嵌合抗原受体修饰T细胞在血液肿瘤中的研究进展

姜华 吴国清⋆

嵌合抗原受体修饰T细胞在血液肿瘤中的研究进展

姜华 吴国清⋆

嵌合抗原受体修饰T细胞（CAR-T）技术近年来在血液肿瘤的临床研究中取得良好的疗效。在美国基于CD19的CAR-T疗法已经进入Ⅱ期临床试验阶段，前景可观。CAR-T靶向恶性肿瘤细胞抗原，将能够识别该抗原的结构通过基因工程技术的手段使其在患者T细胞的表面，进而特异性的识别恶性肿瘤细胞，最终将其杀灭。

1 CAR的结构

CAR是人为设计的结构，主要包括胞外抗原结合区，跨膜区，胞内信号区。胞外抗原结合区主要是来源于与肿瘤特异性抗原相对应的单克隆抗体的单链可变区（single-chain variable fragment，scFv），通过跨膜区与胞内的信号区相连。胞内信号区最初包括TCR复合体的CD3ζ链，具有免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs）负责T细胞信号的转导［1］。CAR-T的优势是通过MHC非限制性的方式识别肿瘤抗原，有效避免有些肿瘤细胞因MHC表达降低而造成的免疫逃逸［2］。1987年Kuwana课题组首次将免疫球蛋白的V区与T细胞受体（T cell receptor，TCR）的α链和β链的恒定区融合构建可特异识别肿瘤细胞的CAR 原型［3］。随后CAR 经历多种修饰（见图1）。从最初的单一信号分子发展到加入共刺激分子［4-5］，再到将细胞因子的基因也一同导入，逐渐增强CAR-T的识别能力，使这项技术更为精准、安全。加入细胞因子基因可以在T细胞杀伤肿瘤细胞的同时可以释放大量的穿孔素、颗粒酶或表达FasL配体、肿瘤坏死因子（TNF）等［6］，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。

CAR-T细胞制备的基本过程：通过淋巴细胞单采技术从患者体内采集外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），并在体外用载体将CAR的基因导入T细胞，并进行大量扩增，再回输入患者的体内。通过基因工程技术改造的T细胞可特异性识别肿瘤细胞并通过释放细胞因子诱导肿瘤细胞的凋亡。目前应用于临床试验的导入外源基因的载体有病毒载体（逆转录病毒、慢病毒等）和非病毒载体（点穿孔技术、脂质体转染等）。最早的CAR-T构建时使用的是逆转录病毒，其安全性及稳定性均可圈可点［7］。逆转录病毒感染主要是分裂期细胞，对于非分裂细胞感染能力较差，而慢病毒则对分裂和非分裂期细胞均具有较好的感染能力。因此绝大多数CAR-T细胞制备时使用的是慢病毒系统。除此之外，转座子转染以其低毒、不易引起插入突变和机体的免疫反应等优点，越来越多的被应用在外源基因转导中。被誉为“睡美人”（sleeping beauty，SB）的DNA转座子是一种天然的、非病毒载体，可以携带特定的DNA片段进行基因转移。应用SB转座子能将目的基因转移至体细胞、胚胎干细胞及分裂期细胞和非分裂期细胞，研究表明目的基因在整合到基因组后均能长期稳定表达［8］。但其不足之处是SB的转染效率不够高。

2 CAR-T在血液肿瘤中的研究进展

2.1 B系血液肿瘤 B细胞是来源于骨髓的多能造血干细胞。CD19表面抗原表达于除浆细胞外的几乎所有的B细胞表面，成为B系血液肿瘤良好的表面标志，基于CD19的CAR-T应运而生。2011年，美国宾夕法尼亚州大学Carl H.June领导的团队在新英格兰医学杂志报道采用针对CD19的CAR-T细胞治疗1例难治性慢性B淋巴细胞白血病，获得完全缓解，并持续6个月［9］，这是首次单独用免疫治疗对晚期白血病治疗获得成功，此后CAR-T迅速成为热点的研究方向。Jena小组用逆转录病毒转染CAR结构序列应用于急性和慢性B系淋巴细胞白血病患者，后期结果显示，临床应用安全有效［10］。CD20这个靶点主要用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL），而CD22在急性淋巴细胞白血病（B-ALL）和成熟淋巴细胞恶性肿瘤上高表达，对于CD19低表达或CD19分子丢失的B-ALL细胞而言，CD22有希望成为CD19在B-ALL上的替代靶点。此外，将抗体药物与CAR-T疗法联合应用有可能增强T细胞的增殖能力，同时减轻移植物排斥反应［11-12］。

