辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列的克隆及分析

李宁，杨生保，杨涛，王柏柯，唐亚萍，王强，帕提古丽·艾斯木托拉，余庆辉

(新疆农业科学院园艺作物研究所，乌鲁木齐 830091)

辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列的克隆及分析

李宁，杨生保，杨涛，王柏柯，唐亚萍，王强，帕提古丽·艾斯木托拉，余庆辉

(新疆农业科学院园艺作物研究所，乌鲁木齐 830091)

【目的】从辣椒基因组中克隆Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列，分析其家族特性及进化关系。【方法】根据Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶保守区域设计简并引物，通过PCR扩增、回收、克隆、测序得到的目的基因序列。【结果】克隆从辣椒基因组14条逆转录转座子逆转录酶序列，序列大小均为340 bp左右。生物信息学分析表明，序列长度变化范围为310～345 bp，同源性范围为60.2%～99.1%。这些核苷酸序列具有较高的异质性，主要表现为终止密码子突变。聚类分析可将所得序列分为5大类，基于逆转录酶序列进行的不同物种进化树分析显示，第Ⅳ、Ⅴ类序列与荸荠、潘那利番茄等组成一大类，可能是逆转录转座子横向传递的结果。【结论】辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列具有普遍性、异质性等特点，与荸荠、潘那利番茄等物种的同类型逆转座子可能有相同的起源。

辣椒；Ty3-gypsy逆转录转座子；逆转录酶

0 引 言

【研究意义】逆转录转座子是刺激寄主细胞基因组发生多种形式的遗传重排，促进基因组的流动，引发植物性状突变，有利于生物遗传多样性及基因组遗传进化的关键因子，作为一种可移动的遗传因子分散在真核基因组中[1]。这种特殊的转座方式使其在基因组中具有高拷贝性，通过克隆与分析其序列，对解析植物基因组突变、进化及遗传多样性具有重要意义[2-3]。【前人研究进展】植物逆转录转座子是构成植物基因组的主要成分，种类多，分布广，它以RNA为中间体，借助逆转录酶/RNaseH反转录成DNA，再插入到基因组中。转座子以转座方式分为以DNA-DNA转座和反转录转座；逆转录转座子又以其5′端和3′末端重复序列的缺失划分为两种：长末端重复逆转录转座子和非长末端重复逆转录转座子。长末端重复逆转录转座子按结构差异又分为Tyl-copia与Ty3-gypsy两个亚类[3]，5′端和3′端末端重复序列长度从几百bp到5 Kb不等，在多数情况下以5′-TG-3′为起始，以5′-CA-3′为终止，这两段标识序列称为TG-CA盒(TG-CA box)。在植物基因组中都具有存在普遍、拷贝数密集、特异位点插入等特点，在真核基因组的突变，基因功能分析和系统发育，基因组进化及生物多样性检测等研究中均具有重要意义[3]。Ty3-gypsy类逆转录转座子在葡萄果皮颜色的变化[4]，菜豆花色的形成[5]等方面发挥着至关重要的作用。【本研究切入点】迄今为止Ty1-copia逆转录转座子已在大多数重要植物中研究分析[6]，但关于Ty3-gypsy逆转录转座子，目前的研究还相对较少[7]。因此，开展辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子研究极其必要。研究通过克隆Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列，为揭示辣椒遗传进化特性提供新信息，为进一步解析其色素功能奠定基础。【拟解决的关键问题】研究对辣椒(CapsicumannuumL.)基因组DNA中Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列提取、克隆和序列的特性分析，为辣椒基因组进化和种质资源多样性研究提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

由新疆农业科学院园艺作物研究所辣椒课题组提供辣椒品种IL60，以其叶片为试材，于2015年6月在新疆农业科学院园艺作物研究所蔬菜分子实验室液氮保存。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取及逆转录酶扩增

辣椒基因组DNA采用植物基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取，用琼脂糖凝胶电泳检测其质量及完整性。根据检测结果将DNA浓度稀释至20 mg/L后于-20℃保存备用。

