吴江地区多重耐药鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因携带情况及同源性

朱善军，倪晓艳，吴巧珍，沈国荣，陆静芬，朱同华，沈 昊，马春芳

(南通大学附属吴江区第一人民医院，江苏 吴江 215200)



吴江地区多重耐药鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因携带情况及同源性

朱善军，倪晓艳，吴巧珍，沈国荣，陆静芬，朱同华，沈 昊，马春芳

(南通大学附属吴江区第一人民医院，江苏 吴江 215200)

目的 了解吴江地区临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)碳青霉烯酶基因携带情况和同源性。方法收集吴江地区3所综合性医院2010年1月—2013年12月临床分离的非重复MDRAB 44株，测定其最低抑菌浓度(MIC)；采用聚合酶链反应(PCR)扩增碳青霉烯酶基因OXA-51、OXA-23、OXA-24、OXA-58、IMP、TEM、SHV和GES，脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株同源性。结果44株MDRAB主要来源标本为痰(占93.18%)，主要分布在重症监护病房(ICU)、呼吸科和神经外科，各占45.45%、27.27%和13.64%；MDRAB对米诺环素和多粘菌素B均敏感，对哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星耐药率均为100.00%，对亚胺培南和美罗培南耐药率均为97.73%。44株MDRAB均检出OXA-51、OXA-23和TEM基因，其中12株菌GES基因阳性，OXA-58和SHV基因阳性各1株，未检测到OXA-24及IMP基因；MDRAB分为A—G 7个型别，分别为19、3、9、3、1、4、5株。A型主要来源于吴江地区的两所大型综合性医院(吴江第一人民医院和盛泽医院)，吴江第一人民医院未发现B、D和E型；E型仅1株，分布在永鼎医院，其余型别散在分布。结论吴江地区临床分离鲍曼不动杆菌多重耐药严重，基因OXA-23和TEM是鲍曼不动杆菌多重耐药的主要原因，并以A、C型为主，呈克隆性传播。

鲍曼不动杆菌； 碳青霉烯酶基因； 多重耐药； 脉冲场凝胶电泳； PFGE

[Chin J Infect Control，2016，15(12)：913-916,933]

鲍曼不动杆菌是医院感染的重要条件致病菌，其感染日益增多，仅次于铜绿假单胞菌和大肠埃希菌[1]。随着广谱抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制剂等的应用，以及介入性医疗操作的广泛展开，使多重耐药鲍曼不动杆菌(multidrug-resistantAcinetobacterbaumannii，MDRAB)的临床分离率日益增高[2]，其引起的医院感染已成为全球关注的公共卫生问题[3]。为了解吴江地区临床分离的MDRAB的耐药现状，探讨其流行趋势、耐药机制及同源性，对吴江地区3所综合性医院临床分离的44株MDRAB进行相关研究，以期为控制和预防耐药鲍曼不动杆菌感染提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 收集2010年1月—2013年12月吴江地区3所综合性医院(吴江第一人民医院、盛泽医院、永鼎医院)各类临床标本分离的44株非重复的MDRAB，所有菌株均经法国梅里埃API细菌鉴定系统或VITEK 2全自动微生物鉴定系统鉴定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853和金黄色葡萄球菌ATCC 29213。

1.1.2 抗菌药物 包括亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、头孢吡肟、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、多粘菌素B、哌拉西林、米诺环素和氨苄西林/舒巴坦。

1.1.3 仪器与试剂 VITEK 2鉴定仪(法国生物梅里埃公司)、SDS-PAGE电泳仪(美国Bio-Rad 3000XI公司)、9600型基因扩增仪(美国PE公司)、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)、CHEF-MAPPER 脉冲场凝胶电泳仪(南京军区南京总医院中心实验室提供)；MH琼脂购自英国Oxoid公司，DNA提取试剂盒购自Qiagen公司，DNA marker购自大连宝生物公司，其余均为国产分析纯试剂；引物由南京生兴生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 采用琼脂稀释法测定12种抗菌药物的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，结果判定按美国临床实验室标准化协会(CLSI)2012年标准[4]进行。

