线粒体自噬在缺血性卒中的机制研究与展望

关瑞桥，邹伟，孙晓伟，于学平，张莑，袁梦飞，戴晓红，滕伟，于薇薇

卒中是人类致残和致死的主要病因之一。美国心脏协会（American Heart Association，AHA）将卒中分为缺血性卒中、出血性卒中以及短暂性脑缺血3个种类[1]。其中缺血性卒中占每年报道的大多数，比例为85%，其他非创伤性的脑出血占总比例的15%。目前缺血性卒中主要治疗药物仍然是美国食品和药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）认证的阿替普酶，但是阿替普酶由于必须在症状发现开始4.5 h内使用，这种严格的使用限制，导致仅有3%～8%的患者得以接受治疗[2]。因此，研发新的治疗手段，延长卒中治疗的时间窗是目前卒中治疗亟待解决的问题。

1 经典自噬

自噬是一种通过自噬体—溶酶体途径调节细胞内物质转化的一种进化保守过程，其主要作用是维持细胞内环境稳态，迅速适应能量饥饿环境，以维持正常生理机能，并且能够在一定程度上保证应激条件下生物细胞的存活[3-4]。经典自噬反应中最关键的过程是细胞质的一部分分离出来形成一个新的区间，即为“自噬体”。自噬体的形成依赖于一系列的动态膜事件：首先在细胞质内形成一个隔膜小囊（吞噬泡或隔离膜），然后扩张成一个杯型结构，随后又成为一个封闭结构，最后成为一个双膜结合结构，成为一个成型的“自噬体”，其内部包含一部分细胞质。这个自噬体随后与溶酶体相融合，其内膜与内容物被溶酶体水解酶分解。最后自噬体溶酶体成为一个残余体，被分解的物质，例如氨基酸被运送回细胞质内，作为物质原料或能量来源被重新利用[5]。

2 线粒体自噬与卒中

虽然经典自噬通常被认为是一种非特异性自噬，但是有证据表明，一些细胞器例如线粒体和过氧化物酶体更容易被识别并发生自噬反应，这种过程称为线粒体自噬和过氧化物酶体吞噬[6]。其中线粒体自噬是一种目前被广泛研究的选择性自噬，其主要作用为清除破坏的线粒体以保持线粒体在细胞中的稳态[7]。其过程与经典自噬类似。坏死的线粒体导致的神经功能下降与包括卒中在内的多种疾病相关，其机制包括：①嘌呤受体激发的三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）增加；②超氧化物歧化酶导致的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量增加；③亚甲蓝引发的抗氧化防御，在卒中情况下可保护神经元[8]。因此在卒中发生过程当中，调节控制线粒体数量和质量的线粒体自噬过程，可能对治疗卒中、延缓细胞死亡、保护神经元有十分关键的意义。

3 缺血性卒中过程中影响线粒体自噬的主要因素

3.1 ROS机制 ROS是氧化应激反应中重要信号分子，在卒中病理表现中，例如脑缺血、缺血后再灌注情况下，ROS的相对过量将破坏细胞内环境稳态，导致氧化应激反应以及线粒体功能丧失[9]。氧化应激反应条件下的ROS含量增加，超出细胞在自然情况下的处理ROS的能力时，导致氧化应激以及随后细胞死亡通路的激活[10]。线粒体自噬负责清除由线粒体产生的ROS，适当的清除线粒体可以减少氧化应激反应。例如WEI等[11]的研究发现，镉离子（cadmium，Cd）可以诱发脑组织中的ROS过量，在Cd处理的脑组织，线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）被破坏，线粒体自噬体生成，PINK1水平增高以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例增高，线粒体质量下降，以上指标说明了线粒体自噬反应增加；相反的清除ROS可以恢复MMP，提高线粒体的质量，抑制PINK1表达，抑制Parkin向线粒体的聚集，降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率，说明ROS与Cd诱发的脑线粒体自噬相关，并且证明了ROS通过调节PINK1/Parkin通路上游，调整Cd诱发的线粒体自噬。