逆转录转座子逆转录酶的引物设计参照Kumekawa方法[8]。TY3-F：5′-AGMGRATGTGSGTYGASTAT-3′；TY3-R：5′-GTWGGKSTTMKGTGTRAA-3′。其中R=A+G，M=A+C，Y=C+T，S=C+G，K=G+T，W=A+T。

逆转录转座子逆转录酶的扩增程序为：

94℃ 3 min

72℃ 12 min

PCR反应体系为：体系20.0 μL，含有10×Buffer 2.0 μL，30 ng的模板DNA，Mg2+2.0 mmol/L，引物(TY3-F和TY3-R)1.0 μmol/L，TaqDNA聚合酶1 U，dNTPs 0.25 mmol/L，ddH2O补充至20 μL。

1.2.2 PCR产物的回收、克隆及转化

PCR产物通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用琼脂糖回收试剂盒回收产物(北京QIAGEN)。回收产物与TransGen Biotech的pEASY-T5 Zero Cloning Kit载体连接，连接产物直接用大肠杆菌DH5α感受态细胞进行转化，转化菌液涂布于固体LB培养基(含有Amp)上，静置过夜培养(37℃)。挑取单菌落，加入到液体LB培养基(含有Amp)中摇菌。

1.2.3 逆转录酶序列的测序及分析

采用菌液PCR鉴定，结果为阳性克隆的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果采用NCBI数据库中的BLAST程序检测、多重比对最终获得逆转录转座子逆转录酶基因片段的氨基酸序列，最终将得到的Ty3-gypsy逆转座子逆转录酶序列命名为CATY。使用DNAMAN和MEGA 5.0等生物软件对辣椒逆转录转座子逆转录酶的氨基酸序列组成成分机同源分析等，并且构建其不同系统发育进化树(N-J法)。

2 结果与分析

2.1 Ty3-gypsy逆转录酶序列的PCR扩增

采用天根试剂盒提取辣椒叶片的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，基因组DNA条带单一明亮，无拖尾现象，质量较好。通过借鉴Kumekawa方法设计辣椒逆转座子逆转录酶的PCR引物，最终在辣椒基因组DNA中PCR扩增出一条330 bp左右的基因片段，表明在辣椒中Ty3-gypsy逆转座子普遍存在。 图1～2

2.2 Ty3-gypsy逆转录酶序列的组成与同源性

克隆测序后，共得到24条序列信息。通过采用BLAST程序推导、比对，去除重复与过短序列，最终获得14条不同序列，比对结果这14条序列与已知其他植物Ty3-gypsy逆转录酶序列有很高的相似性，说明PCR扩增辣椒Ty3-gypsy类逆转录转座子逆转录酶序列克隆成功。采用DNAMAN与DNAstar软件分析序列，碱基AT在整个序列的比例范围为1.48～1.92，核苷酸序列变化范围为318～342 bp，依次命名为CATY1～CATY14，其中序列长度CATY8和CATY14最小为318 bp、CATY6为327 bp、最大是CATY9为342 bp，其余均为339 bp。表1

图1 辣椒组织DNA 1 %琼脂糖凝胶电泳

Fig.1 Pepper tissue DNA 1% agarose

M：DL 2000 marker；A、B：IL60

图2 辣椒逆转录转座子逆转录酶序列PCR扩增

Fig.2 PCR amplification of reverse transcriptase sequence from Pepper

表1 辣椒逆转录转座子逆转录酶序列组成

Table 1 Base composition of retrotransposon reverse transcriptase in pepper

序列号Sequence大小/bpSize/bpAT比例ATcontent(%)序列号Sequence大小/bpSize/bpAT比例ATcontent(%)CATY13391.58CATY83181.69CATY23391.56CATY93421.56CATY33391.55CATY103391.65CATY43391.48CATY113391.70CATY53391.99CATY123391.92CATY63271.77CATY133331.85CATY73391.78CATY143181.59

表2 辣椒中逆转录转座子逆转录酶的序列差异百分率(左下方)和同源性(右上方)

