X染色体失活与逃逸

冼诗瑶 译 周祎 校

(中山大学附属第一医院 妇产科胎儿中心；广东 广州 510080)

X染色体失活与逃逸

冼诗瑶 译 周祎 校

(中山大学附属第一医院 妇产科胎儿中心；广东 广州 510080)

X染色体失活是一种可以导致雌性哺乳类动物随机沉默其中一条X染色体的现象，它在1961年被Mary Mary Lyon所发现。Mary Frances Lyon于2014年去世，谨以此综述献给Mary Frances Lyon。她曾经推测出许多X染色体失活的特征，例如X失活中心的存在、L1元件在沉默传播中的作用及X失活逃逸基因的存在。本文将以她的研究成果作为引子总结这一领域的研究进展。

X染色体；X失活；X失活逃逸

1 Lyon定律

“这种嵌合表型可能是由于胚胎发育早期出现了X染色体的随机失活所导致的”[1]

“因此，人类性连锁基因杂合子表现的差异性是人类表型差异的其中一种类型，而这种现象与假设存在X染色体随机失活所预测的结果是一致的。”[2]

通过对雌性老鼠X连锁的皮毛颜色(例如，斑纹)控制基因突变的杂合性研究，结合1959年Welshons和Russell[3]发现X0老鼠可以存活的现象，以及1960年Ohno和Hauschka[4]发现雌性细胞中含有异固缩的X染色体的研究成果，Mary Lyon[1]在1961年提出了她的X染色体失活(X-chromosome inactivation，XCI)假说。她认为老鼠皮毛颜色的多样化是由于不同细胞内出现了X染色体随机失活并随后克隆式增长繁殖所导致的。类似的皮毛杂色现象也见于拥有X染色体发生常染色体Cattanch插入的雌性老鼠身上。Mary Lyon预测，她的XCI假说同样适用于人类[2]，而她这个假说现在已被认为是定律了。XCI的主要效果是使哺乳类动物中雌雄间X连锁基因表达剂量平衡，形成剂量补偿效应。另一种使X连锁基因与常染色体间基因表达平衡的剂量补偿机制为上调活性X染色体上的基因表达水平[5,6]。因此XCI也防止了具有两条X染色体的雌性细胞中X-连锁基因出现过度表达[7]。早期对于雌性老鼠移植前胚胎的研究证实了X连锁基因存在半表达现象，因此确定了随机XCI的发生时机[8,9]。雌性X连锁等位基因的其中之一沉默，随后会将这种沉默克隆式地传递给下一代的体细胞。Mary Lyon[10]提出了XCI的3个主要步骤：启动、传播和维持。

2 X失活中心和XCI启动

“因此X染色体失活的发生并不是每个点独立进行的，可能存在一些失活中心，而失活则是从这些中心向外传播的。”[11]

当发生X染色体和常染色体发生易位时，基因沉默现象可蔓延到易位至X染色体的常染色体片段上。基于这个研究结果，Lyon和Russell[11,12]提出了XCI的启动需要有一个X失活中心(X-inactivation centre,XIC)存在的假设。随后通过对其他X染色体与常染色体易位或其他类型的X染色体重组病例中XCI形式的研究，老鼠和人类X染色体上的XIC区域定位也被确认了[13,14]。接下来的研究方向就是寻找XIC中启动必须的关键分子元件。

最终发现这个关键元件是一个编码一种叫X失活特异转录本(X inactivate-specific transcript,Xist)的长非编码RNA的基因。XIST是由Carolyn Brown和Hunt Willard首次在人类中发现的。他们结合XIST在XIC中的定位以及在人类体细胞中它仅特异存在于女性个体中这一独特表达模式，找到了这种长非编码RNA就是XCI的关键因素[15,16]。类似的Xist基因随后在老鼠中被发现，并且发现其在老鼠胚胎发育的关键时期中表达[17,18]。XIST/XistRNA 顺式覆盖在失活的X染色体上，因此通过标记RNA-FISH的方法可以在体细胞细胞核内发现XIST/XistRNA呈现为云团状信号[19]。随后的研究表明，将含有Xist的XIC插入至常染色体中可以诱导出现远距离的沉默，以及Xist的缺失和突变会干扰XCI功能[20,21]。Xist及XIC内的所有元件(包括其他lncRNAs和控制元件)的作用目前仍处于进一步研究阶段[22,23]。在老鼠的早期发育中存在两个沉默期，第一次沉默期发生在受精后第4天，此时，父源性X染色体发生印迹失活(imprinted XCI)[24]。这种父源性X染色体印迹失活持续存在于胚外细胞团中[25,26]，与此同时，内细胞团随后发生X染色体复活并在囊胚期发生随机XCI[27]。XCI取决于Xist的表达水平，而Xist的表达则受控于其反义RNATsix及XIC中一系列lncRNAs[28]。在XIC中也包含着蛋白编码基因Rnfl2，其表达产物可以剂量依赖性地激活Xist的表达[29]。全能因子如OCT4及NANOG通过调控Xist及Tsix的表达，防止如胚胎干细胞(ES)这样的多功能细胞出现XCI[30]。培育干细胞的诱导分化可以激发随机XCI发生，这一现象大大的促进了实验研究的发展。

