杯内的电导率及菌体抗氧化酶的变化。

1.6 测定方法

电导率测定采用梅特勒电导率仪FE30 k。

抗氧化酶活性测定：

过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法，以1 min内OD470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）[15]；过氧化氢酶（CAT）活性测定采用紫外吸收法，以1 min内A240减少0．1的酶量为1个过氧化氢酶活性单位（U）[15]；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用NBT（氮蓝四唑）光化还原法，以抑制NBT光还原50%的酶量为1个酶活力单位（U）[15]。

1.7 数据统计分析软件

采用EXCEL2003进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 桃色顶孢霉粗蛋白对镰刀菌菌体电导率的影响

结果如图1所示，镰刀菌菌片经桃色顶孢霉粗蛋白处理后，随着处理时间的延长，电导率前期变化不大，缓慢增加，细胞通透性变大，当处理时间为24 h时，电导率变化率达到最高，为对照组的2.1倍，处理时间为72 h时，电导率值最高，之后电导率基本不变。对照组电导率缓慢增加，一直保持平缓状态，说明查氏培养基对镰刀菌的伤害性较小。

2.2 桃色顶孢霉粗蛋白对镰刀菌菌体内过氧化物酶的影响

从图2可以看出，实验组POD酶活性随着处理时间先升高后下降，24 h时达到最高值，为对照组的1.95倍，与对照组差异显著，当处理时间为96 h时，POD酶活性降至最低，为对照组的32.9%，与其他处理时间活性相比差异较显著。

图1 桃色顶孢霉粗蛋白处理时间对镰刀菌菌体电导率的影响Fig.1 Effects of crude protein of extracted from A.percisinum fermentation on conductivity of F.solanae

图2 桃色顶孢霉粗蛋白处理对镰刀菌POD酶活性的影响Fig.2 Effects of crude protein extracted from A.percisinum fermentation on the activity of POD enzymes

2.3 桃色顶孢霉粗蛋白对镰刀菌菌体内过氧化氢酶的影响

图3表明，随着处理时间的延长，CAT酶活性逐渐升高，当处理时间为24 h时，CAT酶活性达到最高，为对照组的2.09倍，与对照组相比差异显著，96 h时降至最低，为对照组的29.4%，且二者差异显著。

图3 桃色顶孢霉粗蛋白处理对镰刀菌CAT酶活性的影响Fig.3 Effects of crude protein of extracted from A.percisinum fermentation on the activity of CAT enzymes

2.4 桃色顶孢霉粗蛋白对镰刀菌菌体内超氧化物歧化酶的影响

结果如图4所示，SOD酶的变化趋势与POD、CAT酶趋势一致，随着处理时间的增加，在24 h时达到最大值，为对照的1.67倍，此时与其他处理时间相比差异显著，而后POD酶活性降低，在96 h时降到最低，为对照15.04%，说明POD酶对桃色顶孢酶粗蛋白的处理最敏感。

图4 桃色顶孢霉粗蛋白处理时间对镰刀菌菌体SOD酶活性的影响Fig.4 Effects of crude protein extracted from A.percisinum fermentation on the activity of SOD enzymes

3 结论与讨论

细胞膜作为分隔细胞质与胞外环境的屏障，同时也作为细胞与外界环境进行交换的通道，当细胞受到外界环境逆境伤害时，细胞内容物会大量外渗，导致电导率激增，所以电导率作为一个衡量细胞受伤程度的生理指标是合理的[16-17]。研究表明经桃色顶孢霉粗蛋白处理过的镰刀菌烧杯内电导率在24h时增长率最高，而后平缓上升，最后基本保持不变，而对照组缓慢上升，此现象说明桃色顶孢霉粗蛋白对镰刀菌细胞膜结构具有破坏功能，导致细胞膜受损，随之电解质渗漏严重。

POD、CAT、SOD与植物抗逆性密切相关[18-21]。POD是一种广泛存在于真核生物各类细胞中的重要的活性较高的酶类，在植物体内也大量存在，也和光合作用、呼吸作用相关，它会随着植物生长不断变化。一般老化细胞中POD酶含量高，幼嫩细胞中含量低，所以可将POD酶活性看作衡量细胞老化程度的生理指标。CAT普遍存在于能呼吸的生物体内，是一种酶类清洁剂，它可以促使H2O2分解为O2和H2O，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。SOD酶在生物界内的分布极广，从动物到植物，从人到单细胞几乎都有它的存在，是一种具有特殊活性，可以清除自由基的新型酶类。现在已经有研究表明SOD酶可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，减缓细胞衰亡，及时修复受损细胞。正常情况下细胞内SOD、CAT和POD 3种保护酶协调一致处于一种动态平衡状态使自由基维持在一个低水平，从而防止自由基毒害，一旦自由基这种平衡受到破坏就可能产生伤害作用[22-24]。研究表明：经桃色顶孢霉粗蛋白处理过的镰刀菌菌体内三种酶变化趋势相近，均为先升高后下降，在24 h三种酶活性达到最高，与对照组相比差异显著；结合电导率测定结果发现，电导率变化率也在24 h时，变化最大，而后期电导率基本不变，这可能与内容物大量渗出有关。而酶活性也表现出24 h后下降趋势，且在96 h时降至最低。但对照中菌体内容物渗出量比较一致，而酶活性出现升高趋势，具体原因有待进一步研究。综上所述，桃色顶孢霉粗蛋白破坏了镰刀菌菌体内原有的保护酶系统的动态平衡，导致氧自由基清除系统出现障碍，导致电解质大量外渗，菌体电导率先升高后保持不变，这可能是桃色顶孢霉粗蛋白抑制镰刀菌生长的机理之一，是否存在其他机理还有待研究。

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Effects of Crude Protein Extracted from Acremonium percisinum Fermentation on the Activity of Antioxidan Enzymes and Content of Conductivity Ratio of Fusarium solanae

Zhang Yuzhu，Zhang Minghui，Liu Jinghui，Xiao Yajing，Zhang Xin，Sun Dongmei
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to explore inhibiting mechanism of the crude protein extracted from Acremonium percisinum fermentation，the influences of the crude protein on the activity of antioxidan enzymes and content of conductivity ratio were discussed.The results showed：the activity of POD，CAT and SOD in mycelium all increased after treated with crude protein from 0 to 24 h.The three antioxidan enzymes all reached to the maximum value at 24 hours，which was 1.95，2.16 and 1.67 times than that of the control，respectively.As the time extended，the three antioxidan enzymes all decreased，and the minimal values occurred at 96 hours.The conductivity of the mycelium showed the tendency increased at first and then was stable.The change ratio of conductivity reached the highest after treated by crude protein for 24 h and the value was 2.1 times than that of the control.Above all，these results indicated the destroy of mycelium membrane system，the larger of membrane permeability and the leakage of electrolyte.So the balance of antioxidan enzymes system was destroyed，and then mycelium was dead.

Acremonium percisinum；crude protein；antioxidan enzymes；conductivity；Fusarium solanae

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.014

S476.+9

A

1002-2090（2016）05-0073-04

2015-12-22

黑龙江省研究生创新项目（YJSCX2015-Y61）。

张雨竹（1990-），女，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院2013级硕士研究生。

孙冬梅，女，教授，E-mail：7981004@qq.com。