Table 2 Pepper retrotransposon reverse transcriptase sequence difference percentage (bottom left) and homology (right)

CATY1CATY2CATY3CATY4CATY5CATY6CATY7CATY8CATY9CATY10CATY11CATY12CATY13CATY14CATY199.177.063.771.768.869.070.866.476.168.175.269.470.8CATY20.0176.163.772.667.968.169.866.477.067.374.368.569.8CATY30.260.2668.189.484.467.383.082.399.184.198.283.884.9CATY40.460.460.3965.565.161.959.460.268.164.668.165.860.4CATY50.340.320.110.4377.160.273.675.290.377.087.676.675.5CATY60.380.390.170.430.2664.270.671.683.599.184.499.172.5CATY70.380.390.400.490.520.4562.356.666.463.767.364.063.2CATY80.350.360.190.530.310.350.4867.082.170.882.170.298.1CATY90.420.420.200.520.290.340.580.4182.371.780.571.268.9CATY100.260.260.010.390.100.180.420.200.2083.297.382.984.0CATY110.390.400.170.440.260.010.460.350.340.1984.198.272.6CATY120.290.300.020.390.130.170.400.200.220.030.1783.884.0CATY130.370.380.180.430.270.010.450.360.340.190.020.1872.1CATY140.350.360.160.510.280.320.470.020.380.180.320.180.33

将序列导入DNAstar软件运用Clustal W方法计算序列间的异质性。结果表明，同源性范围为60.2%～99.1%，其中序列CATY1与CATY2的同源性最高，为99.1%，序列CATY5与CATY7的同源性最低，仅为60.2%；辣椒逆转录酶序列间差异性范围为1%～58%，其中序列CATY7与CATY9的差异性为58%，CATY1与CATY2的差异性最低，为1%。由此推论，用同一简并引物PCR扩增出单一条带的前提下，但克隆得到的辣椒Ty3-gypsy逆转录酶序列并非相同，并且序列之间的碱基同源性、序列长度和碱基变化上都有着丰富的多态性，说明辣椒基因组中Ty3-gypsy逆转录酶存在一定的异质性。表2

注：.为终止密码子

Note: *: Stop code

图3 辣椒中逆转录酶氨基酸序列比较

Fig.3 Reverse transcriptase amino acid sequence comparisons in pepper

2.2 辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子RT氨基酸序列比对

使用NCBI软件将克隆得到的14条逆转录转座子序列翻译成氨基酸序列，并通过DNAMAN软件进行比对分析。结果显示，大部分辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子氨基酸序列上游和下游均含有DDLLDEL和VFFDDIL这两个保守序列，与已报道其他植物的Ty3-gypsy逆转录转座子区域相吻合。将这14条Ty3-gypsy类逆转录酶的氨基酸序列比对分析，结果得到CATY4(第12个氨基酸处)、CATY7(第76个氨基酸处)、CATY9(第22和73个氨基酸处)和CATY12(第95个氨基酸处)4条序列都发生了移码突变；14条序列有11条发生1～8个终止密码子突变，大部分序列的终止密码子突变都是2个。其中发生突变最少的是CATY2，在第52个氨基酸处发生1个终止密码子突变，最多的是CATY4，在第7、12、33、49、60、75、84和96个氨基酸处发生了8个终止密码子突变， CATY8在第41、51和57个氨基酸处，CATY13在第19、69和83个氨基酸处均发生了3个终止密码子突变。由此推论，导致辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子异质性的重要原因就是移码突变和终止密码子突变。图3