令人意外的是，在人类和兔子中，XCI的启动是延迟的，父源性和母源性的X染色体于发育早期的一部分细胞中发生随机沉默[31]，因此，跳过了在老鼠中所观察到的印迹XCI这一步骤。同样XIC的构成和作用在人类和老鼠间也是存在差异的。在老鼠中反义TsixRNA和/或它的转录本在老鼠的Xist调节中发挥着关键作用，但在人类中则不然[32]。还有一些关键的问题仍悬而未决，例如：保证二倍体细胞中仅一条X染色体保持活化状态的机制是什么；Tsix可能可以阻止活化的X发生沉默[33]。哪一条X染色体发生沉默的选择机制目前仍未明晰，其中一个重要的因素是X控制元件(Xce)位点[34]，但它的分子结构仍未被确认[35,36]。一个可能的假设是，XIC中的拓扑结构域的结构振动可能影响每个细胞的XCI的选择[37]。同样，也有假设认为XCI的启动也是随机的，随后选择出具有正确表达数量，即二倍体细胞中仅一条X染色体表达的细胞[38]。

3 XCI 的传播

“X染色体中尤其富含LINE类型的分散重复元件，它们可能是促进和推动XISTmRNA传播的要素。”[39]

Gartler和Riggs[40]最先提出可能存在一些站点式的位点可以帮助失活X染色体上沉默的传播。然而XistRNA究竟是如何在X染色体上传播的目前仍存在争议[41,42]。一个可能的模式是XistRNA会跳跃式地与特定的位点结合，并从有限数量的募集位点上向外传播[43]。高分辨率显微镜下进行单细胞观察时可以看到在失活X染色体上存在的XistRNA量比通过先前公牛细胞研究结果推测的量要少，提示XistRNA的传播可能存在着“击-跑模式”(hit and run model)[44]。另外，很重要的是，新的研究确定了一些被XistRNA所募集的蛋白，而这些蛋白会直接或间接地促进基因沉默的发生[45-47]。例如，SHARP(也称作SPEN)会与Xist相互作用，并募集可以活化组蛋白脱乙酰酶HDAC3的SMRT，从而促进沉默发生[46]。在XistRNA募集的成分中，数量最多的蛋白质是核基质蛋白HndrnpK，它参与到RRC1和PRC2复合物的募集中，从而导致抑制标记物H2AK119ub和H3K27me3的沉积[45-48]。在沉默建立的早期会发生一系列的组蛋白修饰，包括：组蛋白的去乙酰化，H3K27的甲基化，H3K119的泛素化[49-53]。在Xist基因中的A-重复序列是基因沉默的基本要素[54]，并且是结合相互作用因子的关键要素[45]。一些要素可以将XistRNA连接至经特殊表观遗传修饰可以维持基因沉默稳定并可遗传的复合物中，而这些重要要素也被陆续的发现(详见“维持”)[23]。

“……这种情况同样会出现在易位至X染色体的常染色体上。”[1]