2.2 急性髓细胞白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）对于AML，有研究应用Lewis Y（LeY）抗原和NKG2D这两种抗原作为治疗的靶点进行了探索。LeY寡糖抗原是肿瘤相关糖抗原，存在于erbB癌基因编码的产物中。其被证实不表达于红细胞表面，极少表达于正常组织的细胞表面，但表达于多数的血液肿瘤细胞表面，其中包括AML［13］。2013年一项研究中，4例AML高危患者应用针对该抗原的二代CAR-T，其中3例患者有效。但CAR-T细胞持续存在的情况下，疾病依然缓慢进展［14］。NKG2D是由NK细胞和T细胞表达的一种活化的受体，而NKG2D配体在正常组织中呈现限制性的表达，但其在恶性肿瘤和被感染的细胞内通常是过表达。有研究尝试基于NKG2D配体构建CAR［15］，但依然受制于严重的细胞毒性［16］。在CD33和CD123的研究中，似乎靶向CD123的CAR-T对于正常细胞的杀伤更小［17-19］。但两者造成的细胞毒性同样不可忽视。从抗原抗体亲和力考虑，将特异性受体如叶酸等嵌入CAR-T结构中，有望提高T细胞的抗肿瘤活性，降低毒副反应。

2.3 多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM） MM是浆细胞异常增生的恶性肿瘤。由于最佳靶点CD19在浆细胞的缺失，研究人员致力于寻找浆细胞特异性的靶点，而骨髓瘤细胞表面糖蛋白CS1是其中之一。CS1表达于多数的恶性浆细胞和部分正常浆细胞，淋巴细胞、活化的单核细胞和树突状细胞也有较低水平的表达，但并未见于其他的正常组织［20］。目前应用于MM晚期的一种可溶性抗体伊洛珠单抗elotuzumab，即是靶向CS1［21］。2014年 Chu J小组设计针对该抗原的CAR，其同时转染T细胞和NK细胞，结果发现在小鼠模型中能够有效抑制MM疾病进程，显著延长小鼠的生存期。因此CS1可能成为治疗MM的有效靶点［22-23］。尽管如此，这种方法仍存在担忧，因这种CAR可能会通过CS1攻击活化的T细胞，从而损伤正常T细胞。此外，CS1是可溶性抗原，这对CAR-T在体内发挥抗肿瘤作用也是一个挑战。此外潜在的靶点还包括κ轻链、CD138、B细胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）、细胞表面糖蛋白CD38、NKG2D 、CD44v6等［24-25］。目前，MM的治疗受制于MM复杂性、表型和功能的异质性及微环境，故疗效并不理想［26-27］。

3 CAR-T细胞面临的难题与未来的设想

CAR-T目前面临的主要难题是“脱靶”效应，即CAR-T对于正常细胞和组织的杀伤［28］。基于CD19的CAR-T对于正常B细胞的杀伤尤其严重。Rosenberg小组在2011年进行临床实验来评估抗CD19-CAR-T造成的B系细胞的毒性，结果发现，8例患者中有4例表现为长期的B系细胞发育不良，而此类的副作用屡见不鲜。另一个严重的毒副作用即细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS），造成部分患者死亡，死亡患者中血清炎性介质IFNγ和TNF的显著升高［29］。引起CRS较常见的炎性细胞因子是白细胞介素6（Interleukin 6，IL-6），应用抗IL-6的抗体可以缓解由于CRS引起的机体损伤，损伤严重时可以应用甾体或激素类药物，但需要明确的是这些药物会显著降低CAR-T的疗效［30］。CRS引起的器官损伤，几乎包括所有系统，比如神经系统出现头痛，高热，谵妄，失语，甚至脑水肿，这可能与炎症介质IFNγ、IL-6有关；心血管毒性，可能由发热引起的心动过速，低血压，射血分数下降，原因未知的心肌负荷加重，心脏停博；呼吸系统出现肺水肿，呼吸困难，窒息，肺炎；急性肾脏损伤，胆红素的上升，三系细胞减少，乏力，肌痛，关节痛，食欲下降等。除此以外，变态反应和移植物抗宿主病也危害机体甚至造成死亡［31］。

CAR-T发展至今已经走过20+年，纵观CAR-T的发展历程，有几点展望：首先，寻找最佳的肿瘤特异性抗原是解决目前较为严重的“脱靶” 效应的关键；其次，探索最佳的CAR结构，包括合理的CM，细胞因子，载体等；再次，如何克服T细胞回输后在体内持续增殖的问题，最后，寻找有效预防和治疗CRS及其他副作用的方法。目前一些新尝试包括：在CAR的基础上引入自杀基因、分子开关或开发多靶点CAR-T技术；应用非整合性的慢病毒载体、电穿孔、睡美人转座子等技术解决潜在的插入突变问题，改善长期安全性；应用CRISPR/cas9技术改造CAR-T细胞，即对回输的CAR-T细胞敲除内源性的TCR和MHC分子，避免引起宿主的免疫排斥反应，提高CAR-T细胞识别的效率；CAR-T中加入趋向因子受体，增强其靶向性。综上所述，目前的临床研究发现CAR-T细胞治疗血液肿瘤疗效显著，未来CAR-T细胞必将成为治疗血液肿瘤的重要手段之一，但其安全性及特异性还有待进一步提高。

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310053 浙江中医药大学（姜华）310000 浙江省人民医院（吴国清）

*通信作者