Toll样受体在脑缺血预处理中的作用

张静波 赵磊 岳亮 刘海啸 李霞 林艳 屈延

(第四军医大学: 1唐都医院神经外科; 2学员旅; 3科研部，陕西 西安 710038)

·综述·

Toll样受体在脑缺血预处理中的作用

张静波1,2赵磊1岳亮1刘海啸1李霞1林艳3屈延1*

(第四军医大学:1唐都医院神经外科;2学员旅;3科研部，陕西 西安 710038)

TOLL样受体; 缺血预处理; 血脑屏障

脑损伤分为脑缺血与脑出血两种类型，相对于出血性脑损伤多种多样的治疗方法，缺血性脑损伤显得十分棘手，目前来讲，血栓溶解疗法是缺血性脑损伤的唯一治疗途径。因此，缺血性脑损伤的治疗仍是一大难题[1]。

最新研究发现，预处理作用是一种能够对抗缺血性脑损伤的方式，其依赖于机体对阈下损伤、刺激的反应，这类反应将会有助于对抗随后更为严重的损伤。而能够促进预处理作用发生的因素包括：麻醉、药物、炎性因子、短暂的缺血等[2]。

最近部分研究表明，Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)在脑损伤中的活动极为复杂。尽管TLR能够使缺血性损伤恶化，但是缺血性损伤前，TLR的短暂激活却能够降低继发损伤[3-4]。这说明TLR活化作用的利弊取决于受体刺激的时间与强度，因此，TLR的神经保护功能在预防性治疗中拥有巨大潜力。

一、TLR受体简介

从结构上看，TLR的胞外段由大量的亮氨酸重复序列组成，胞内段是toll/白介素-1受体(Toll/interleukin-1 receptor, TIR)结构域，用以激活下游信号通路。TLR主要分布在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞以及自然杀伤细胞表面，而在神经系统中，则主要表达于小胶质细胞和星形胶质细胞中。

从功能上看，源自(异质)二聚体的TLR能够与其同源配体结合(有些需要协同分子或其他辅助分子的共同参与)，进而激活信号通路，表达炎性介质因子以及抗菌效应分子[5-8]。TLR还能与包含TIR结构域的接头分子结合，从而激活细胞内的信号通路。目前，已经发现4种接头分子：分别是髓样分化蛋白88 (myeloid differentiation primary response gene88, MyD88)、包含TIR结构域的接头蛋白(Toll/lL-1R domain-containing adaptor protein, TIRAP)、诱导干扰素-β的含有TIR结构域的接头蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing INF-β, TRIF)和TIR依赖的接头分子(TIR-related adaptor molecule, TRAM)。

二、TLR的神经保护作用

研究发现，在小鼠模型中，其中脑动脉会由于短暂缺血的预处理作用(ischemic preconditioning, IP)而闭塞10～15 min，这将会减轻小鼠在1 d后发生的中脑动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)中受到的损伤。而在TLR4基因缺陷的小鼠体内，短暂缺血诱导的预处理保护作用比之野生型小鼠显著降低，这一研究结果说明TLR4在短暂缺血诱导的预处理作用中有着至关重要的作用[9]。另有研究表明，在小鼠模型中，低剂量的TLR2-4、TLR7以及TLR9的配体均能缩小脑卒中梗死面积[10-14]。这种TLR预处理作用诱导的神经保护作用十分依赖于时间和剂量的选取，例如，由TLR4的配体脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、TLR7受体激动剂(gardiquimod)以及TLR9的配体胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(cytosine-phosphate-guanine, CpG)诱导的预处理作用需要1 d生成，持续大约7 d，在14 d时消失[11]。因此，TLR预处理诱导的保护作用通路对于明确内源性神经保护作用的机制至关重要，而这一过程将有助于脑卒中治疗新靶点的发现。

通过基因技术的分析，研究人员已经发现基因组的改变与预处理导致的神经保护作用之间存在联系。研究人员通过比较TLR4配体脂多糖、TLR9配体CpG、IP引起的三种预处理模型的基因改变，发现基因中的一个序列特异性的诱导缺血性损伤之后的反应，而这一段序列仅出现于这三个预处理模型中，在未经预处理的脑卒中模型中并没有这段基因出现。通过分析这段基因的启动子区，研究人员发现其包含一个需要干扰素调节因子(interferon regulatory factor, IRF)调节转录的序列[12]。为了更加明确IRF与预处理诱导的保护作用之间的关联性，研究人员使用Lps、CpG以及IP预处理了IRF-3或IRF-7缺陷小鼠，之后人为造成脑卒中，由于LPS和CpG的预处理作用均需要IRF转录因子的参与，因此只有IP预处理组产生保护作用[12]。这些数据均表明TLR4、TLR9预处理通过IRF3、IRF7通路诱导神经保护作用。在上一实验中，IP组的保护作用只是减弱而未消失，说明IP预处理作用只部分依赖于IRF3、IRF7通路，这一结果与Pradillo等[5]的研究结果一致。同时这些数据都说明这三种预处理激活的IFN关联性反应对于神经保护作用至关重要。

