17β-雌二醇对岩溶稻田土壤微生物群落的影响

黄雅丹，靳振江，李强，刘畅

1.桂林医学院研究生学院，广西 桂林 541004；2.中国地质科学院岩溶地质研究所，广西 桂林 541004；

3.联合国教科文组织国际岩溶研究中心，广西 桂林 541004；4.桂林理工大学环境科学与工程学院，广西 桂林 541004

17β-雌二醇对岩溶稻田土壤微生物群落的影响

黄雅丹1，靳振江2,4，李强2,3*，刘畅2

1.桂林医学院研究生学院，广西 桂林 541004；2.中国地质科学院岩溶地质研究所，广西 桂林 541004；

3.联合国教科文组织国际岩溶研究中心，广西 桂林 541004；4.桂林理工大学环境科学与工程学院，广西 桂林 541004

为明确17β-雌二醇对岩溶区稻田土壤生态系统微生物多样性-稳定性关系的影响，通过17β-雌二醇室内添加模拟实验，采用荧光定量聚合酶链反应和聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳法研究有氧和厌氧条件下细菌和真菌丰度及多样性变化。结果表明，（1）0.05 mg∙kg-1和0.20 mg∙kg-117β-雌二醇对岩溶稻田土壤微生物丰度具有一定的表观刺激效应，这种表观刺激效应在厌氧条件下尤为显著。岩溶稻田土壤细菌和真菌总拷贝数及归一化结果进一步显示，17β-雌二醇的添加量为0.05 mg∙kg-1时，岩溶稻田土壤微生物丰度最高，这可能是岩溶稻田土壤微生物对17β-雌二醇产生应急反应的一个重要应答点。（2）在厌氧培养条件下，岩溶稻田土壤细菌和真菌均匀度指数与其丰度呈现相反的变化趋势。尽管17β-雌二醇能够促进少数厌氧微生物种属及其数量的增加，但整体上降低了岩溶稻田土壤微生物系统的多样性和稳定性。（3）培养条件与微生物群落的双因素方差分析结果进一步证实，土壤通气状况（有氧和厌氧）是影响岩溶稻田土壤微生物群落稳定性的极显著因素。这说明，定期对岩溶稻田进行翻耕、晒田或水-旱交替耕作能够促进岩溶稻田土壤中17β-雌二醇的降解，降低厌氧微生物活性，缓解17β-雌二醇对岩溶稻田土壤微生物带来的生态风险，从而为岩溶区稻作农业生产管理提供技术支持。

17β-雌二醇；土壤通气状况；微生物丰度；微生物多样性

具有雌激素效应的17β-雌二醇能够干扰生物体内分泌物质的合成、释放、运输、结合、代谢等过程，以此激活或抑制生物体的内分泌系统（Bechi et al.，2013）。加之17β-雌二醇在水中的溶解度很低，极性相对较低，极易被水体底泥和土壤吸附，且很难再移动，因此，即使17β-雌二醇质量浓度低至ng∙L-1级时仍对生态环境具有极大的风险，为此《斯德哥尔摩公约》将其列为禁止使用和限制使用的持久性有机污染物（联合国环境规划署，2001）。

17β-雌二醇广泛存在于市政污水及家畜粪便中，直接或间接排入河流的17β-雌二醇将会对环境造成不同程度的污染。譬如，在湖北、黑龙江等畜禽养殖大省，部分河流中的17β-雌二醇质量浓度高达29 ng∙L-1（邵晓玲等，2008），相对而言，珠江水域沉积物中的17β-雌二醇质量分数变化范围则在0.9～2.6 ng∙g-1之间（Gong et al.，2011；龚剑等，2011）。在国外，17β-雌二醇对水环境造成的污染形势也不可小觑，Kolpin et al.（2002）通过调查美国30个州139个地表水样，发现将近40%的地表水受到17β-雌二醇不同程度的污染，而Kuch et al.（2001）在德国南部的一些饮用水中检测到的17β-雌二醇质量浓度为0.2～2.1 ng∙L-1。大量毒理实验表明，环境中的17β-雌二醇能够影响某些鱼类的内分泌系统及其生殖能力，甚至引起雄鱼雌性化（陈家长等，2012），并且也能显著抑制水体微生物的反硝化作用（吴伟恒等，2014）。此外，赵颖等（2014）12-14通过模拟实验证明当17β-雌二醇在环境中的质量浓度不超过0.5 ng∙L-1时，能提高水体产甲烷微生物的活性，导致水体甲烷释放强度增加；而当17β-雌二醇质量浓度为1.0～10.0 ng∙L-1时则对水体产甲烷微生物活性产生抑制效应。

