卒中治疗药物或治疗方法临床前评价的动物模型

中国卒中学会转化医学分会（执笔：朱东亚）

卒中是由各种血管性因素（包括出血和缺血）引起的急性脑功能障碍。卒中具有高发生率、高死亡率、高致残率等特点，给社会和家庭带来沉重负担。然而，大量临床前动物模型上有效的治疗药物，在临床试验中均未得到阳性结果。虽然原因是复杂的，但动物模型制备的技术成熟度、模型的标准化、多样性、与临床的相关性、评价指标的选择、实验条件的控制，以及未遵循多中心随机双盲原则等，都可能导致临床前与临床试验结果的不一致。鉴于此，中国卒中学会转化医学分会经过长期酝酿和多次深入讨论，决定撰写本文，并建议作为卒中临床前药物和治疗方法评价的指南，希望能推动我国卒中临床前研究的临床转化。

1 卒中动物模型的选择与临床意义

卒中一般分为两大类，一类为出血性卒中，另一类是缺血性卒中，分别需要用脑出血动物模型和脑缺血动物模型进行临床前评价。脑出血动物模型一般采用自体血脑内注射模型，注射部位和注射量可根据研究目标而定。临床上缺血性卒中的梗死体积变异较大，至少需要一种能反映体积较大的梗死灶的动物模型和一种能反映体积较小的梗死灶的动物模型。大鼠颈内动脉线栓法制备大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）往往形成较大的梗死体积，可用于评价梗死灶较大的缺血性卒中。光化学法诱导脑缺血模型形成的梗死灶较小，并且可以人为控制梗死灶体积和梗死发生的位置，因此适合于评价梗死灶较小的缺血性改变。无论线栓模型还是光化学法诱导脑缺血模型，都和临床实际的脑缺血有较大差异。因此，在评价治疗药物或治疗方法对缺血性卒中的作用时，最好另加一个大鼠同种异体血栓栓塞模型，这种模型与临床脑血栓形成比较接近。近年来，临床上血管内溶栓或介入取栓的病例越来越多，这会导致缺血再灌注。此外，还有些患者出现自发再灌注。因此，在评价治疗药物或治疗方法对缺血性卒中的作用时，应采用永久性缺血和缺血再灌注两种模型。因各种原因导致在一段时间内大脑中断血供，比如心脏手术等，可导致全脑缺血再灌注损伤，评价治疗药物或治疗方法对这种缺血性卒中的作用时，最好采用大鼠四血管结扎缺血再灌注模型。此外，选择动物模型时还要注意性别和年龄问题，至少有一种卒中模型分别使用雄性和雌性动物，至少有一种卒中模型使用老年大鼠。当然，临床上卒中的类型多种多样，不可能一一用动物模型复制，上述几种动物模型基本可以覆盖卒中的大部分情况[1]。

2 主要卒中动物模型的制备方法及评价指标

2.1 线栓法大鼠局灶性脑缺血模型（永久性和再灌注）

一般采用MCAO模型[2]。实际上，并非所有的缺血都发生在大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA），但MCAO比较容易复制，实验条件也比较容易控制，个体之间的可比性较好，建议首选该模型。