2.2.3 辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子RT系统进化分析

通过软件MEGA 5.0分析14条辣椒Ty3-gypsy类逆转录转座子的氨基酸序列，以这14个蛋白质序列构建系统进化树(使用N-J法)。结果表明，辣椒Ty3-gypsy类逆转录转座子被N-J法进化树分为5类，其中Ⅰ类包含CATY3、CATY5、CATY9、CATY10、CATY12，Ⅱ类包含2条序列分别是CATY8和CATY14，Ⅲ类包含3条序列，Ⅳ只有单独一条序列CATY4，推断由于其含有终止密码子突变较多，导致与其他序列差异较大，进化树将其分为一类。Ⅴ类中也包含3条序列。这14条辣椒Ty3-gypsy类逆转录转座子的氨基酸序列相似度都很高，最高都到99%，但由于序列间受到一定程度移码突变和终止密码子突变，导致分类不同。由此可见同一家族的逆转录转座子产生异质性的原因之一是氨基酸序列受到碱基插入、替换或缺失突变[10]。图4将NCBI上已登录的其他植物Ty3-gypsy类逆转录酶的氨基酸序列与14条辣椒逆转录酶的氨基酸序列采用N-J法构建系统进化树，这些序列间的遗传距离范围为0～0.649。这5类的氨基酸序列相似性较高，只和荸荠(Eleocharisquinqueflora)ADF46081遗传距离较近，与其它植物差异较大；Ⅳ类中CATY4氨基酸序列与荸荠在进化关系上相对较近，遗传距离分别为0.230。Ⅳ、Ⅴ类氨基酸序列与多花黑麦草(Loliummultiflorum)、列当(Orobancheowerinii)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、野黄瓜(Cucumishystrix)和潘那利番茄(Solanumpennellii)组成一大类，与蔷薇科植物亲缘关系比较近，这与植物分类学基本一致。图4～5辣椒逆转录转座子逆转录酶的氨基酸基本上序列之间进化距离较近，推断其被转座复制的时间不长。辣椒逆转录转座子逆转录酶在生物进化过程中有可能发生了横向传递作用。

图4 辣椒逆转录酶序列进化树

Fig.4 Reverse transcriptase sequence phylogenetic tree in pepper

图5 辣椒与其它植物Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶的氨基酸序列进化树

Fig.5 Phylogenic tree of amino sequences of reverse transcriptase of Ty3-gypsy retrotransposons in pepper undatus and other plants

3 讨 论

近年来辣椒的基因组研究主要分为分子标记和基因克隆两方面[11-12]，而对于Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶构成植物基因组重要部分的研究报道寥寥可数。研究通过PCR克隆技术利用Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶的简并引物从辣椒品种IL60中克隆到辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶，PCR结果显示辣椒IL60逆转录转座子逆转录酶序列长度变化范围在310～345 bp，觉得大多数基因序列为345 bp，这与前人的研究结果大同小异[9,13]，由此可以推断此次克隆辣椒Ty3-gyspy逆转录转座子转录酶基因片段真实可靠，并且Ty3-gyspy逆转录转座子在辣椒中应当是普遍存在。DNAMAN软件比对结果显示，不同物种Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列不仅在基因序列长度方面比较相似，而且在不同程度上有着必然的保守性，综上所述，实验通过引物PCR克隆得到的Ty3-gypsy类逆转录转座子转录酶的方法是行之有效的。

逆转录转座子是导致植物突变及基因组遗传和进化的重要原因[14,15]，研究中分离克隆了14条辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列，其中有4条序列发生了移码突变，分别是CATY4、CATY7、CATY9和CATY12；14条序列中有11条发生1～8个终止密码子突变，在11条辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列中普遍都为2个终止密码子突变。这里面发生最多的是CATY4，在第7、12、33、49、60、75、84和96个氨基酸处发生了8个终止密码子突变，突变最少的是CATY2，在第52个氨基酸处发生1个终止密码子突变；发生了3个终止密码子突变的分别是CATY8和CATY13。结果显示辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列在不管在序列长度还是在碱基同源性和碱基变化上都存在极大地异质性，因而能够推断，导致辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶的异质性的重要原因是移码突变和终止密码子突变[16]，此结果与周鹏[17]和石凤敏等[18]的研究结论相仿。辣椒逆转录酶序列间差异性范围为1%～58%；最高同源性范围为60.2%～99.1%，结果分析辣椒逆转录酶序列之间存在一定的异质性，这与其它植物Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶研究结果近似[19]。主要原因由于逆转录转座子逆转录酶没有错读校对功能，使得逆转录转座子发生转座过程中易发生高频突变；在向日葵逆转录转座子研究中的也认为在同一物种中克隆的同一类逆转录转座子仍表现为极度异质性[20]。另外，逆转录转座子间同源序列重组和寄主的防御机制也会促使逆转录转座子变异[21]。