XIST/XistRNA介导的顺式传播的沉默同样可以通过募集沉默因子扩散至因易位或插入而连接至失活X染色体上的常染色体片段中。但是发生在这些常染色体片段上的沉默并不像X染色体上的彻底[55]，这提示X染色体上富含的一些特殊元素可协助XCI的传播和维持。Mary Lyon[10]提出这一关键元素可能是X染色体上富含的LINE1重复片段。事实上，失活X染色体的固缩核心中特别富含L1元件的[56,57]。因此，在基本不含有L1元件的常染色体片段中观察到是效率低下且不连续的失活传播[58]。然而，由于细胞的选择机制在X：常染色体相互易位的病例中起到重要的作用，因此对于这种情况的解读需要谨慎[59]。关于XIST可以顺式作用至常染色体并导致其沉默的作用有一个有趣的应用，即将一个高表达的XIST转基因插入至人类21-三体细胞中的其中一个21号染色体上，从而对21-三体实现纠正[60]。通过这种方法恢复正常基因表达及细胞表型，这一手段同时也为唐氏综合征及其他常染色体三体疾病患者，或至少是对于一些可接受治疗的细胞如骨髓细胞，提供了一个治疗的希望。

4 XCI的维持

“因此，目前认为甲基化是传播发生后，维持失活的机制的一部分。”[61]

在早期的研究当中，确认了沉默维持的一个重要的分子特点，即X-连锁基因CpG岛上发生了DNA甲基化[40,62]。通过实验科学家得到了一个特殊的发现，一个含有X-连锁基因HPRT的甲基化DNA质粒，经转染至HRPT缺陷的细胞中时会保持沉默，但当将DNA上的5-氮胞苷甲基化去除后，它将重新恢复活性[63-65]。XCI的维持也有赖于早期发育中逐步加入的组蛋白修饰(详见“传播”)。随后发生的事件包括将组蛋白H2A取代为巨组蛋白H2A[66]，以及被甲基化酶Dnmt3a/b介导的DNA CpG岛甲基化及Dnmt1酶所介导的甲基化维持[67]。不同的基因由于表观遗传的变化而在不同时期出现沉默[68]。XCI的维持需要XistRNA、组蛋白修饰和DNA甲基化的相互协同作用[69]。但是这三要素中任意丢失其中一个要素不一定会影响到沉默。例如EED，作为调节H3K27me2的PRC2复合物的一个组成部分，对于胚胎XCI的启动及维持是可有可无的[70]。

5 X染色体的3D结构

“Ohno和Hauschka[4]提供的细胞学证据表明，在雌性小鼠的多种组织细胞中都存在1条异固缩的染色体。”[2]

失活的X染色体会形成Barr小体[71]，并呈现为雌性细胞细胞间期细胞核内的异固缩结构[4]。最初揭秘失活X染色体固缩形态是通过包括Hi-C的染色质构象研究进行全基因组染色质结构分析实现的。在人类和老鼠中，失活的X染色体都形成了一个被一个界限结构分隔，具有两个超级结构域的双极结构[47,57,72]。在人和老鼠之间，这两个超级结构域是有区别的，但是分隔这两个结构域的界限结构则是特别保守并包含着大随体位点Dxz4的[57]，Dxz4会特异性将CTCF连接至失活的X染色体上[73-75]，而CTCF则是一个广为人知的锌指蛋白，它可以在拓扑相关结构域(TADs)里协助组织染色质[76]。在老鼠中，失活X染色体上超级结构域间的界限区域似乎是一个核仁相关结构域[57]。

“X染色体贴附于某一位点是否是其中可能的机制，通过对胚胎这一时期精细结构的研究可能能为我们提供其中的一些线索。”[77]

Mary Lyon[77]推测，失活的X染色体通常会占据细胞核的一个固定的区域。这些区域可以位于靠近核膜[71]或靠近核仁处[78]。后来，在其他系统中通过观察也得到相同的发现，这提示在核纤层和/或核仁处，存在某些成分对异染色质起到了“魔术贴”式的作用[79]。有趣的是，XIST的相互作用因子中包含有可以帮助将染色体锚定至核膜上的蛋白质，例如核纤层B受体(lamin B receptor，LBR)[45-47]。我们自己的数据显示，一些特异性元件如lncRNA基因、Firre及Dxz4，可促进失活的X染色体向核仁靠拢。而Firre及Dxz4还可以特异性地将CTCF连接至失活的X染色体上。敲除Firre可引起X染色体上抑制标记H3K27me3的缺失，这提示着异染色质的维持可能与位置效应有关[80]。

6 X染色体的复活

“通过对Oct这一真正的X-连锁基因的观察发现，我们得到了年龄相关的X染色体失活稳定性下降机制的首个证据。”[81]