2.1.1 制备方法

2.1.1.1 手术过程 将麻醉后的大鼠仰卧位固定于手术台上，剪去颈部毛发，75%酒精、碘伏消毒颈部皮肤，颈部正中切开，用眼科镊轻轻分开表面筋膜，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，钝性分离甲状腺动脉和枕动脉并电凝切断。手术过程应尽量避免刺激气管和神经。用动脉夹夹闭颈总动脉近心端和颈内动脉，防止出血。颈外动脉近心端和远心端分别用缝线（6-0）结扎，近心端的缝线此时不扎紧，在两个缝线间剪一微小切口，插入线栓，稍系紧颈外动脉近心端的结并剪断颈外动脉。松开颈内动脉上的动脉夹，将插入的线栓翻折经颈总动脉分叉进入颈内动脉，然后徐徐插入至有轻微阻力为止（进入的线栓自分叉处至MCA起始端约20 mm），阻断MCA的所有血供并再次系紧颈外动脉的缝线固定线栓，松开结扎颈总动脉的动脉夹。如研究永久性缺血，线栓插入后，剪断血管外的线栓，消毒，缝合颈部皮肤，放回笼中饲养。如研究再灌注损伤，一般情况下缺血时间为60～120 min，然后拔栓进行再灌注。拔栓时先用动脉夹夹闭颈总动脉防止大出血，然后轻轻解开颈外动脉近心端的缝线，拔出线栓，重新扎紧缝线，消毒，缝合颈部皮肤，放回笼中饲养。如研究其他特殊问题，缺血时间可根据研究目标自行设定。

2.1.1.2 线栓规格 随着大鼠成长，体重增加，血管粗细相应有所变化，MCAO术中使用的线栓应当根据动物的体重选择不同规格的线栓。Doccol MCAO线栓稳定性好，在国内外使用较广。200～250 g成年大鼠推荐使用外径0.35 mm的线栓（对应型号：403556PK5Re），250～280 g成年大鼠推荐使用外径0.37 mm的线栓（对应型号：403756PK5Re），280～330 g成年大鼠推荐使用外径0.39 mm的线栓（对应型号：403956PK5Re）。

表1 改良Bederson 5分制法

2.1.2 主要评价指标

2.1.2.1 急性期评价指标

①梗死体积测定：对于急性期的研究，首选2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法标示梗死组织。TTC的工作原理是三磷腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）代谢的变化，适用于梗死灶的早期阶段，对于＞7 d的梗死灶，不适合用TTC染色法，可改为尼氏染色法或小动物核磁成像。但小动物核磁成像价格昂贵，并且需要的时间长，动物之间时间的一致性不容易控制，仅适合小样本量的动物实验。

②神经缺陷症状评分：急性期的神经缺陷症状采用改良Bederson 5分制法进行神经缺陷症状评价（表1）。

2.1.2.2 远期评价指标

①神经缺陷评分：远期的神经缺陷症状采用改良神经损伤严重程度评分（modified Neurological Severity Score，mNSS）法，对动物运动、感觉、反射及平衡功能进行综合评价（表2）。

②认知功能评价：采用Morris水迷宫试验测试大鼠空间学习记忆能力，包括：可视平台试验（visible platform trial），以排除感觉、视觉或运动功能障碍对空间学习记忆的影响；隐蔽平台试验（hidden platform trial），获得登台潜伏期，每天每只动物入水点顺序保持一致，同一组内每只动物各不相同，以排除组内动物信息交流；空间探索试验（probe trial），以观察受试动物的空间定位能力，及在空间探索过程中的变化规律。

③运动功能评价：对于远期的功能评价，运动功能是很关键的指标，常用的有网格实验（grid-walking test）[3]、圆筒实验[spontaneous forelimb task（cylinder test）][3]、足底胶纸实验（modified sticky-tape test）[4]、转角实验（corner turn test）[5]、转棒实验（rotarod test）等[6]，至少要选择两种方法测定运动功能。

④生理参数评价：在急性期，要测定平均动脉压（mean blood pressure，MBP）、血氧分压（PaO2）、血二氧化碳分压（PaCO2）、血pH、体重；远期实验要定期测定体重和摄食量，记录死亡情况，绘制生存曲线图。

2.1.3 实验条件控制

2.1.3.1 脑血流 在脑缺血过程中，用激光多普勒血流仪监测脑血流。血流的下降程度与梗死概率成正相关。脑缺血后脑血流下降85%～95%为宜。如果脑血流下降＜85%，可认为脑缺血不完全，剔除该动物。