稻作农业是保证我国粮食安全的主要支撑，由于水稻整个生育期都需要维持一定的水位，因此在水资源分配不均匀的岩溶区不得不对稻田进行污水灌溉（陈晓锋等，2009），然而含17β-雌二醇污水对稻田土壤微生物生态系统的影响研究目前尚未涉及。为此，本实验在有氧及厌氧培养条件下，采用荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qPCR）和聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，PCR-DGGE）法研究不同添加量的17β-雌二醇对岩溶稻田土壤微生物群落的影响，以期为评价环境残留的17β-雌二醇对岩溶稻田土壤微生物造成的生态风险提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验土壤

培养实验所需稻田土壤采自桂林会仙岩溶湿地0～20 cm土层，利用总有机碳分析仪TOC-V（日本岛津）测得土壤有机碳质量分数为22.33 mg∙kg-1，利用inoLab® pH 7110实验室台式pH测试仪（德国WTW）测得土壤pH为7.91。土样采集期，该区昼夜气温21～30 ℃。采集的新鲜土样过10 mm筛，用湿纱布盖在土表于室温下放置3 d，待微生物活化后，加入配好的17β-雌二醇溶液，添加到土壤中的17β-雌二醇分别为0（CK）、0.05、0.10、0.20、0.40 mg∙kg-1，并用去离子水调节土壤湿度至40%，分别模拟稻田水、旱条件进行有氧和厌氧（厌氧培养箱）处理，在25 ℃下恒温培养30 d后进行后续分析。同一处理条件设有3个平行样。

1.2 测定方法

1.2.1 土壤微生物DNA的提取

称取0.25 g土壤样品，采用美国MOBIO土壤强力DNA提取试剂盒提取土壤微生物总DNA，利用Quawell 5000微量紫外分光光度计测定其浓度和纯度，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 荧光定量聚合酶链反应

为获取16S rRNA基因拷贝数，将提取的土壤微生物DNA作为qPCR模板，采用对大多数细菌具有特异性的引物对338F/518R（5′-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′，5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′）进行扩增（Muyzer et al.，1993）696-699。25 μL反应体系为：5 ng∙μL-1土壤微生物DNA模板1 μL，Green-2-Go qPCR Mastermix（上海生工）12.5 μL，去离子无菌水9.5 μL，10 μmol∙μL-1的338F/518R引物各1 μL。qPCR反应程序设定如下：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，39个循环，最后72 ℃延伸5 min，扩增效率90%～105%，R2＞0.99。

为获取18S rRNA基因拷贝数，将提取的土壤微生物DNA作为qPCR模板，采用对真菌具有特异性的引物对Fungi/NSI（5′-ATT CCC CGT TAC CCG TTG-3′，5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′）进行扩增（May et al.，2003）。25 μL反应体系为：5 ng∙μL-1土壤微生物DNA模板1 μL，Green-2-Go qPCR Mastermix（上海生工）12.5 μL，去离子无菌水9.5 μL，10 μmol∙μL-1的Fungi/NSI引物各1 μL。qPCR反应程序设定如下：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，39个循环，最后72 ℃延伸5 min，扩增效率90%～105%，R2＞0.99。