3.2 线粒体通透性改变（mitochondrial permeability transition，MPT）机制 线粒体渗透性转换孔张开导致一系列破坏性反应，伴随在短时间内大量释放ROS和钙离子[12]。线粒体渗透性转换孔在病理中的作用被广泛研究，在卒中缺血再灌注损伤中也较为常见，尤其是在ROS过量或钙离子超载的情况下。MPT的发生使线粒体内膜渗透性增加可导致电化学梯度消失引起的线粒体去极化[13]，进而导致ATP合酶在逆转过程中消耗ATP。

在卒中发生后给予迅速地再灌注，与此过程相关的线粒体渗透性转换，起初由环孢霉素A通过与亲环蛋白D结合抑制转换孔打开使组织梗死显著降低至65%～90%[14]。并且环孢霉素A还可以通过抑制蛋白质磷酸酶、钙依赖磷酸酶起到保护作用。MPT在细胞自噬、凋亡以及坏死过程中起重要作用。在低应激条件下，有限程度的MPT仅会增加线粒体自噬作为保护机制的发生，使其清除破坏的线粒体。而在过度应激条件下，将导致凋亡的发生[15]。

4 缺血性卒中相关的经典线粒体自噬通路

目前已知细胞通过几种机制执行线粒体自噬，包括调节线粒体去极化的PINK1/Parkin途径，及应激诱发的BNIP3、NIX以及与LC3直接相互作用的分子衔接子FUNDC1，以上机制均能够促进线粒体自噬的发生。以下分别介绍各通路或蛋白调节线粒体自噬的机制以及各个机制与卒中的病理关系及其研究进展。

4.1 PINK Parkin信号通路的机制与缺血性卒中 Pink1-Parkin通路是线粒体自噬中的典型信号通路之一。帕金森患者大脑中发现有功能丧失的线粒体聚集表现，说明了PINK1和Parkin与线粒体质量控制的关系[16]。Pink1编码PTEN诱发的蛋白激酶是一种包含线粒体定向序列的氨酸-苏氨酸激酶，Parkin是一种E3泛素连接酶[17]。

PINK1-Parkin通路在在卒中疾病中的研究较少，可能是因为Parkin最初在帕金森疾病中被发现，但近年来关于该机制在卒中，尤其是缺血性卒中中的研究有所增加，在一定程度上阐明了PINK1-Parkin通路参与卒中疾病脑损伤的过程。例如ZHANG等[18]的实验结果显示，Parkin在大鼠短暂性大脑中动脉阻塞模型再灌注后3 h有明显下调，与“自噬潮”高峰的时间相符，说明以Parkin为标记的线粒体被自噬反应清除。线粒体功能丧失以及氧化应激是卒中神经病理学的主要影响因素。PINK1蛋白的基础研究证明了它在氧化应激条件下的促细胞成活作用，然而其机制并未明确。SAFARPOUR[19]的实验探究了PINK1在神经元保护机制中，尤其是在缺血性卒中条件下的作用。研究发现，PINK1的缺乏引发神经元中谷氨酸盐诱发的神经兴奋性中毒反应；PINK1的激酶结构域是PINK1参与神经元保护作用的必要条件，而不是线粒体靶向序列；另外，PINK1或Parkin的缺乏可明显加重大鼠大脑中动脉阻塞体积。

4.2 NIX/BNIP3调节的线粒体自噬与卒中

BNIP3为一种凋亡前体线粒体蛋白，NIX/Bnip3L是BNIP3同族蛋白，并且有55%的同源氨基酸序列[20]。BNIP3是一种特殊的线粒体死亡诱导蛋白亚种蛋白，与线粒体功能丧失以及包括卒中在内的神经元死亡有密切关系[21]。

SHI等[22-23]的研究表明，大鼠发生卒中的大脑缺血缺氧条件下BNIP3的缺乏可引起线粒体自噬反应程度下降，同时细胞凋亡水平也随之下降，而非选择性自噬水平上调。线粒体的BNIP3与自噬体标志蛋白LC3相关，说明BNIP3与NIX相似，都可作为线粒体上的LC3结合受体。但是当BNIP3基因沉默时，NIX表达上调，但上调的NIX在病理条件下并不能补偿BNIP3的功能。实验还说明了，NIX的作用为在正常生理条件下调节基本水平的线粒体自噬，而BNIP3主要引起过度的线粒体自噬，进而导致细胞的死亡。