2.1.3.2 体温 在脑缺血过程中，用电加热毯加热，控制肛温（37±0.2）℃。

2.1.4 数据剔除条件 有下列情况时，数据可以剔除：①脑血流下降不满足条件者；②麻醉清醒后，动物没有典型的神经缺陷症状，提示缺血不成功；③出现抽搐、惊厥，一般因脑出血所致；④尸检或终点解剖时发现脑出血。

2.2 光化学法诱导脑缺血模型

2.2.1 制备方法 将大鼠俯卧位固定于立体定位仪上，剪去头部的毛发，用75%酒精、碘伏消毒皮肤，矢正中纵向剪开头部皮肤，暴露颅骨，剥离颅骨表面结缔组织膜，用棉签擦去颅骨表面组织液并用洗耳球吹干，标记前卤点和λ点，读取前卤点和λ点的D值，调整前卤点和λ点的D值相差不超过0.2 mm，将直径为8.0 mm的冷光源出光孔定位于前卤点向右4.0 mm处。从大鼠股静脉注射玫瑰红（13 mg/kg；10 mg/ml溶于注射用生理盐水中），2 min后用光强1800×100 lux～1900×100 lux的冷光源照射10 min，移除光纤，消毒，缝合头部皮肤，放回笼中饲养[7]。

2.2.2 主要评价指标

2.2.2.1 急性期评价指标

①梗死体积测定：对于急性期的研究，首选TTC染色法标示梗死组织。

②运动功能评价：同2.1.2.2。

2.2.2.2 远期评价指标

①梗死体积测定：对于远期研究，选用尼氏染色法标示梗死组织。

②运动功能评价：同2.1.2.2。③神经缺陷评分：同2.1.2.2。

④组织学评价：由于该模型梗死灶和梗死灶周围区的界限分明，评价药物是否影响梗死灶周围区的组织学变化容易实施，建议在远期药效评价时观察如下指标：神经元丢失情况，小胶质细胞激活情况，存活神经元树突长度、分支数、树突棘密度，轴突芽生情况，血管新生情况。

⑤生理参数评价：在急性期，要测定MBP、PaO2、PaCO2、血pH、体重；远期实验要定期测定体重和摄食量，绘制体重变化曲线图。

2.2.3 实验条件控制 同2.1.3。

表2 改良神经损伤严重程度评分（总分18分）

2.2.4 数据剔除条件 有下列情况时，数据可以剔除：①脑血流下降不满足条件；②麻醉清醒后，动物没有典型的运动功能缺陷，提示缺血不成功；③脑梗死诱导剂玫瑰红注射有误，可能导致梗死灶不准确。

2.3 远端MCA闭塞模型

2.3.1 制备方法 将大鼠侧卧位于手术台上，剪去右侧外耳道和右眼外眦之间的毛发，用75%酒精、碘伏消毒皮肤，在两个位置连线的中点做一切口，长约2 cm。止血钳拉开伤口，切断颞肌，分离肌肉，暴露颧骨。用咬骨钳除去颧弓，使用牵张器撑开下颌骨与颧弓，暴露卵圆窗。用骨钻在卵圆窗前3 mm下1 mm处钻孔，在显微镜下透过硬脑膜即可看见MCA，垂直于嗅束上行。挑破硬脑膜，分离MCA周围的蛛网膜，暴露MCA。将中动脉挑起，用电凝器凝闭MCA，电凝位置在其分支豆纹动脉之前或靠近颈内动脉处。缝合头部皮肤，放回笼中饲养[8]。