每克干土中的16S rRNA和18S rRNA基因拷贝数即为细菌和真菌丰度。

1.2.3 土壤微生物群落分析

利用细菌F968/R1401引物对（5′-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3′，5′-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3′）对土壤微生物DNA进行PCR扩增（靳振江等，2014b）4286。25 μL反应体系为：5 ng∙μL-1土壤微生物DNA模板1 μL，Taq PCR Master Mix（上海生工）12.5 μL，去离子无菌水9.5 μL，10 μmol∙μL-1的F968/R1401引物各1 μL；扩增条件为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

在真菌正向引物Fungi 5′端添加GC夹子（5′-CCG CCG CGC GGC GGG CGG GGC GGG GGC ACG GGG-3′）后，将NSI作为反向引物对土壤DNA进行PCR扩增（靳振江等，2014b）4286。25 μL反应体系为：5 ng∙μL-1土壤微生物DNA模板1 μL，Taq PCR Master Mix（上海生工）12.5 μL，去离子无菌水9.5 μL，10 μmol∙μL-1的正向引物和反向引物各1 μL；扩增条件为：95 ℃预变性15 min，91 ℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35个循环，然后在68 ℃完全延伸10 min。

以上PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测条带清晰无拖尾表示扩增结果良好，将PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳分析。细菌和真菌PCR扩增产物均采用8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度自下至上分别为55%～70%和15%～35%，并分别在60 ℃、100 V和60 ℃、90 V恒定电压下电泳9 h，经银染后利用Gel-Doc-2000凝胶影像分析系统（美国Bio-Rad）拍照。

1.3 数据处理与统计

细菌和真菌丰度归一化参照文献中的方法（李强等，2014），将不同培养条件下的16S rRNA和18S rRNA基因拷贝数加和后分别进行归一化处理，计算公式为：

式中，xi为细菌和真菌在17β-雌二醇不同添加量下的基因拷贝数。

16S rRNA、18S rRNA的变性梯度凝胶拍照后，采用美国Bio-Rad公司的Imange lab分析软件捕获图像进行多样性分析。多样性指数的计算方法如下（靳振江等，2014b）4286：

香农-维纳多样性指数：

Margalef丰富度指数：

均匀度指数：

式中，S为OTUs总数，即条带数；N为泳道中OTU的总亮度峰值；ni为第i个OTU在所有克隆中的比值。

图1 不同培养条件下16S rRNA、18S rRNA基因丰度Fig.1 Abundances of paddy soil bacteria and fungus under different treatment

此外，利用SPSS软件对岩溶稻田土壤微生物数据进行双因素方差分析。

2 结果与讨论

2.1 不同培养条件对岩溶稻田土壤细菌和真菌丰度的影响

在有氧培养条件下，岩溶稻田土壤细菌丰度为每克土壤1.180～2.240×1011copies，真菌丰度为每克土壤2.672～6.313×107copies；而在厌氧培养条件下，岩溶稻田土壤细菌丰度为每克土壤4.092～10.396×1011copies，真菌丰度为每克土壤0.204～0.395×107copies（图1）。具有较高有机碳质量分数、pH值的岩溶水稻土对17β-雌二醇具有良好的吸附作用（Lai et al.，2000；靳振江等，2014a；李沛辰等，2015），为此吸附在土壤颗粒表面的17β-雌二醇在有氧条件下的降解速率高于厌氧条件（20 ℃时，有氧条件下为0.120 g∙h-1∙L-1，厌氧条件下为0.057 g∙h-1∙L-1）（何芳等，2012），降解速率亦与微生物数量密切相关。此外，鉴于一定量的17β-雌二醇对厌氧微生物的生长具有促进作用（赵颖等，2014）12-14，因此，受17β-雌二醇在不同供氧条件下降解速率的影响，在同一质量分数的17β-雌二醇暴露条件下，岩溶稻田土壤细菌丰度在有氧培养条件下普遍低于厌氧培养条件（图1a）。而岩溶稻田土壤真菌丰度在有氧培养条件下普遍高于厌氧培养条件（图1b），加之绝大多数真菌都是专性好氧菌，这一研究结果与熊鸿焰等（2009）认为稻田水作造成真菌质量分数显著降低的结果相一致。

