组织工程皮肤血管化研究进展

王 川 综述 肖苒曹 谊林 审校

组织工程皮肤血管化研究进展

王 川 综述 肖苒曹 谊林 审校

血供对于皮肤的维持和移植至关重要，尽管组织工程皮肤已经商业化并应用于临床，但仍未能很好地实现其血管化。目前，促进组织工程皮肤血管化主要是依靠促血管形成的种子细胞，以及多种生长因子的作用。随着诱导多功能干细胞、静电纺丝，以及生物打印技术的发展，也可以通过设计新型支架，并结合相应的种子细胞和细胞因子，精确地模拟体内生长环境，以促进组织工程皮肤的血管化。本文主要对近年来组织工程皮肤血管化的研究进展进行综述。

皮肤组织工程血管形成干细胞细胞因子支架

组织工程皮肤的研究已取得了巨大的进展，目前已有多种商业化的组织工程皮肤应用于临床[1-2]。但是，这些产品大多是发挥及时覆盖和促进创面愈合的作用，并不能满足皮肤的全部功能[3]。完美的组织工程皮肤应没有毒性、不被人体排斥，具有正常的色泽、附属器、血管以及神经组织，并具有很好的柔韧性和一定的机械强度，能够进行物质和能量交换。组织工程血管化，特别是快速血管化问题，是制约皮肤组织工程发展的关键问题之一。目前，组织工程皮肤由于没有血管结构，其营养供应主要依赖渗透作用，厚度受到一定的限制，当移植皮肤厚度超过1.0 mm时，表皮层就不能够很快得到血液供应，进而发生部分表皮剥脱坏死[4]。促进血管形成和加快组织工程皮肤血管化的速度，一直都是皮肤组织工程研究的热点。本文重点围绕组织工程的三大要素：种子细胞、细胞因子、支架材料，阐述近几年来组织工程皮肤血管化的一些新的研究进展。

1 新血管形成的两种机制

一般认为，新血管形成（Neovascularization）的机制包括血管发生（Vasculogenesis）和血管新生（Angiogenesis）两个方面[5]。血管发生是指来源于骨髓的内皮祖细胞逐步迁移和分化，进而重新形成新的血管。该过程是胚胎期形成复杂血管网络的主要机制，但也可出现在成人组织中，特别是局部缺血的部位[6-7]。血管新生是指已存在的成熟血管，以生芽的方式逐步形成新的血管的过程，可以分为静止期、激活期和决定期3个阶段[5]。正常情况下，健康组织的血管处于静止期，血管内表面的内皮细胞以方阵细胞的形式，紧密排列并形成屏障，以保证血液的流动；Ⅳ型胶原和层黏连蛋白构成基底膜，基底膜被周皮细胞包覆并围绕成熟的血管，保持血管的稳定性和内皮细胞的活性[8]。当血管受到促血管形成因子的刺激后，内皮细胞被激活，细胞间的紧密连接变得松散；同时，周皮细胞从血管外层分离，基质金属蛋白酶开始降解基底膜，为新血管的出芽提供通道；然后尖细胞作为一种特殊的内皮细胞开始引导血管出芽，毗邻的内皮细胞，即茎细胞紧随其后，不断迁移和增殖来形成新的血管[5]。在血管新生的决定期，新生的血管芽将和临近的血管芽相融合，然后建立血液灌注，而未形成血液灌注的血管芽将会消退，最后血管重新恢复到静止期。

目前，血管新生被认为是创伤愈合过程中新血管形成的主要方式，这也是皮肤修复过程中血管化的主要研究方向。然而，在切割伤口和缺血皮瓣中，骨髓来源的细胞亦能够导致血管发生[7，9]，虽然血管发生在正常创伤愈合过程中的临床重要性还不清楚，但仍值得我们深入研究。

2 组织工程皮肤血管化的构建方法

目前，促进组织工程皮肤血管化的研究主要集中于：①通过种子细胞与支架结合，在体外构建血管结构，促进血管形成；②通过使用各种细胞因子，以及基因转染技术，促进组织工程皮肤的血管化；③通过设计新型支架来促进血管的长入，进而加速组织工程皮肤的血管化进程。

2.1 使用能够促进血管化的种子细胞

内皮细胞是构成血管的基本组分之一，目前使用细胞来促进组织工程皮肤血管化的大部分方法，都直接或间接地使用了内皮细胞。Trembley等[10]使用内皮细胞构建了含有毛细血管样结构的组织工程真皮，将其移植到裸鼠创面，其与裸鼠组织结合只需要4 d，而对照组则需要14 d。虽然内皮细胞来源丰富，然而其增殖率和利用率较低，限制了它的应用。内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，自从1997年发现成人内皮祖细胞以来[11]，相关研究就应用内皮祖细胞开展了大量的实验来促进血管形成。Zhang等[12]将来自于大鼠心脏血管组织的血管内皮祖细胞，与Integral matrix结合后，移植于裸鼠背部全层皮肤缺损处，其血管化程度明显高于对照组。

此外，各种干细胞在皮肤再生、创伤愈合等方面也起到很重要的作用[13]，在一定程度上能够促进皮肤的血管化。Danner等[14]在支架上接种人汗腺干细胞，然后移植到裸鼠背部全层皮肤缺损上，结果显示，接种人汗腺干细胞的支架材料血管化程度明显高于对照组。脂肪干细胞联合脱细胞真皮基质（ADM）也能促进血管形成，加速裸鼠全层皮肤缺损的愈合[15]。Klar等[16]将脂肪基质血管组分（svf）中的细胞与纤维蛋白凝胶结合培养，构建组织工程皮肤，并移植于免疫缺陷大鼠背部，发现其血管化程度明显高于对照组。Kim等[17]使用人诱导多功能干细胞分化为内皮细胞和平滑肌细胞，然后注射到裸鼠背部全层皮肤缺损周围，发现能促进血管形成，进而促进创面愈合。