2.3.2 主要评价指标

2.3.2.1 急性期评价指标

①梗死体积测定：同2.2.2.1。

②运动功能评价：同2.1.2.2。

2.3.2.2 远期评价指标

①梗死体积测定：同2.2.2.2。

②运动功能评价。同2.1.2.2。

③神经缺陷评分：同2.1.2.2。

④组织学评价：同2.2.2.2。

⑤生理参数评价：同2.2.2.2。

2.3.3 实验条件控制 同2.1.3。

2.3.4 数据剔除条件 有下列情况时，数据可以剔除：脑血流下降不满足条件；麻醉清醒后，动物没有典型运动功能缺陷，提示缺血不成功。

2.4 大鼠同种异体血栓MCA栓塞模型

2.4.1 制备方法（分两天进行）

2.4.1.1 第一天 大鼠麻醉后仰卧位固定，暴露其股三角，剪去腿部毛发，75%酒精、碘伏消毒皮肤，用手术刀沿股三角上的股骨做一约10 mm的切口，分离暴露股动脉、股静脉、神经束，钝性分离出约5～8 mm股动脉，结扎股动脉远心端，并在近心端用动脉夹瞬时阻断血流，结扎处与动脉夹之间穿一根6-0缝线，并松松地系上一个活结，剪一小口，插入PE50管至动脉夹处，系紧活结，慢慢松开动脉夹，使血液顺滑、直接地流入并充满PE50管，再夹闭。取下PE50管，再系紧缝线，取下动脉夹，4-0缝线缝合伤口。将充满血液的PE50置于一有盖培养皿，置于37℃下2 h，然后储存于4℃下22 h（期间保持充满血液的PE50平整，并避免不必要的搅动）[9]。

2.4.1.2 第二天 取一平皿，加入生理盐水，准备约500 mm的PE10连接于一含1 ml生理盐水的注射器，将含有血栓的PE50截成约50 mm每段，将50 mm的含血栓PE50连接到PE10上，然后将血栓打入含生理盐水的皿中，反复将血栓吸入打出PE10，10～15次后血栓变为微弱的桃红色，表明血栓准备成功（注意：洗血栓时，打入皿中应尽量保持栓子为直线，避免折叠。若洗涤超过10～15次后血栓仍保持红色则弃去不用）；将洗好的血栓分割成40 mm每段，储存于含生理盐水的有盖培养皿中，室温20～26℃可储存4 h。超过4 h的血栓则弃去。MCAO前将血栓吸入改造好的PE50（改造PE50管全长至少120 mm，且其尖端长约22 mm，内径0.3～0.4 mm，尖端后内径0.4～0.97 mm，改造的PE50与250 μl微量进样器相连）[9]。

2.4.1.3 MCAO模型制备 将麻醉后的大鼠仰卧位固定于手术台上，剪去颈部毛发，75%酒精、碘伏消毒颈部皮肤，颈部正中切开，用眼科镊轻轻分开表面的筋膜，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，轻轻剥离迷走神经，用动脉夹夹闭颈总动脉近心端。颈外动脉近心端和远心端分别用缝线（6-0）结扎，并剪断。在颈内动脉下穿一根缝线（2-0），防止出血，然后在颈外动脉和颈总动脉分叉处之间剪一微小切口，插入改造的PE50，经过颈总动脉分叉进入颈内动脉，然后徐徐插入至有轻微阻力为止（自分叉处约20 mm），稍稍退出1～2 mm，用微量注射泵以10 μl/min速度缓慢注射含有生理盐水的血栓5～10 μl，注射血栓5 min后，轻轻拔出改造的PE50，恢复颈总动脉的血供，消毒，缝合颈部皮肤，放回笼中饲养[9]。