此外，通过图1(a)还可看出，岩溶稻田土壤细菌丰度在17β-雌二醇的添加量为0.05 mg∙kg-1和0.10 mg∙kg-1时均高于对照组，并在厌氧培养条件下具有显著性差异；而当添加量为0.40（有氧）、0.20（厌氧）、0.40（厌氧）mg∙kg-1时其细菌丰度则低于对照组。这是因为，厌氧条件下，低量的17β-雌二醇能够提高厌氧微生物产甲烷活性，而高量的17β-雌二醇则对厌氧微生物产甲烷活性产生抑制效应（赵颖等，2014）12-14。加之17β-雌二醇作为雌激素对真菌菌丝体定向生长具有一定的促进作用（郭坚华等，1995），因此岩溶稻田土壤在面临不同质量分数的17β-雌二醇暴露风险时其真菌丰度均高于对照组（图1b）。由此说明，改善岩溶稻田土壤通气状况能够降低17β-雌二醇对厌氧微生物的影响，并能缓解甲烷释放速率。

通常土壤细菌占土壤微生物总数的70%～90%（陈文新，1996），并对土壤微生物数量具有绝对控制作用。有氧和厌氧培养条件下岩溶稻田土壤细菌和真菌总拷贝数及归一化结果显示：17β-雌二醇的添加量为0.05 mg∙kg-1时，岩溶稻田土壤微生物丰度最高（表1），这可能是岩溶稻田土壤微生物对17β-雌二醇产生应急反应的一个重要应答点。

2.2 不同培养条件下岩溶稻田土壤细菌和真菌群落多样性特征

DGGE技术能够直观反映自然界微生物群落遗传多样性，对评价土壤环境变化具有重要的指导作用（Muyzer et al.，1993）696-699。根据电泳图谱中每条条带的信息，通过综合分析各实验组中细菌和真菌的香农-维纳指数、丰富度指数和均匀度指数，得知：厌氧培养条件下，细菌的香农-维纳指数和丰富度指数均高于对照组，均匀度指数则低于对照组，而真菌的香农-维纳指数、丰富度指数和均匀度指数均低于对照组；有氧培养条件下，细菌和真菌的香农-维纳指数除在17β-雌二醇的添加量为0.40 mg∙kg-1时高于对照组外，其它条件下均低于对照组，并且其丰富度指数和均匀度指数均没有明显的变化规律（表2）。由此说明通气状况（有氧或厌氧）以及17β-雌二醇的添加量能影响岩溶稻田土壤生态系统的微生物多样性。

在厌氧培养条件下，针对不同量的17β-雌二醇添加实验，岩溶稻田土壤细菌丰度与其香农-维纳指数和丰富度指数总体上呈现一致的变化趋势，但与其均匀度指数呈现相反的变化趋势；岩溶稻田土壤真菌丰度与其3种多样性指数总体上呈现相反的变化趋势（图1，表3）。由于均匀度与物种数目无关，只与个体数目在各个物种中分布的均匀程度有关，故群落中的常见种与稀少种的差距逐渐变小，整个群落向着物种均匀化方向发展（贺纪正等，2013）414-416。尽管17β-雌二醇能够促进少数微生物（细菌，特别是产甲烷菌）种属及其数量的增加，但厌氧培养条件下岩溶稻田土壤细菌和真菌均匀度的降低则表明17β-雌二醇对岩溶稻田土壤微生物产生了抑制作用，这种抑制作用不但降低了岩溶稻田土壤微生物生态系统的稳定性（贺纪正等，2013）415，而且将加剧岩溶稻田在淹水期间的甲烷排放量（秦晓波等，2012），进而影响全球变化。

表1 不同培养条件下岩溶稻田土壤微生物丰度Table 1 Abundances of karst paddy soil microbes under different treatment