BNIP3与其他蛋白相关的机制较为复杂而多样，并且在卒中疾病中可能存在一定的特殊性，例如BNIP3与Mieap蛋白（一种P53诱导蛋白）在ROS依赖的反应过程下的相结合，并且Mamie、BNIP3和NIX的共同表达导致MMP明显下降，该机制与溶酶体蛋白从细胞质向线粒体基质转移相关[24]。再例如，EndoG是一个BNIP3激动的自噬性死亡通路的中介蛋白，并且BNIP3在卒中当中导致神经细胞自噬性死亡的过程是非caspase依赖性的[25]。

4.3 FUNDC 1调节的线粒体自噬与卒中

FUNDC1是一种新发现的在哺乳动物细胞缺氧条件下诱发的线粒体衔接子，通过LIR机制与LC3直接结合。在缺氧条件下，作为自噬反应起始前复合物的重要组成——ULK1激酶，向FUNDC1发生磷酸化的线粒体转移，促进FUNDC1与LC3相互作用进而促进线粒体自噬[26]。

另一项最新研究发现，FUNDC1是一种线粒体结合的膜蛋白，在缺氧条件下，FUNDC1通过与ER上的CANX蛋白相互作用而在膜上富集。在线粒体自噬过程中，FUNDC1与CANX分离，并且招募DNM1L/DRP1导致缺氧应激条件下的线粒体分裂[27]。但是目前关于FUNDC1在卒中病理中的研究仍未见报道。

5 线粒体自噬在缺血性卒中的两面性

目前已知，基础水平的线粒体自噬是在正常生理情况下控制线粒体质量的必要反应，那么它在缺血性卒中中起到什么样的作用？是有利的，还是有害的？这个问题在开始就有一定的争议性，至今这个问题仍然是讨论的热点。例如有研究结果提出，过度的线粒体自噬可导致加速浦肯野细胞死亡[28-29]。因此，线粒体自噬是一把双刃剑，当轻度病理应激条件下，作为一种保护机制；而在严重病理应激条件下，例如缺血性卒中，是一种导致细胞死亡的有害机制[30]。另外自噬反应在脑缺血和缺血后再灌注阶段可能有不同作用，例如，ZHANG等[31]的研究发现与永久性脑缺血相反，在再灌注阶段用3-MA抑制自噬，加重了而不是减轻了I-R诱发的细胞损伤，并且得出结论在再灌注阶段自噬作用的保护作用可能通过线粒体自噬以及对凋亡下游的抑制实现。因此可以推测调整过度表达的线粒体自噬途径，控制线粒体自噬和凋亡过程或许可以成为延缓细胞死亡过程的一个潜在机制，可以为今后研制卒中的有效治疗手段提供有利依据。

6 问题与展望

从线粒体自噬方面探究缺血性卒中能更好地理解其病理机制，近年来对于线粒体自噬的分子调节方面的研究有了很大的进展，但是仍有很多问题等待在以后的研究中被解决，例如线粒体自噬在缺血性卒中的不同阶段各有怎样的作用，其机制如何；以及如何利用线粒体自噬达到临床治疗的目的。以上问题在未来的研究当中仍需要进一步探究。另外，寻找在线粒体自噬方面的神经保护制剂是减少卒中导致的死亡和残疾的关键，例如在最近的研究中LIN等[32]发现，在创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）模型中，褪黑素可通过mtor通路激发线粒体自噬的发生，进而减轻由TBI引发的炎症反应。褪黑素治疗可明显减少神经元死亡，减轻TBI发生后的神经功能缺损症状。在今年最新发表的研究中，SHEN等[33]发现在大鼠大脑中动脉阻塞后，酸性处理诱发的PARK2依赖的线粒体自噬对局灶性脑缺血以及时间窗的延长作用，可将再灌注时间窗从2 h延长至4 h；而PARK2的外源性表达可将时间窗延长至6 h。

对于上述问题的解答不仅可以明确卒中和线粒体自噬之间的关系，并且能为人类发现治疗卒中的有效方案提供有力依据。

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