2.4.2 主要评价指标

2.4.2.1 急性期评价指标

①梗死体积测定：同2.2.2.1。

②死亡率：相对于线栓MCAO模型，同种异体血栓MCA栓塞模型的死亡率较高，急性期死亡率是重要指标。

③神经缺陷症状评分：同2.1.2.1。

2.4.2.2 远期评价指标

①神经缺陷评分：同2.1.2.2。

②认知功能评价：同2.1.2.2。

③运动功能评价：同2.1.2.2。

④生理参数评价：同2.1.2.2。

2.4.3 实验条件控制 同2.1.3。

2.4.4 数据剔除条件 同2.1.4。

2.5 大鼠脑出血模型

推荐采用自体血注入法制备大鼠脑出血模型[10]，注射部位可以根据研究目的选择，本文以纹状体内自体血注射为例介绍。

2.5.1 制备方法 大鼠麻醉后俯卧位固定于立体定位仪上，剪去头部的毛发，用75%酒精、碘伏消毒皮肤，矢正中纵向剪开头部皮肤，暴露颅骨，剥离颅骨表面结缔组织膜，用棉签擦去颅骨表面组织液并用洗耳球吹干，标记前卤点和λ点，读取前卤点和λ点的D值，调整前卤点和λ点的D值相差不超过0.2 mm，取前卤点右侧中线旁开3.0 mm、冠状缝前0.02 mm，用尖头锥钻一直径约1.0 mm的圆孔。暴露大鼠股三角，剪去腿部毛发，75%酒精、碘伏消毒皮肤，用手术刀沿股三角上的股骨做一约10 mm的切口，分离粘连暴露股动脉、股静脉、神经束，钝性分离出约5～8 mm股动脉，用微量进样器取不抗凝自体股动脉血80 μl，将进样器固定在微量注射泵上，进针深度距离颅骨表面5.5 mm，缓慢注入（10 μl/min），注射结束后留针3 min，然后缓慢将微量注射器拔出，用骨蜡封闭针眼，消毒，缝合头部、腿部皮肤，放回笼中饲养。

2.5.2 主要评价指标

2.5.2.1 急性期评价指标

①出血指标：血肿部位和血肿范围、血红蛋白含量测定。

②脑水肿：出血侧脑含水量测定。

③血脑屏障：用伊文思蓝法定量测定血脑屏障的通透性。

④神经缺陷症状评分：同2.1.2.1。

2.5.2.2 远期评价指标

①组织缺失体积：脑出血急性期后，水肿消退，由于出血区和周围损伤区细胞死亡导致出血侧脑组织体积减小，直接测量出血侧和对侧半球的脑组织体积，即可计算出出血侧脑组织缺失体积。

②神经缺陷评分：同2.1.2.2。

③运动功能评价：同2.1.2.2。

④生理参数评价：同2.1.2.2。

2.5.3 实验条件控制 在脑缺血过程中，用电加热毯加热，控制肛温（37±0.2）℃。

2.5.4 数据剔除条件 有下列情况时，数据可以剔除：自体血注射时有血凝块；麻醉清醒后，动物没有典型的神经缺陷症状。

2.6 大鼠全脑缺血再灌注模型

全脑缺血模型常用沙土鼠双侧颈总动脉结扎再灌注模型和大鼠四动脉结扎再灌注模型。沙土鼠模型不稳定，最好首选双侧椎动脉电凝法和动脉夹短暂阻塞双侧颈总动脉法制备大鼠四动脉结扎（four vessel occlusion，4VO）再灌注模型[11]。

2.6.1 制备方法（分两天进行）

2.6.1.1 第一天 动物麻醉后俯卧位固定于立体定位仪上，剪去头和颈背部的毛发，用75%酒精、碘伏消毒皮肤，正中切开颈背部皮肤，暴露第一和第二颈椎，用棉签擦去表面组织液并用洗耳球吹干，在体视显微镜下找到第一颈椎左右两侧的翼小孔，使用电凝针电凝翼小孔，阻塞左右两侧的椎动脉，消毒，缝合头部皮肤，放回笼中饲养。

2.6.1.2 第二天 一期手术后24 h，使用异氟烷和氧气按比例混合的混合气体麻醉动物，仰卧位固定于手术台上，剪去颈部毛发，75%酒精、碘伏消毒颈部皮肤，正中切开，用眼科镊轻轻分开表面的筋膜，分离左右两侧颈总动脉，动脉夹夹闭两侧的颈总动脉，撤走麻醉气体；缺血12 min后将动脉夹松开，恢复血供进行再灌注，消毒，缝合颈部皮肤，放回笼中饲养。