表2 不同培养条件下基于岩溶稻田土壤16S rRNA、18S rRNA DGGE图谱的微生物多样性指数Table 2 The karst paddy soil microbial diversity based on the DGGE profile of 16S rRNA and 18S rRNA under different treatment

表3 土壤通气状况、17β-雌二醇添加量及其交互作用与16S rRNA、18S rRNA基因丰度双因素方差分析Table 3 Two-way analysis of variance relating to experimental condition and the abundances of kart paddy soil bacteria and fungus

在有氧条件下，17β-雌二醇通常被微生物脱氢氧化为雌激素酮（何芳等，2008）1962-1964，而雌激素酮具有较长的半衰期并更容易在微生物体内积累（何芳等，20081963-1965；王代懿等，2014）。因此，在有氧条件下，17β-雌二醇添加量为0.05、0.10、0.20 mg∙kg-1时的岩溶稻田土壤细菌和真菌具有较低的香农-维纳指数，而细菌和真菌丰度与其香农-维纳指数呈现相反的变化趋势。由于土壤中高添加量（0.40 mg∙kg-1）的17β-雌二醇在有氧条件下降解不完全，因此岩溶稻田土壤细菌和真菌在17β-雌二醇和雌激素酮的交互作用下具有较高的香农-维纳指数。

土壤中绝大多数真菌都是专性好氧菌（靳振江等，2014b）4289，受氧气体积分数的限制以及17β-雌二醇的抑制作用，岩溶稻田土壤真菌的3种多样性指标在有氧培养条件下均高于厌氧培养条件（表2）。此外，由于目前已知能够降解17β-雌二醇的微生物大部分为细菌（Li et al.，2012；方会等，2012），加之17β-雌二醇在厌氧条件下能够提高厌氧微生物的活性，因此，除香农-维纳指数外，岩溶稻田土壤细菌的其它两种多样性指标总体上表现出有氧条件＞厌氧条件（表2）。

综上所述，岩溶稻田土壤微生物的均匀度在维持岩溶稻田土壤生态系统微生物多样性-稳定性关系上具有重要的指示作用。因此，本研究结果表明，在17β-雌二醇暴露环境中，均匀度指数能够作为水、旱交替条件下岩溶稻田土壤微生物群落特性变化的评价指标。

2.3 不同培养条件与岩溶稻田土壤微生物群落的双因素方差分析

采用F检验对本实验所涉及的土壤通气状况（有氧、厌氧）、17β-雌二醇添加量、细菌和真菌丰度进行双因素方差分析，结果如表3所示。岩溶稻田土壤通气状况（有氧/厌氧）和17β-雌二醇添加量对岩溶稻田土壤细菌丰度有极显著影响，而其交互作用对岩溶稻田土壤细菌丰度有显著影响；土壤通气状况（有氧/厌氧）对岩溶稻田土壤真菌丰度也产生极显著影响，但17β-雌二醇添加量及其与土壤通气状况的交互作用对岩溶稻田土壤真菌丰度影响不显著。

土壤通气状况（有氧、厌氧）能够对岩溶稻田土壤细菌和真菌丰度产生极显著影响，可能与17β-雌二醇的生物降解特性有关。在有氧条件下，17β-雌二醇的降解速率高于厌氧条件（何芳等，2008）1963-1965并符合一级反应动力学（反应速率常数0.23～4.79）（Li et al.，2005）。此外，17β-雌二醇在有氧条件下能够为土壤中的Mn（Ⅳ）或Fe（Ⅲ）提供电子，自身被氧化成雌激素酮（Oscarson et al.， 1981），最终被微生物降解。而Lee et al.（2002）在有氧和厌氧条件下利用活性污泥处理17β-雌二醇，发现水体中17β-雌二醇质量浓度为200 μg∙L-1时几乎能完全被降解掉。因此，本实验结果说明改善岩溶区稻田土壤通气状况，定期对稻田进行翻耕、晒田或水-旱轮作能够降低17β-雌二醇对土壤微生物及生态环境带来的危害。