X染色体在雌性生物中的变化表现为失活和复活的循环演变过程[40,82]。在雌性的原始生殖细胞中，两条X染色体通过一系列的变化过程重新复活，而在这个复活过程当中，靠近Xist的基因复活得最晚[83]。这个复活的过程确保了每个单倍体的雌性生殖细胞都包含着一条活化的X染色体。有趣的是，从雌性生殖细胞分裂而成的单倍体细胞中由于活化X的表达上调，会产生X：常染色体高表达比率现象[84]。精子中大部分X染色体本处于失活状态，但紧随着受精的发生，这些父源性X染色体会重新复活[85]。而第二波X染色体复活则发生在再次出现随机XCI启动前的囊胚期，此时，X染色体复活出现在内细胞团当中[27]。在出现复活现象的细胞内，XIST会发生沉默，同时组蛋白抑制标记也会消失[86]。

Mary Lyon在1987年首次描述了体细胞中可以出现年龄相关的X染色体复活现象[81]。异常的复活也可以出现在先天性或获得性疾病当中(详见下文)。例如：在ICF综合征中可以出现异常的X-连锁基因表达，而这个现象是由于甲基化酶Dnmt3b的突变引起的[87]。虽然体细胞内并不需要XIST/Xist的持续存在来维持沉默[88]，但是实验表明诱导小鼠Xist缺失可以导致X染色体的复活并在一段较长时间后导致小鼠癌症发生[89]。复活也可以在由体细胞去分化所产生的诱导干细胞(iPS cells)中被诱导出现[90]。这种现象在小鼠中通过加入全能因子就可以轻易地诱导产生，但是在人类中则不然，因为人类细胞存在着更为复杂多样的调控机制[90]。在未分化人类干细胞系中观察到两条活化的X染色体是非常罕见的，除非它们仍然处于一个“幼稚”阶段[91]。有趣的是，早于丢失XIST RNA前，人类的多功能干细胞上会先伴随覆盖着lncRNA XACT[92]。

7 XCI逃逸

“人类中可能并不会出现一条X染色体的完全失活，或人类X染色体失活的机制在某些地方与老鼠不尽相同……”

“另外一个可能的解释就是，人类的X染色体上存在一些短的成对片段，正常情况下并不发生失活，而这些片段若出现缺失或者重复可以导致异常表型的发生。”[2]

Mary Lyon[2]推测，一些位于X和Y染色体拟常染色质区域(pseudoautosomal region,PAR)的成对基因可能会存在XCI逃逸。当时她对于X0小鼠和45,X女性的表型差异感到非常困惑，因为X0小鼠是可以正常生育的，但是45,X女性则会出现异常表型和不孕。随后的研究表明，老鼠和人类的PAR中所包含的基因差异非常大[93]。此外，两者在PAR区域以外的逃逸基因也存在着巨大的差异[94]。在人类中，有15%的X-连锁基因会出现XCI逃逸，但在老鼠中这个比例仅为3%-7%[95,96]。部分位于RAR区域外的逃逸基因存在有Y-连锁的同源区域[97]。事实上，在许多哺乳类动物的性染色体上中都存在这样的一系列类似的X/Y基因，可能是因为它们编码的是一些高度剂量敏感的关键蛋白[98,99]。

不同组织和不同个体间的XCI逃逸是不一样的。我们利用最近完成的一个关于X染色体失活和逃逸的研究，研究中我们利用RNA测序的方法检测基于常见SNPs位点出现XCI偏倚的F1代小鼠的多种组织进行等位基因-特异表达检测[100]。发现有一部分逃逸基因在组织间是相同的，但剩余的一部分则具有组织特异性。有趣的是有许多在成年老鼠组织中发现的XCI逃逸基因与先前胎盘滋养细胞中检测出的逃逸基因是不一样的。在胎盘滋养细胞中XCI为父源性印迹，由此提示印迹和随机XCI间存在非常重大的差异[101-103]。此外，在失活的X染色体上的某些特定基因的表达水平在组织间也可以有很大的差异，这就意味着逃逸现象具有组织特异的剂量效应。因此，XCI逃逸可能是一种具有组织特异性的性别差异现象。在人类的SNP研究中，同样也显示出这种组织和个体差异性[104]。通过对X-连锁CpG岛及基因上差异性甲基化程度的检测可以帮助鉴定人类组织中的逃逸基因[105-107]。事实上，在XCI相关抑制标志区域的逃逸基因比较稀少，但在活性基因转录区域则比较丰富[108]。此外，逃逸基因都位于失活X染色体沉默结构域的外围区域，并且显然它们之间存在着相互作用[57,109]。