发生脑缺血后，与未经预处理的动物相比，经过LPS预处理的动物中干扰素-β (interferon-β, IFN-β)水平会明显升高，这一研究结果证明了干扰素(interferon, IFN)在预处理诱导的保护作用中十分重要[13-15]，而更为重要的是，脑室内的外源性IFN-β能够在脑缺血后立即减轻其损伤的程度[13]。体外培养实验中，IFN能够提高神经元在兴奋毒性物质下的存活率，说明IFN能够在兴奋毒性损伤时直接保护神经元[16]。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)也是TLR预处理作用中的重要因子。尽管在脑卒中后TNF起到促进损伤的作用，然而LPS和CpG预处理作用仍需要TNF来诱导保护作用。TNF缺陷小鼠的LPS、CpG预处理作用会明显降低，这证明了TNF在预处理中的重要性[8,11]。在注射LPS引起预处理作用的数小时内，中枢系统中的TNF会明显上升[11]。因此可以认为LPS诱导的TNF上升是一种早期信号，这种信号通过限制随后的TNF信号传导使大脑能够应对随后的缺血性损伤[11]。

综上所述，TLR4配体LPS、TLR9配体CpG诱导的预处理作用均需要TNF、IRF3和IRF7的参与，却都不需要干扰素α受体(IFN-α receptor, IFNAR)的参与[11]，这说明TLR信号通路能够直接激活IRF转录因子而不需要IFNAR的参与。与之相反，TLR7与TLR3配体所引导的预处理作用则需要IFNAR的参与[6,17]。因此，保护作用的特异性机制取决于配体的不同。

总而言之，脑卒中诱导了损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMP)分子的释放，进而激活TLR，在未经预处理的动物模型中，TLR的激活引起了炎性反应的发生，导致缺血性损伤的恶化。反之，在经过预处理的动物模型中，TLR配体的预处理作用延迟了TLR的活化。因此，干扰素调节因子IRF/IFN能够支配TLR反应的启动信号，进而减轻缺血性损伤。

三、TLR预处理作用的靶点

TLR预处理诱导的神经保护作用的信号通路正在逐渐被揭示，然而该保护作用的活性位点却尚不清楚。TLR主要表达与抗原提呈细胞中，如B细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞、淋巴组织。而在大脑中，TLR主要表达于小胶质细胞、星形胶质细胞[18-19]。因此，大脑和外围的细胞是TLR配体激活的靶点，而它们在TLR预处理诱导的保护作用中至关重要。在外围细胞感染病毒的研究中，TLR配体的系统性调节会影响到大脑中的基因表达，且这种影响不需要跨过血脑屏障[20]。腹腔内注射多聚胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid, poly I∶C) 3 h后，提取血浆并注射入动物幼体，将引发后者脑内的炎性反应，而血浆中只能检测到微量的poly I∶C。综上所述，可以推断poly I∶C能够跨过血脑屏障并直接影响到脑实质的细胞，甚至有可能间接地影响到大脑基因的表达[20]。

为了研究预处理作用是直接还是间接作用于大脑，研究人员建立了TLR9骨髓嵌合体小鼠模型(这种小鼠只在造血干细胞或内皮细胞中表达TLR9，且不会同时在二者中表达)，研究人员发现CpG预处理作用诱导的神经保护作用在这种小鼠中是缺失的[21]。这些数据说明TLR9诱导的神经保护作用需要TLR9各种细胞中表达，且内皮细胞与造血干细胞之间一定有着重要的相互作用。因为内皮细胞与造血干细胞表达TLR，而身体内的TLR配体会同时直接接触循环中的造血细胞以及内皮细胞，潜在的改变这二者之间的相互作用，而这种相互作用极有可能通过激活通向大脑的信号通路，从而引起基因的表达和再编译[22]。

TLR配体也可能越过血脑屏障(blood brain barrier, BBB)直接作用于脑细胞，实验发现，在皮质神经元中，TLR配体诱导保护作用能够防止糖氧剥夺的发生[8-9,11]这说明TLR配体能够直接保护神经元免受损伤。