3 结论

（1）17β-雌二醇对岩溶稻田土壤微生物的生长具有一定的表观刺激效应，这种表观刺激效应在厌氧条件下极显著。

（2）17β-雌二醇在促进岩溶稻田厌氧微生物活性的同时，降低了岩溶稻田土壤微生物系统的抵抗力和恢复力，进而降低了岩溶稻田土壤生态系统微生物的多样性及其稳定性。

（3）定期对岩溶区的稻田进行翻耕、晒田或水-旱轮作能够促进17β-雌二醇的降解性能，进而缓解17β-雌二醇对岩溶稻田土壤微生物造成的生态风险。

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Responses of Karst Paddy Soil Microbial Community Structure to 17β-estradiol in the Simulated Experiments

HUANG Yadan1, JIN Zhenjiang2,4, LI Qiang2,3, LIU Chang2
1.Graduate School of Guilin Medical University, Guilin 541004, China; 2.Institute of Karst Geology, Chinese Academy of Geological Sciences, Guilin 541004, China; 3.International Research Center on Karst under the Auspices of UNESCO, Guilin 541004, China; 4.Environmental Science and Engineering College, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China

To understand the risk of 17β-estradiol on the microbial diversity-stability relationship in the karst paddy soil, the exogenous 17β-estradiol with the content of 0, 0.05, 0.10, 0.20, 0.40 mg∙kg-1was added to the karst paddy soil.Moreover, the soil was cultured in the aerobic or anaerobic condition.At the end of the culture, Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction and Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis methods were applied to analyze the karst paddy soil microbial abundance and diversity.17β-estradiol (0.05 mg∙kg-1and 0.10 mg∙kg-1) has the apparent stimulatory effects on the abundances of karst paddy soil bacteria and fungus under different treatment, which is quite significant in the anaerobic condition.Moreover, according to the normalized karst paddy soil bacteria and fungus abundances, it was inferred that one of the critical and emergency response point from 17β-estradiol to karst paddy soil microbes is 0.05 mg∙kg-1.In the anaerobic condition, the species evenness of karst paddy soil bacteria and fungus is lower than the control group and also has the opposite change with their abundance.In the aerobic condition, 17β-estradiol can be degraded.The karst paddy soil microbial diversity has no clear variation in the aerobic condition.Though some anaerobic microorganisms were increased, the karst paddy soil microbial abundance and diversity were depressed.Moreover, the two-way analysis of variance relating to experimental condition and the abundances of karst paddy soil bacteria proved that the soil aeration condition is the controlling factor for karst paddy soil microbial community.From the results, it can be inferred that tillage, sunning the fields or waterlog-drought rotation can improve the degradation rate of 17 β-estradiol in the karst paddy soil, which decreased the anaerobic microbe activity and their methanogenic function.Therefore, the eco-environmental risk for karst paddy soil microbe from 17β-estradiol will be reduced.

17β-estradiol; soil aeration condition; microbial abundance; microbial diversity

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.10.018

X172; P593

A

1674-5906（2016）10-1721-06

黄雅丹, 靳振江, 李强, 刘畅.2016.17β-雌二醇对岩溶稻田土壤微生物群落的影响[J].生态环境学报, 25(10): 1721-1726.

HUANG Yadan, JIN Zhenjiang, LI Qiang, LIU Chang.2016.Responses of Karst paddy soil microbial community structure to 17β-estradiol in the simulated experiments [J].Ecology and Environmental Sciences, 25(10): 1721-1726.

国家重点研发计划课题（2016YFC0502501）；国家自然科学基金项目（41641026；41361054）；广西自然科学基金项目（2015GXNSFGA139010；2014GXNSFCA118012）；广西科学研究与技术开发计划项目（桂科合14123001-13）；中国地质科学院项目（YYWF201505）；桂林市科学研究与技术开发计划项目（20140122-1）

黄雅丹（1980年生），女，助理研究员，硕士，主要从事环境生物学研究。*通信作者。李强，E-mail: glqiangli@163.com

2016-08-12