逃逸基因中还存在着这样一种类型，它们在Y染色体上缺乏相对应的同源区域，被认为可能是基因表达性别特异性差异的来源，因此成为了性别特异性表型的研究对象[108]。其中一个例子就是组蛋白去甲基化酶KDM6A，它的编码基因在许多物种中都出现了XCI逃逸。Kdm6a在雌性细胞中具有更高的表达，并可以调节一系列生殖相关的同源框基因(Rhox6 andRhox9)，使其以雌性生物特性方式表达[110]。但至于其他逃逸基因是否参与影响性别特异性差异，目前仍需要进一步研究。

8 XCI、X非整倍体及疾病

“X0的女性和XXY男性会出现多种异常，以及X0的女性和X0的老鼠在表型上是具有差异的，这些问题仍然是个迷。”[2]

逃逸基因的剂量取决于X染色体的数量，因此逃逸基因是X染色体非整倍体相关异常表型的研究对象。事实上，逃逸基因(PAR或非PAR区域)的拷贝数异常，目前被认为与Turner和Klinefelter综合征的异常表型有关[111-113]。例如，失去了位于PAR区域的SHOX基因一个的拷贝导致了Turner综合征患者身材矮小的表型，而存在3个拷贝SHOX基因的XXY个体则具有高大的身材[114]。一些特殊的逃逸基因与精神缺陷有关，例如：KDM5C和IQSEC2的缺失或突变无论男性或女性均可以导致X-连锁的智力缺陷，符合剂量敏感性[115-117]。此外，认知缺陷也曾被报道出现在携带KDM5C和IQSEC2基因微重复的患者当中，这与其异常的高表达有关[118]。同样，在Kabuki综合征的患者身上也发现了KDM6A的突变和缺失，而这个综合征的主要表现为，智力缺陷、生长发育迟缓、骨骼发育异常以及内脏畸形[119,120]。该基因突变的女性携带者也会出现异常表型，与剂量异常相符[121]。在这些病人当中，某些患者的表型与部分Turner综合征的症状重叠，被命名为Tuener-Kabuki综合征，提示可能还潜在某些相关的基因发生了XCI逃逸。

X-连锁突变所导致的疾病在男性和女性间具有很大的表型差异。男性携带者通常会发病。由于男性仅有一条X染色体，因此隐性突变即可导致异常表型。而女性携带者则可以通过表达正常等位基因的细胞补偿，或通过出现强烈的失活偏倚来保证正常等位基因的表达[6]。X染色体失活偏倚可以广泛存在于体内，或者仅存在于极需基因正确表达的组织当中[122]。随机分布的具有一条活性X染色体的补偿细胞可以广泛存在，这一现象在最近的一个雌性小鼠实验中被证实。试验中，雌性小鼠的每个等位基因上都连接上了一个X-连锁荧光信号，通过这些荧光信号可以在原位上看到XCI的分布情况，并意外地发现XCI偏倚广泛存在[123]。例如，一只老鼠一半的大脑组织存在母源性X沉默，而另外一半大脑组织出现父源性X沉默。

逃逸基因在正常剂量下发生突变也与非先天性疾病相关。例如KDM6A突变在肾癌和其他癌症中都有被发现[124,125]。有趣的是，KDM6A在急性T淋巴母细胞性白血病当中看似表现为一个性别特异性的肿瘤抑制因子，而这种疾病仅在男性患者中存在去甲基化酶的失活突变[126]。此外，异常的X染色体低甲基化伴随失去部分或1整条X染色体可以出现在乳腺癌细胞当中[127]。广泛的X染色体复活也在乳腺癌当中被发现[128]。

9 总结

总而言之，Mary Lyon 提出的X染色体失活定律不仅帮助我们理解了基因沉默的基本原则、异染色质结构和细胞核构成，还引导我们进一步发现了一些如lncRNAXist那样的新的关键因素，帮助我们对X-连锁疾病和性别特异性差异产生更深入的认识。

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10.13470/j.cnki.cjpd.2017.02.012