1.2.2 耐药基因检测 参照文献[5]合成引物，见表1。细菌基因组提取步骤参照试剂盒说明书。PCR反应体系为：Taq Mix 25 μL，引物各1 μL，模板1 μL，用Rnase Free dH2O 补至50 μL。扩增参数为94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s 进行30个循环，72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统中拍照。

表1 目的基因PCR扩增引物序列

Table 1 Primer sequences of PCR amplification for targeted genes

目的基因引物序列扩增片段大小(bp)OXA-51P1:5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’353P2:5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’OXA-23P1:5’-TGTGCTGGTTATTCAAAC-3’216P2:5’-ATGGCTTCTCCTAGTGTC-3’OXA-24P1:5’-TGACTTTAGGTGAGGCAATG-3’223P2:5’-AAAGGTAATCGGTTATGTGC-3’OXA-58P1:5’-TATGGCACGCATTTAGAC-3’509P2:5’-AAACCCACATACCAACCC-3’IMPP1:5’-CATGGTTTGGTGGTTCTTGT-3’582P2:5’-ATAATTTGGCGGACTTTGGC-3’SHVP1:5’-GGTTATGCGTTATATTCGCC-3’865P2:5’-TTAGCGTTGCCAGTGCTC-3’GESP1:5’-ATTTGCTGATTTCGCTCGG-3’392P2:5’-TTAGCGTTGCCAGTGCTC-3’TEMP1:5’-ATCAGCAATAAACCAGC-3’516P2:5’-CCCCGAAGAACGTTTTC-3’

1.2.3 脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)分型 将35 ℃培养过夜的细菌用低熔点胶灌模，蛋白酶K消化48 h，限制性内切酶Apa I酶切12 h，电泳条件为1%琼脂糖胶，0.5×TBE 缓冲液，14℃，6 V/cm，120°，脉冲时间5～20 s，电泳22 h后EB染色，紫外灯下观察结果。判断标准参考Tenvoer分型方法：大多数流行病学相关带型大小和数量相同的菌株被认为是同一类型；由于突变、插入、缺失或倒置的遗传改变在电泳带型上与主要表型有3个或3个以下差别的菌株被认为是同一型别的不同亚型；带型中有4或4个以上不同之处不能用1次或2次遗传变化解释的，被认为是不同型别。

2 结果

2.1 MDRAB来源标本及科室 MDRAB标本来源：41株(93.18%)来源于痰标本，其余3株分别来自脑脊液、导管和胸腔积液。MDRAB主要分布于重症监护病房(ICU)、呼吸科、神经外科和急诊科，分别占45.45%、27.27%、13.64%、9.09%。

2.2 药敏结果 MDRAB对米诺环素和多粘菌素B均敏感，对哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星耐药率为100.00%，对亚胺培南和美罗培南均为97.73%。见表2。

表2 44株MDRAB对11种抗菌药物的药敏试验结果

2.3 耐药基因检测结果 44株MDRAB均检出OXA-51、OXA-23和TEM基因，其中12株菌GES基因阳性，OXA-58和SHV阳性各1株，未检测到OXA-24及IMP基因。见图1。

M：DNA marker；A1—8泳道：OXA-23基因阳性；A9—11泳道：OXA-51基因阳性；B1—4泳道分别为GES、TEM、SHV、OXA-58基因阳性

图1 MDRAB耐药基因PCR扩增电泳图

Figure 1 Electrophoresis map of PCR amplification products of MDRAB drug-resistant genes

2.4 PFGE分型 MDRAB分为A—G 7个型别，分别为19、3、9、3、1、4、5株。A、C型可分成2个亚型，A1亚型11株，A2亚型8株，C1亚型5株，C2亚型4株。A型主要来源于吴江地区的两所大型综合性医院(吴江第一人民医院和盛泽医院)，吴江第一人民医院未发现B、D和E型，E型仅1株，分布在永鼎医院，其余型别散在分布。见图2、表3。