2.6.2 主要评价指标

2.6.2.1 认知功能评价 同2.1.2.2。

2.6.2.2 组织学评价 该模型的典型组织学改变是海马CA1区神经元死亡，需用两种以上的方法测定海马CA1区神经元死亡情况，建议使用NeuN免疫荧光法或Nissl染色组织化学法标记存活的神经元，用Fluoro Jade荧光染色标记坏死或凋亡的神经元。

2.6.2.3 生理参数评价 在缺血及再灌注过程中，观察其脑电图形态和各波段相对功率值的变化。

2.6.3 实验条件控制 同2.5.3。

2.6.4 数据剔除条件 有下列情况时，数据可以剔除：四动脉结扎后动物翻正反射未消失；脑电图未出现典型变化。

3 临床前主要药效学评价指导原则

3.1 模型选择

溶栓或抗凝血类药物只能选择脑缺血模型，神经保护剂应同时选择脑缺血和脑出血模型。脑缺血模型应包括但不限于线栓MCAO永久缺血和缺血再灌注模型、光照致化学损伤皮层永久梗死模型和同种异体血栓MCAO模型。同种异体血栓MCAO模型建议使用老年大鼠。在上述模型中，至少有一种模型使用雌性大鼠复制在雄性大鼠的实验结果。如果受试药物拟用于心脏手术等导致全脑缺血的临床适应证时，应增加1个4VO全脑缺血再灌注模型。

3.2 药物剂量组设置和样本量

对于急性期药效学的量效关系研究，至少按等比设高、中、低3个剂量组，另设1个阳性药组，1个溶剂对照组，1个假手术组，可供统计的样本量每组＞12只（假手术组10只）。对于远期药效学，由于工作量巨大，尤其认知及运动功能的行为学测定，组数太多很难保证个体间的一致性，一般选择一个急性期的有效剂量即可，另设1个阳性药组，1个溶剂对照组，1个假手术组，可供统计的样本量每组＞15只（假手术组10只）。但远期药效至少有1个模型需反映量-效关系，设两个以上的给药组。

3.3 治疗时间窗

临床前的急性期药效学评价必须有一个治疗时间窗试验，选择一个有效剂量，在脑缺血后不同时间点开始给药治疗，一般选择脑缺血后2、4、6 h开始治疗。对于需要评价更宽时间窗的药物，可以另行设计时间点。

3.4 给药途径

应严格按照拟推荐临床的给药途径进行动物试验，静脉滴注的药物可以用静脉注射替代，但至少有一个模型要用静脉滴注给药。静脉注射或滴注的药物不能用腹腔注射或其他注射途径替代。

3.5 永久性缺血和缺血再灌注

鉴于临床上脑缺血再灌注比例较低，在模型选择时尤其要重视永久性脑缺血，但至少要有一种缺血再灌注模型。

3.6 远期药效

远期神经功能评价和影像学评价是临床上卒中药物治疗效果的关键指标，因此临床前必须进行远期药效学研究，观察时间不少于4周，观察指标包括学习记忆能力、运动功能、梗死体积、死亡累积曲线等。建议优先使用小动物核磁成像测定远期药效的梗死体积。至少需要两种模型能反映远期药效。

3.7 药动学-药效学相关性

为了反映药物作用的特异性，应选择一个急性缺血卒中模型，使用1～2个有效剂量，同时测定脑组织的药物浓度和药动学参数，建立药动学-药效学的相关性。

3.8 阳性药对照

临床前药效学研究必须设阳性对照药组，阳性药首选有相同或相似作用机制的商品化药物，如果没有相同或相似作用机制的商品化药物，可选择有相同作用机制的国际公认的模型药物，即这种对照药虽然没有商品化，但已被大量实验室作为工具药物使用。如果也没有模型药物，可使用临床大量使用的同一适应证的商品化药物。