四、TLR预处理与血脑屏障

血脑屏障(BBB)是具有选择性的物理屏障，其介于血管与大脑之间，由大脑内皮毛细血管以及内皮细胞构成。完整血脑屏障中相邻内皮细胞之间的紧密连接蛋白能够限制血管和大脑之间的分子交换。血脑屏障内皮细胞与脑实质中的星形胶质细胞、小胶质细胞紧密相连，这一复合体构成了神经系统微环境稳态的基础。因此，血脑屏障中的内皮细胞是TLR配体传递信号最初经过的区域。

最近一些研究表明，TLR预处理作用可以直接影响到血脑屏障，研究人员利用试管中的血脑屏障模型(这种模型具有血脑屏障的特有功能)，证实了有着TLR3配体—多聚胞苷酸多聚赖氨酸(polyester-IC-polyester-L-lysine, Poly-ICLC)(主要成份：羧甲基纤维素，聚肌胞苷酸，多聚赖胺酸双股RNA)、黑素瘤差异化相关基因5 (melanoma differentiation-associated gene-5, MDA5)和维甲酸诱导基因I (retinoic acid-inducible gene I, RIGI)的脑缺血模型中预处理作用的效果，poly-ICLC的预处理作用极大地降低了糖氧剥夺(oxygen glucose deprivation, OGD)对于转移上皮电阻(trans epithellal electric resistance, TEER)的影响，从而保护了血脑屏障的功能[17]。此外poly-ICLC预处理作用还能够保护紧密连接蛋白，从而保护血脑屏障的功能[17]。

在实验中，poly-ICLC诱导的血脑屏障保护作用依赖于IFNAR信号通路，事实上，研究人员发现poly-ICLC能够在发生糖氧剥夺前诱导星形胶质细胞/小胶质细胞的IFN-β保护作用[16]。培养物中IFN-β基因缺陷胶质细胞的神经保护作用会发生缺失，说明了poly-ICLC诱导保护作用需要IFNAR信号通路的参与。此外，IFNAR基因缺陷的内皮细胞同样不会产生poly-ICLC预处理诱导的保护作用。基于这些结果，研究人员认为神经系统内的poly-ICLC可以通过血脑屏障的内皮细胞，并作用于胶质细胞，刺激这些细胞产生IFN-β。随后，IFN-β能够与其受体(IFNAR)结合并传导信号至BBB另一侧的内皮细胞，从而稳定内皮细胞并提供保护作用。这是首次通过实验证明了poly-ICLC诱导的保护作用能够减轻脑缺血引起的血脑屏障功能障碍。更为重要的是，这一机制是TLR介导的神经保护作用中重要的一环，并且它证明了血脑屏障信号通路的靶向治疗在防止脑卒中中充满潜力。

五、总结

TLR不但在免疫反应中扮演重要角色，其在缺血性脑损伤中的作用亦不可忽视。更为重要的是，由于TLR活性调节引起的预处理作用能够产生神经保护作用以耐受缺血性损伤，因此，TLR的预处理作用将在缺血性脑损伤的预防治疗中大放异彩。总的来说，TLR的预处理作用能够很好地防止大脑损伤。这一概念已经被应用于临床治疗中，即利用某一器官短暂的缺血再灌注诱导其他器官的缺血耐受性。有一项研究发现，肢体部位的预处理作用能够为心脏外科手术提供保护，并在接下来的6个月中减轻大脑缺血性损伤，这说明预处理作用所产生的保护作用已经扩散至脑部。由于注射方便，使用TLR激动剂在外科手术前以及脑卒中的预防治疗中成为一项不错的选择。

目前，部分TLR配体已经被批准使用于食物和药物，卡介苗便是其中一种，它是TLR2和TLR4的激动剂，被广泛引用于结核的免疫和膀胱原位癌的免疫疗法中[23]。这一进展使得临床治疗更为可靠。

TLR预处理作用的研究会为人类带来两大进展：①对这类物质特性的研究将有助于预防疗法的发展，并为筛选脑卒中和围手术期缺血损伤的高危患者提供参考；②揭示内源性神经保护的分子机制。这些研究将会为缺血性损伤的治疗提供新的途径并且在临床中取得更大的进展。

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1671-2897(2017)16-368-03

国家自然科学基金资助项目(81222015; 81571215)；教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目(NCET-12-1004)；科技部创新人才推进计划中青年科技创新领军人才资助项目(2013RA2181)

张静波，本科生，E-mail:49554556@qq.com

*通讯作者：屈延，教授，博士生导师，E-mail:yanqu0123@163.com

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2015-10-26；

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