图2 部分MDRAB的PFGE结果

Table 3 PFGE genotyping and distribution of 44 MDRAB strains

医院PFGE型别(株)A1A2BC1C2DEFG吴江第一人民医院560320021盛泽医院521102013永鼎医院102121111合计1183543145

3 讨论

鲍曼不动杆菌是医院感染的重要病原菌，由该菌引起的医院感染和暴发事件不断增多[6]。本研究结果显示，3所医院分离的MDRAB主要来源于痰标本，3所医院患者主要为MDRAB引起的下呼吸道感染，与国内相关报道[7]一致；ICU的所占比率最高，可能与患者病情多危重，常并发严重感染，免疫防御功能低下，且长期或联合使用广谱抗菌药物及接受侵入性操作(如气管插管、静脉置管)等有关。

本研究收集的44株MDRAB对米诺环素和多粘菌素B均敏感，对哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星全耐药，对碳青霉烯类药物耐药率>97%，耐药情况严重；对氨苄西林/舒巴坦全耐药可能与舒巴坦复方制剂的临床应用增多有关[8]。

鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制十分复杂，其中产碳青霉烯酶是最主要的耐药机制。鲍曼不动杆菌中发现的碳青霉烯酶主要为A、B和D三类酶。其中A类碳青霉烯酶包括SHV型和GES型；B类碳青霉烯酶包括IMP型；D类碳青霉烯酶又称OXA型碳青霉烯酶，该类酶又根据其核苷酸序列特点可分为4个型，分别为基因OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58，因此本研究主要对上述基因进行检测。44株MDRAB均携带OXA-23、OXA-51和TEM，其携带率高于其他文献报道[9-11]，其次携带率较高的是GES基因，OXA-58和SHV基因阳性菌株均仅1株，说明本地区流行的MDRAB可同时产生多种β-内酰胺酶，上述基因可能是本地区鲍曼不动杆菌多重耐药的重要机制之一，但研究中的产酶株是否伴有其他耐药机制，仍有待进一步实验证实。

PFGE分型是目前国际上公认的病原菌同源分析的金标准。PFGE条带结果显示，44株MDRAB菌株有7种基因型，以A型(19株)和C型(9株)为主，其余型别以散发形式存在。由于ICU住院患者具有病情重、自身免疫力低下和侵入性操作多等特点，易出现医院感染暴发流行。在研究期间，A型克隆株为ICU主要流行菌株，A1亚型存在时间跨度最长，从2010年5月第1次分离，到2013年2月仍有此亚型的临床分离株出现，提示该克隆株可能长期存在于ICU，并通过某种途径造成交叉感染。本研究未能获取环境标本，未及时进行追根溯源工作。工作中应及时对仪器、环境消毒灭菌，严格执行手卫生，条件允许时开展对医院暴发感染的及时追踪、分析并切断传播途径，减少和杜绝医院感染。此外，本研究发现，3所医院均检出A1型克隆，可能与鲍曼不动杆菌带菌患者到多所医院就诊，导致传播有关。结合临床资料显示，吴江第一人民医院有2例A1克隆株患者曾于2012年11月2日在盛泽医院ICU住院，有1例A1克隆株患者曾于2013年4月23日在永鼎医院ICU住院。此时期3所医院存在某种MDRAB的暴发流行，并可能以克隆株的的形式在病房内、病房间，甚至医院间进行传播。

综上所述，克隆播散是MDRAB的主要传播方式，同时携带OXA-23和TEM多种耐药基因是鲍曼不动杆菌多重耐药的主要原因，临床MDRAB泛耐药情况严重且存在院内和院间流行，应加强医护人员在日常工作中的无菌观念，防止交叉感染，避免克隆株流行。

[1] 毛璞，傅威，杨淳，等. ICU分离的多重耐药鲍曼不动杆菌PFGE分型及I型整合子介导的耐药研究[J].中国感染控制杂志，2012，11(6):417-421.

[2] 杨启文，王辉，徐英春，等. 2009年中国13家教学医院院内感染病原菌的抗生素耐药性监测[J].中华检验医学杂志，2011，34(5):422-430.

[3] Falagas ME, Bliziotis IA. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the post-antibiotic era?[J]. Int J Antimicrob Agents, 2007, 29(6):630-636.

[4] Wikler MA. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: Sixteenth informational supplement, vol. 26: Clinical and Laboratory Standards Institute[M]. 2012.