3.9 溶剂对照

溶剂对照组使用的溶剂，必须是拟在临床试验时使用的制剂的溶剂，不能改变溶剂组成和配制方法。

3.10 动物品系

4VO全脑缺血模型应选用Wistar大鼠，其他模型选用SD大鼠，小鼠最好选用C57BL/6J或其他品系纯的品种，不建议使用昆明种或ICR小鼠。

3.11 分组原则

①随机原则：按照机遇均等的原则进行分组，其目的是使一切干扰因素造成的实验误差减少，而不受实验者主观因素或其他偏性误差的影响，将动物随机分配到实验组与对照组。②对照原则：实验过程中需要包含阳性对照组（标准对照品或阳性药）和阴性对照组（给予不含药物的溶媒）。③重复原则：在相同的条件下，多中心或多个实验室可重复出相似的结果。④双盲原则：双盲实验是一种更为严格的实验方法，旨在消除可能出现在实验者和参与者意识当中的主观偏差和个人偏好。在双盲实验中，由设盲者负责动物的分组和受试药物的配制，实验者和参与者都不知道具体的分组情况及给药情况，只有在所有数据被记录完毕之后，由设盲者进行揭盲。

3.12 麻醉剂

卒中动物模型制备过程中使用甲氧氟烷或异氟烷等吸入麻醉，不建议使用水合氯醛等注射麻醉。

3.13 动物福利

动物试验者必须有动物操作上岗合格证，动物处死必须在麻醉下进行，动物试验操作需尽量减少动物的痛苦，动物尸体处理按所在单位的规定执行。

结束语：这是第一次推出卒中临床前评价指南，虽然中国卒中学会转化医学分会在一年多的时间里做了大量工作，但由于理论和技术方面的限制，该指南在诸多方面未臻完善，随着在推广过程中遇到的新问题，以及在卒中领域技术的新进展，还要不断修订。

[1] 杨国源，金坤林. 实验卒中手术学[M]. 北京：中国科学技术出版社，2012：112-237.

[2] SUGHRUE M E，MOCCO J，KOMOTAR R J，et al.An improved test of neurological dysfunction following transient focal cerebral ischemia in rats[J]. J Neurosci Methods，2006，151（2）：83-89.

[3] CLARKSON A N，HUANG B S，MACISAAC S E，et al. Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke[J]. Nature，2010，468（7321）：305-309.

[4] BOUET V，BOULOUARD M，TOUTAIN J，et al. The adhesive removal test：a sensitive method to assess sensorimotor de fi cits in mice[J]. Nat Protoc，2009，4（10）：1560-1564.

[5] HUA Y，SCHALLERT T，KEEP R F，et al. Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat[J]. Stroke，2002，33（10）：2478-2484.

[6] YANG F，WANG Z，ZHANG J H，et al. Receptor for advanced glycation end-product antagonist reduces blood-brain barrier damage after intracerebral hemorrhage[J]. Stroke，2015，46（5）：1328-1336.

[7] LINDAU N T，BÄNNINGER B J，GULLO M，et al.Rewiring of the corticospinal tract in the adult rat after unilateral stroke and anti-Nogo-A therapy[J]. Brain，2014，137（Pt 3）：739-756.

[8] LI H，COLBOURNE F，SUN P，et al. Caspase inhibitors reduce neuronal injury after focal but not global cerebral ischemia in rats[J]. Stroke，2000，31（1）：176-182.

[9] ZHANG L，ZHANG R L，JIANG Q，et al. Focal embolic cerebral ischemia in the rat[J]. Nat Protoc，2015，10（4）：539-547.

[10] ARDIZZONE T D，ZHAN X，ANDER B P，et al.SRC kinase inhibition improves acute outcomes after experimental intracerebral hemorrhage[J]. Stroke，2007，38（5）：1621-1625.

[11] NANRI K，MONTÉCOT C，SPRINGHETTI V，et al.The selective inhibitor of neuronal nitric oxide synthase，7-nitroindazole，reduces the delayed neuronal damage due to forebrain ischemia in rats[J]. Stroke，1998，29（6）:1248-1253.