2.2 应用各种细胞因子促进血管化

血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、肝细胞生长因子（HGF）、血小板源性生长因子（PDGF）等多种生长因子，都具有很强的促进血管形成的作用，能够直接或间接地激活内皮细胞，并促进其迁移，进而导致新血管的形成和成熟[18]。在组织工程皮肤中添加各种生长因子，以促进血管形成，是一种简便的方法。但各种生长因子降解周期较短，难以维持稳定的生长环境，直接应用于体内还可能导致不可预料的后果。为了使各种生长因子能够稳定持续地在组织工程皮肤中发挥促血管形成作用，有研究应用各种生物材料的缓释系统，使生长因子在体内定时、定量释放，以刺激新生血管的形成。Hosseinkhani等[19]发现，可注射水凝胶包裹bFGF能够促进小鼠皮肤血管化。此外，基因转染技术能够将表达特定的生长因子的基因，转染到特定的细胞中，从而使转染后的细胞稳定持续表达相应的生长因子。Han等[20]将VEGF基因转染人脐静脉间充质细胞，然后混合到组织工程真皮中，并用于修复小型猪背部皮肤缺损，结果发现VEGF表达增加，并且组织工程真皮血管化程度明显提高。

近年来，在组织工程皮肤方面，对MicroRNAs也进行了大量的研究[21]。MicroRNAs能够通过影响基因的表达并控制细胞的行为，进而改变皮肤的生物活性环境；MicroRNA能够调节内皮细胞的迁移、增生以及形态发生，在促进血管形成方面起到重要作用[22]。Anand等[23]发现，MiR-132能够抑制p120RasGAP的表达，进而激活Ras，从而促进血管形成。Devalliere等[24]将载有MiR-132的纳米微粒转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后，发现内皮细胞迁移和增殖能力提高，并且微血管化程度也升高了2倍。MiR-200b也能够通过抑制GATA结合蛋白2和血管内皮生长因子受体2，来抑制皮肤创面血管形成[25]。

2.3 改进支架的结构或应用新型技术

在组织工程研究中，有效的血管形成和智能的支架设计是密不可分的。不管是天然支架还是人工合成支架，都应尽量模拟细胞外基质的基本特性。支架的孔隙度、平均孔径、机械强度、表面活性等都需要进行合理的设计，以促进血管的长入[26]。多孔的支链淀粉胶原水凝胶作为真皮支架，能够促进间质细胞的聚集、血管化和肉芽组织的形成，进而促进创面愈合[27]。Rustad等[28]发现，将仿生的支链淀粉胶原水凝胶结合骨髓间充质干细胞，移植到小鼠背部创面后，能够提高VEGF和其他促血管形成因子的水平，进而促进血管形成，加速创面愈合。Wang等[29]用胶原、硫酸软骨素和透明质酸按9∶1∶1比例混合制作新型组织工程真皮支架，发现其能促进细胞的黏附和增殖，提高皮肤血管化程度，进而促进大鼠创面的愈合。

静电纺丝作为一种简便有效的、可生产纳米纤维的新型加工技术，可以模拟天然的细胞外基质的结构和生物功能，促进细胞的迁移和增殖[30-31]。Yang等[32]将载有bFGF的质粒和静电纺丝结合，bFGF能够缓慢持续释放4周，移植于糖尿病大鼠创面后，创面血管化程度明显增高。近几年，生物打印技术发展迅速，可以个性化控制细胞的分布，并精确控制支架的形状。Lee等[33]成功应用3D生物打印技术，演示了将胶原、成纤维细胞和角质细胞，层层装配成组织工程皮肤的过程。通过生物打印技术来精确模拟细胞和细胞外基质的生长环境，或许可以很好地提高组织工程皮肤血管化程度。

3 展望

目前，组织工程皮肤血管化的研究仍主要集中于利用各种血管生成细胞、生长因子和基因转染技术，来促进血管形成。每种方法的有效性都有一定的局限性，都不能完美地解决组织工程皮肤血管化的问题。随着对血管形成的机制和分子基础的不断了解和深入，我们或许能够通过运用新技术构建新型支架材料，进而将合适的细胞接种于支架材料中，并适时适量地辅以多种细胞因子，模拟天然组织生长环境的内源性特征，最终较好地促进组织工程皮肤血管形成。

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Research Advances of Neovascularization in Tissue Engineering SkinWANG Chuan,XIAO Ran,CAO Yilin.Research

Center,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100144, China.Corresponding author:XIAO Ran(E-mail:xiaoran@pumc.edu.cn);CAO Yilin(E-mail:yilincao@yahoo.com).

Skin tissue engineering;Neovascularization;Stem cells;Cytokines;Scaffolds

Q813.1+2

B

1673－0364（2017）02－0106－03

2016年12月15日；

2017年2月22日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.02.014

100144北京市中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心。

肖苒（E-mail：xiaoran@pumc.edu.cn）；曹谊林（E-mail：yilincao@yahoo.com）。

【Summary】Blood supply is the most important thing regarding skin's maintenance and transplantation,although tissue engineering skin have been commercialized and used in clinic,it has failed to achieve the vascularization.The neovascularization of tissue engineering skin at present is mainly rely on seed cells that can promote vascularization and a variety of growth factors.As the development of induced pluripotent stem cells,electrostatic spinning,and the biological printing technology,new scaffolds combined with the corresponding seed cells and cytokines can be designed to simulate the growing environment of body accurately to promote vascularization of tissue engineering skin.In this paper,the research progress of neovascularization in tissue engineering skin was reviewed.