将辣椒中14条逆转录酶序列通过MEGA 5.0聚类分析，结果分为5类，其中每一类逆转录酶氨基酸序列数量千差万别，更确切的表明同一类逆转录转座子在转录过程存在一定微乎其微的差异，推断其存在的历史地位也可能全然不同[22]，对辣椒基因组进化的作用也是千差万别。通过MEGA 5.0采用N-J法对辣椒逆转录酶序列与NCBI数据库中其他植物Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶的氨基酸序列构建系统进化树，结果表明辣椒与荸荠，潘娜利番茄，拟南芥和列当的相关序列同源性较高，这种相似性不仅与植物学分类结果相吻合，进一步推论可能是Ty3-gypsy逆转录酶对应的反转录转座子在生物进化历程上横向传递的结果[23-24]，这在一定程度上为研究辣椒的起源提供了依据，为辣椒育种中奠定了良好的理论基础。

4 结 论

研究从辣椒基因组中成功利用简并引物克隆了Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列。经过生物信息学对其分析显示，逆转录酶序列都具有拷贝数密集和异质性的特点，主要是由于终止子突变与移码突变所致。根据进化树分析可知，与荸荠，潘娜利番茄等植物具有很近的遗传距离，这种相似性与植物学分类结果相吻合，可能是反转录转座子横向传递的结果。

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Fund project:Supported by the special funds for public welfare industry in China (agriculture) (201303115), staple vegetable industry technology system project of the Experiment Station in Urumqi (CARS-25-G-51) and science and technology achievements transformation project of Xinjiang Uygur Autonomous Region (201554114)

Cloning and Analysis of Reverse Trancriptase of Ty3-gypsyRetrotransposons in Pepper (CapsicumannuumL.)

LI Ning, YANG Sheng-bao, YANG Tao, WANG Bai-ke, TANG Ya-ping,WANG Qiang, Patiguli·Asimutola, YU Qing-hui

(ResearchInstituteofHorticulturalCrops,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 To clone Reverse Transcriptase of Ty3-gypsyRetrotransposons in pepper (CapsicumannuumL.)genome and analyze its characteristics and evolution of family relationships.【Method】According to the conserved regions of Ty3-gypsyreverse transcription and reverse transcription enzyme, degenerate primers were designed. The sequences were recovered, cloned and sequenced by PCR amplification, cloning and sequencing.【Result】The reverse transcriptase sequences were obtained from genome of pepper 14 reverse transcription. The sequences were about the size of 340 bp. Bioinformatics analysis showed that the sequence length varied from 310-345 bp, and homologies were in the range of 60.2%-99.1%. Phylogenetic tree analysis of different species based on reverse transcriptase sequences showed that IV, V series and Eleocharis quinqueflora, Solanum pennellii formed a large class, which might be the result of lateral transfer of the reverse transcriptase.【Conclusion】Pepper Ty3-gypsyretrotransposon reverse transcriptase sequence has universality, heterogeneity, etc., andEleocharisquinqueflora,Solanumpennelliiand other species of the same type of retrotransposons may have the same origin.

pepper; Ty3-gypsyclass retrotransposons; reverse transcriptase

2016-05-12

公益性行业(农业)科研专项项目(201303115)；大宗蔬菜产业技术体系乌鲁木齐试验站项目(CARS-25-G-51)；自治区农业科技成果转化项目(201554114)

李宁(1985-)，男，新疆人，助理研究员，硕士，研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术，(E-mail)liningbio@163.com

余庆辉(1970-)，男，广东人，研究员，博士，研究方向为加工番茄遗传育种与栽培，(E-mail)yuqinghui98@sina.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.12.002

S641.3；S188

：A

：1001-4330(2016)12-2166-09