[5] Jeong SH, Bae IK, Park KO, et al. Outbreaks of imipenem-resistantAcinetobacterbaumanniiproducing carbapenemases in Korea[J]. J Microbiol, 2006, 44(4):423.

[6] 方艳平，张耀康，江凌晓，等.多重耐药鲍曼不动杆菌医院感染同源性分析[J].实用医学杂志，2013，29(20):3409-3411.

[7] 李茜，李庆淑，李智，等.青岛两所医院鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因及同源性分析[J].中国感染控制杂志，2015，14(7):437-442.

[8] 马明远，徐杰，于娜，等. 综合ICU内鲍曼不动杆菌的耐药性和相关因素分析[J]. 中华危重病急救医学，2013，25(11):686-689.

[9] 姚庆完，何友华. 江苏省昆山地区耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的耐药性及碳青霉烯酶基因型分析[J]. 山东医药，2014，54(15):46-48.

[10] 邢丽丹，糜祖煌，徐鑫鑫，等.多重耐药鲍曼不动杆菌中β内酰胺酶基因的检测[J].中国感染与化疗杂志，2014，14(1):54-57.

[11] 孟小斌，张国雄.耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染暴发的分子流行病学研究[J].中国感染控制杂志，2013，12(3):173-177，181.

(本文编辑：豆清娅)

Carriage and homology of carbapenemase genes of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii in Wujiang

ZHUShan-jun,NIXiao-yan,WUQiao-zhen,SHENGuo-rong,LUJing-fen,ZHUTong-hua,SHENHao,MAChun-fang

(WujiangFirstPeople’sHospital,NantongUniversity,Wujiang215200,China)

Objective To investigate the carriage and homology of carbapenemase genes of multidrug-resistantAcinetobacterbaumannii(MDRAB) in Wujiang area.Methods A total of 44 non-duplicated MDRAB isolated from patients in 3 general hospitals in Wujiang area from January 2010 to December 2013 were collected. Minimum inhibitory concentrations(MICs) were detected, carbapenemase genesOXA-51,OXA-23,OXA-24,OXA-58,IMP,TEM,SHV, andGESwere amplified with polymerase chain reaction(PCR), homology of strains was detected with pulsed-field gel electrophoresis(PFGE).Results 44 MDRAB strains were mainly collected from sputum (93.18%), mainly distributed in intensive care unit (ICU), department of respiratory diseases, and department of neurosurgery, accounting for 45.45%, 27.27%, and 13.64% respectively; MDRAB were both sensitive to minocycline and polymyxin B, resistance rates to piperacillin, ampicillin/sulbactam, ceftazidime, gentamicin, amikacin, and ciprofloxacin were all 100.00%, resistance rates to imipenem and meropenem were both 97.73%. 44 MDRAB strains were all detectedOXA-51,OXA-23 andTEMgenes, 12 strains were positive forGESgene, 1 strain was positive forOXA-58 andSHVrespectively,OXA-24 andIMPgenes were not found ; MDRAB were divided into 7 types of G-A, which included 19, 3, 9, 3, 1, 4, and 5 strains respectively, type A was mainly from two large general hospitals in Wujiang area (Wujiang First People’s Hospital and Shengze Hospital), type B, D and E strains were not detected in Wujiang First People’s Hospital, type E strain was only 1 isolate and was from Yongding Hospital, the other types were sporadically distributed.Conclusion Multidrug resistance of clinically isolatedAcinetobacterbaumanniiis serious in Wujiang area,OXA-23 andTEMgenes are major causes of multidrug resistance inAcinetobacterbaumannii, the main types are A and C, which present clonal spread.

Acinetobacterbaumannii; carbapenemase gene; multidrug resistance; pulsed-field gel electrophoresis; PFGE

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.12.004

2016-03-20

吴江第一人民医院基金资助项目(201417)

朱善军(1984-)，男(汉族)，山东省临沂市人，检验技师，主要从事微生物及肿瘤分子诊断研究。

马春芳 E-mail:njmacf@163.com

R181.3+2 R378.99

A

1671-9638(2016)12-0913-05